張艷秋， 陶文銓， 李 卓

(同濟大學 環(huán)境科學與工程學院，上海 200092)

隨著微流體技術的快速發(fā)展，越來越多的研究人員采用微流體技術進行生物、化學分析等方面的研究[1-3]，并采用微閥門等新型技術，實現(xiàn)對流體流動過程的精確控制.已有大量研究采用PDMS制作微流體細胞培養(yǎng)系統(tǒng)[4-5]，通過對流動系統(tǒng)的簡單控制完成對傳輸過程中二氧化碳含量、剪切應力等條件的控制.但基于微流體芯片技術的生物和化學等方面的研究(如細胞培養(yǎng)、基因工程中的聚酶鏈反應等)，不僅需要準確控制流體的成分比，還需要精確的控制溫度.傳統(tǒng)的細胞培養(yǎng)箱需要將溫度控制在37 ℃，CO2濃度控制在5%并保證培養(yǎng)環(huán)境維持合適的pH.在對細胞進行生長情況監(jiān)控時，需要將培養(yǎng)皿從傳統(tǒng)恒溫箱中取出.顯然，用于培養(yǎng)細胞的傳統(tǒng)恒溫箱不適合與微流體芯片結合，無法對實驗進行實時監(jiān)測.比較簡單、直接的方法是將微流體系統(tǒng)直接放置在設定為37℃的加熱板上，進行哺乳類細胞的研究[5]，但該方法沒有實現(xiàn)整個實驗系統(tǒng)的集成化.科研人員[6-7]將銦-錫氧化物加熱片置于微流體系統(tǒng)中，實現(xiàn)了流動系統(tǒng)與溫度控制系統(tǒng)的結合，但沒能有效實現(xiàn)溫度的局部控制.因此，如何實現(xiàn)微流控細胞培養(yǎng)技術中溫度的準確控制測量成為許多應用研究中的技術難題.

本文設計開發(fā)一種用于細胞培養(yǎng)的新型微流體加熱器.采用PDMS制作微流體通道以實現(xiàn)對細胞和培養(yǎng)液輸入輸出的有效控制，并與Au/Cr微加熱系統(tǒng)集成.采用Rhodamine B和熱致變色液晶(thermochromic liquid crystal，TLC)方法校核該微型加熱器的溫度，并根據(jù)校核溫度將溫度控制在適合哺乳類細胞生存的溫度(37 ℃)，計算該溫度下所需工作功率.向該系統(tǒng)的微流體通道的不同單元接種不同密度的Hela細胞，連續(xù)培養(yǎng)3 d以上，實時監(jiān)控細胞生長情況，以驗證該裝置工作性能.

1 裝置設計加工

所設計的微流體加熱器由微流體系統(tǒng)及微加熱系統(tǒng)兩部分組成，因此需要分別對兩個系統(tǒng)進行設計加工，然后進行集成.

1.1 微流體系統(tǒng)的設計加工

PDMS具有價格低、光學透明度高、低毒性及生物相溶性好、透氧系數(shù)高、成型快等優(yōu)點[8-9]，是加工微流體系統(tǒng)的常用材料.選用PDMS材料制作微流體器件氣閥(V1-V9)，工作原理如文獻[8]所述.采用多層軟光刻技術制作細胞培養(yǎng)系統(tǒng)，該系統(tǒng)每個微室單元的樣品量可以控制在納升級別，系統(tǒng)采用6個雙層氣閥(V1—V6)構建9個(C1—C9)用于細胞培養(yǎng)的微室單元，使得各單元獨立工作，如圖1a所示.各腔室包括一個3層系統(tǒng)，包括培養(yǎng)細胞的中間層及被氣閥分隔開的氣體進出的兩層，如圖1b.氣閥V7—V9控制不同樣品的輸入，V1—V3和V4—V6分別控制9個腔室(C1—C9)的工作.例如，在V7—V9進口閥門開啟情況下，只打開閥門V1和V6，即可對腔室C1進行獨立操作(如細胞灌注或排出)，其他腔室不受影響；若關閉V1，只打開V2和V6，即可對腔室C2進行獨立操作，其他腔室不受影響，依次類推.當腔室控制閥門處于閉合狀態(tài)時，灌注樣品通過腔室上側的狹窄通道排出.通過自編Matlab程序控制6個氣體閥門的開關狀態(tài)，所用氣體壓力控制在50 kPa.流體通道的寬度為450 μm，平均高度為35 μm，因此寬高比為12.8，可以認為該流體通道是二維系統(tǒng).

a PDMS系統(tǒng)結構圖

b 腔室3層灌注培養(yǎng)系統(tǒng)的三維圖圖1 PDMS灌注系統(tǒng)圖Fig.1 Diagram of the PDMS perfusion system

根據(jù)剪切應力計算公式τ=6μQ/(h2w)[4]，本文流體通道的w=450 μm，h=35 μm，Q=0.3 ml·h-1，μ=1.01×10-3Pa·s，因此系統(tǒng)中的剪切應力為1 cm23.93達因，與Hela細胞培養(yǎng)的理想剪切應力1 cm24達因相一致[10].式中μ是流體粘度，單位為kg·m-1·s-1；Q是流量，單位為m3s-1；w和h分別為通道的寬度和高度，單位為m.

將藍色與紅色流體注入到微流體系統(tǒng)中以驗證該系統(tǒng)的每個單元的獨立工作性能.如圖2所示，通過氣閥的控制，藍色與紅色液體可以獨立地鎖定在各腔室中，無混合現(xiàn)象，表明系統(tǒng)各腔室具有較好的獨立工作性能，且無液體溢出腔室.由此可見，每個單元中，可根據(jù)實際需求控制細胞接種的密度.

圖2 向各通路注入染料后，各腔室工作情況圖

Fig.2Validationofeachchamberworkingindependently,identifiedbyinfusingdyedwater

1.2 微加熱平臺的設計加工

采用軟光刻技術對鍍有金-鉻 (Au-Cr)的玻璃片(厚度1 mm)進行微加工，其中金為30 nm，鉻為50 nm，得到如圖3所示的微型加熱器芯片.由于鉻的電阻率(ρCr=125 nΩ·m)遠大于金的電阻率(ρAu=22.14 nΩ·m)，因此在采用直流電加熱過程中，鉻用來產生焦耳熱，從而控制加熱面所需的溫度，金則對并聯(lián)的9個加熱單位起到導電連接作用，其產生的焦耳熱可以忽略不計.為使每個單元的熱量均勻分布，基于數(shù)值模擬技術以優(yōu)化加熱單元的幾何結構，如圖3中的放大部分.加熱芯片中的9個溫度控制單元的位置(圖3)要與微流體腔室的位置相匹配(圖1).

微加工具體步驟簡要介紹如下：首先采用正性光刻膠S1813對鍍金-烙玻璃片進行涂層，厚度為2 μm，經(jīng)過加熱、紫外光(UV)曝光，將所需要的幾何結構影印到玻璃片上，然后采用顯影劑MF319進行顯影，最后應用蝕刻溶液對金層進行蝕刻，采用丙酮對蝕刻后的金-烙玻璃片進行清洗，除去剩余的正性光刻膠，以獲得如圖3所示的灰色部分結構；第二步用正性光刻膠S1813重復第一步的工作，唯一不同的是此時要采用蝕刻溶液對鉻層進行蝕刻，得到如圖3中的深灰色部分.

圖3微型加熱片Au-Cr示意圖：共有9個獨立工作的供熱單元，每個單元的面積為600×600μm2

Fig.3Thenetworkofmicroheatersfabricatedonachromiumandgoldwafer,andazoomedheatingunitisinserted.

1.3 微流體加熱裝置的集成

在Au-Cr微加熱平臺外涂一薄層(20 μm)的紫外固化光學膠NOA81，將蝕刻的Au-Cr微加熱平臺與微流體裝置黏合到一起，并在紫外光下照射5 s，使NOA81固化，集成裝置的截面視圖和各部分的幾何參數(shù)(每一層的厚度)見圖4.基于熱沉技術，采用鋁制平臺作為加熱系統(tǒng)的散熱器.為減小加熱片與熱沉平臺間的熱阻，采用高導熱劑將微流體系統(tǒng)與微加熱平臺黏結起來得到集成的微流體加熱裝置，如圖5所示.

圖4 加熱系統(tǒng)的橫剖面圖，以其中一個加熱單元為例Fig.4 The boundary conditions of the integrated system

2 工作功率測定

所開發(fā)微流體加熱器的最終目的是為哺乳類細胞生存提供穩(wěn)定的環(huán)境溫度(37 ℃)，因此需要確定每個腔體單元為37 ℃時所需的供電功率.首先進行微加熱器系統(tǒng)溫度標定，常用的微流體器件的溫度場標定方法有Rhodamine B熒光染料法[11]及熱致變色液晶(TLC)法[12].

圖5實驗過程中的微型加熱器系統(tǒng)，其中熱沉部位采用高導熱系數(shù)的鋁制平臺

Fig.5Photographoftheexperimentaldevice,includingthealuminiumplatformasaheatsinker

2.1 采用Rhodamine B進行溫度標定及功率計算

首先，在碳酸鹽溶液中進行Rhodamine B溶液的配備，濃度為0.1 mM.為避免外界光對溶液的漂白影響，將配置好的溶液放在暗處存放.實驗過程中所用的熒光采集系統(tǒng)包括水銀燈、熒光顯微鏡(目鏡(20×))以及高分辨率照相機(EM-CCD,C9100-13).對于每個實驗測試點，連續(xù)采集30幀，采集頻率為32 f·min-1，空間分辨率為512像素×512像素.

為了準確地找出熒光強度隨溫度變化的函數(shù)關系，實驗分兩步進行.①采用高導熱劑將集成的微流體加熱裝置與珀爾帖熱循環(huán)儀的加熱平臺表面粘合.珀爾帖熱循環(huán)儀能夠快速、準確地實現(xiàn)對溫度的控制，通常用在生物學研究中的聚酶鏈反應實驗中.在實驗中，測試所用的溫度范圍從25 ℃開始，每次測試升溫5 ℃，直至60 ℃.實驗過程中采用注射器將Rhodamine B溶液注入到通道中.為防止光學漂白的影響，每個溫度點進行數(shù)據(jù)采集后，對通道內的溶液進行更新.②采用直流電源對如圖5所示的加熱器系統(tǒng)進行加熱.對于電阻(Rt)為常數(shù)的加熱片，通過調節(jié)直流電壓(U)以獲得不同的供熱功率(Pt=U2/Rt)，下標t表示加熱片的所有供熱單元，共9個.通過多次重復測量，整個系統(tǒng)的溫度測量偏差在±0.2 ℃，具有較好的準確性.

應用軟件ImageJ對采集的熒光強度圖像進行數(shù)據(jù)分析，確定量綱為1的熒光強度Δn(Δn=(n-n0)/n0，n0為背景熒光度)與溫度(T)的函數(shù)關系式，即T(Δn).對于每個加熱單元在不同功率(Ps=U2/Rs)下的熒光強度，表示為Ps(Δn)，其中下標s表示一個供熱單元.通過求解關聯(lián)式T(Δn)和Ps(Δn)，得到溫度與功率的函數(shù)關系式T(Ps)，即T(Ps)=5.1×10-6Ps3-2.0×10-4×Ps2+0.23Ps+23.63，見圖6.在實際應用中，根據(jù)此函數(shù)式，通過調節(jié)電源電壓從而改變供電功率，就可以得到實驗中所需的溫度值，而且所需功率低至毫瓦 (mW) 級.一個加熱片共有9個并聯(lián)的電阻，所用加熱片的總電阻為Rtotal=37 Ω，即每個加熱單元的電阻為Rsingle=333 Ω.當T=37 ℃時，每個單元所需的功率Ps=57 mW，則整個加熱片所需的供電總功率為Pt=9Ps=513 mW.如圖7所示，9個腔室的加熱區(qū)域熒光強度最高，熒光強度隨溫度降低而逐步減弱，結果表明加熱系統(tǒng)中9個加熱單元具有獨立工作的特性，從而實現(xiàn)了在微型加熱器上進行局部控制溫度的目標.

圖6 溫度與功率變化的函數(shù)關系Fig.6 Correlativity of the change of temperature and power

圖7 加熱器中溫度分布的全局圖Fig.7 Temperature distribution in microheater

2.2 采用熱致變色液晶進行溫度校核

采用TLC(SLN40/R20C20W)對加熱器的供熱功能進行溫度校核.該材料的工作范圍(顯色范圍)為20～40 ℃，超出該范圍顯示為無色(注：背景為黑色時顯示為黑色).在溫度達到19.2 ℃時出現(xiàn)可視光，當溫度達到19.9 ℃時，開始顯現(xiàn)紅色；溫度升到23.2 ℃，綠色開始顯現(xiàn)；溫度達到36.0 ℃時，開始顯現(xiàn)藍色.該材料的工作范圍符合本實驗中溫度校核要求.

由于產品本身已經(jīng)給出具體的色彩轉換的轉捩點，因此不需要采用珀爾帖熱循環(huán)儀進行材料性能的校核.將要測試的加熱片背面在不影響熱量傳遞的前提下處理成黑色背景，然后將該TLC材料混合后均勻地涂在加熱片的加熱面上，同時要避免該材料暴露在紫外光或高溫環(huán)境下.實驗中采用LED白色光源和高精度彩色照相機(PL-B625, CMOS)以頻率為7 f·s-1、空間分辨率為2592 像素×1944 像素進行數(shù)據(jù)采集，每個測量點連續(xù)采集30幀.通過調節(jié)直流電源，獲得不同供電功率下的R、G和B值.

同樣采用圖像分析軟件ImageJ對采集的色圖進行分析以獲得R、G和B值.當采用直流電源對加熱器供熱時，所得到的色彩值R、G和B隨著電壓值 (0.0 V≤U≤5.0 V)的變化結果見圖8.在室溫為24 ℃，U=0時，TLC呈現(xiàn)綠色，符合給定的材料性能；隨著電壓的增加，綠色值G逐漸降低，當電壓達到U=2.8 V時，藍色B值開始大于其他兩種顏色值，此時TLC呈現(xiàn)藍色，即加熱單元的表面溫度達到36 ℃.當電壓繼續(xù)增大到U=4.5 V時，TLC開始進入無色區(qū)域，即此時表面溫度已經(jīng)到達40 ℃.

圖8采用加熱器系統(tǒng)(0≤U≤5.0V)得到的TLC(SLN40/R20C20W)色彩值隨溫度變化結果

Fig.8Temperaturecalibrationofcrystalslurry(SLN40/R20C20W)coatedonthemicroheaterwaferwithaDCpowersupplyrangingwithin0～5.0V

本文實驗目的是找到T=37 ℃時所需的供電功率，通過對在2.8 V≤U≤4.5 V范圍內的實驗數(shù)據(jù)進行擬合，找出T=37 ℃時相應的電壓值U=2.9 V.加熱片中每個加熱單元的電阻Rsingle=333 Ω，對應的功率P=25.3 mW.因此整個加熱片所需要的總功率為Ptotal=U2/Rtotal=212.4 mW.

可以看出，對于相同的加熱單元，采用Rhodamine B和TLC測量得出的所需電功率結果存在差異.Rhodamine B的結果顯示在溫度達到37 ℃時，一個加熱單元所需的電功率為57 mW，而TLC的標定結果為25.3 mW.分析認為由于采用PDMS制作微流體通道，該材料的多孔性會產生滲透壓，使得Rhodamine B溶液不斷被吸入壁面中，造成熒光物質的不斷累積從而造成實驗結果的偏差.因此，通過兩種實驗方法的比較，采用TLC的實驗結果作為細胞研究實驗參照依據(jù).

3 基于細胞培養(yǎng)的性能測試

以Hela細胞作為培養(yǎng)對象，測試所研發(fā)的微加熱系統(tǒng)的可靠性.

3.1 細胞灌注培養(yǎng)

實驗操作步驟如下：

(1)PDMS系統(tǒng)的預飽和處理：高溫環(huán)境下的水蒸汽或清洗過程中攜入的乙醇會影響PDMS的清晰度及滲透性等性能，對細胞培養(yǎng)造成不利影響[13]，因此需要對系統(tǒng)進行預飽和處理.使用Fluigent MFCS泵連續(xù)向PDMS中泵入去離子水，將流體通道內的空氣趕出，并在實驗前使PDMS系統(tǒng)達到飽和狀態(tài).實驗中選用內徑為127 μm的PEEK1535管進行灌注.

(2)消毒：對每一個培養(yǎng)基底進行消毒，首先在紫外光下進行30 s表面等離子處理，然后分別使用70%的乙醇及去離子水進行30 min以上的清洗處理.

(3)纖連蛋白涂層：在系統(tǒng)中注入纖連蛋白(以磷酸鹽緩沖液(PBS)配制，濃度為50 μg·mL-1)，以促進細胞附著.然后將所有閥門關閉，注入PBS溶液對9個腔室外的纖連蛋白進行清洗.將裝置在室溫下放置1 h，然后將所有閥門打開，并使用PBS對系統(tǒng)進行沖洗.

(4)細胞準備：準備2 mL平均濃度為每mL 2×106個細胞的細胞懸液，同時準備一定量含約15 mL HEPES(簡稱MCH)的培養(yǎng)基，并以小于0.3 mL·h-1的流量連續(xù)4 d進行灌注.用MCH進行系統(tǒng)沖洗，并保證系統(tǒng)內無氣泡產生.

(5)細胞接種：采用注射器注射法，在低流速下進行細胞接種，達到目標接種密度后，關閉閥門.接種完成后，對通路或旁路內多余細胞進行快速清洗，保證細胞只接種在9個腔室內.在37 ℃條件下，細胞經(jīng)過6 h沉降及伸展后，打開所有閥門，使用Fluigent MFCS泵以0.3 mL·h-1的流速用CO2獨立裝置進行連續(xù)灌注.由于PDMS具有氣體滲透性，因此由空氣擴散入腔室內的氧氣對細胞培養(yǎng)是足夠的，無需額外補充操作.

(6)細胞生長監(jiān)控：對細胞進行連續(xù)3 d培養(yǎng)，注入臺盼藍溶液進行細胞標定，并利用相差顯微鏡進行細胞生長監(jiān)控.

3.2 細胞培養(yǎng)結果

在裝置兩個腔室內，接種不同密度的Hela細胞，利用相差顯微鏡詳細給出微流體通道內細胞培養(yǎng)結果(圖9).如果細胞是圓形可以判斷已經(jīng)死亡，如果細胞以各種形狀呈分散狀態(tài)，表明細胞存活.圖9a分別為將細胞懸液通入腔室C1、C6(如圖1a標注)后的照片，細胞呈懸浮未貼壁狀態(tài)；圖9b是在微流體加熱系統(tǒng)中培養(yǎng)24 h后的細胞照片，可以看出細胞數(shù)量沒有太大變化，但絕大部分細胞已經(jīng)貼壁并鋪展開來；圖9c是培養(yǎng)48 h后細胞照片，可以看出細胞數(shù)量有明顯增加，分布均勻并以各種形狀呈分散狀態(tài)；培養(yǎng)72 h后的細胞照片(圖9d)可以看出細胞繼續(xù)在通道內生長，并以各種形態(tài)擠滿了整個腔室.

a 接種后

b t=24 h

c t=48 h

d t=72 h圖9 不同時間內，腔室C1和C6中細胞生長狀況Fig.9 Cells growth in chambers C1 and C6 withdifferent seeding densities in 72 h

選擇腔室C6注入臺盼藍溶液進行死亡細胞標定，并采用ImageJ軟件對細胞數(shù)目進行統(tǒng)計，細胞生長曲線見圖10，可以看出24 h內細胞數(shù)量無明顯增加，這是由于細胞需要時間進行貼壁鋪展及生長.在24～72 h內，細胞數(shù)目不斷增多.細胞生長實時監(jiān)控結果可以看出所培養(yǎng)細胞生長良好，在生長特征及形態(tài)方面與在傳統(tǒng)血管組織培養(yǎng)中的細胞無明顯區(qū)別，表明該微加熱系統(tǒng)具有可以為細胞培養(yǎng)提供穩(wěn)定的溫度環(huán)境的良好工作性能.

圖10 腔室C6內連續(xù)培養(yǎng)3 d細胞生長曲線

Fig.10EvolutioncurveofcellgrowthinchambersC6from3dexperiment

4 結論

針對在實時監(jiān)控細胞生長過程中較難維持細胞生長所需溫度等條件的問題，本文通過采用微加工技術，完成一種新型微流體加熱器的設計和加工，由微流體輸入輸出系統(tǒng)及溫度控制平臺兩部分集成.所設計加熱系統(tǒng)與傳統(tǒng)的恒溫箱相比，具有體積微小、易于與流動芯片集成、易于實時觀測等優(yōu)點，且可以同時獨立完成多個測試單元的實驗工作.采用Rhodamine B和TLC材料對微流體加熱器的溫度進行標定及校核，并計算得到維持系統(tǒng)37 ℃時所需的工作功率為212.4 mW.為微加熱系統(tǒng)提供穩(wěn)定的工作功率，將Hela細胞接種入微流體加熱系統(tǒng)，連續(xù)培養(yǎng)3 d，結果表明該系統(tǒng)所培養(yǎng)細胞在生長特征及形態(tài)方面與在傳統(tǒng)血管組織培養(yǎng)中的細胞無明顯區(qū)別，說明所設計微流體加熱器可以為細胞培養(yǎng)提供穩(wěn)定的溫度環(huán)境，具有較好的實用性能.該微加熱系統(tǒng)在生物及化學研究方面具有較大的應用潛力，

進一步的研究還在繼續(xù)中.

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