趙英政，彭強，閆婷婷，張旭旭，翟曉楠，吳衛(wèi)東，易憲文，徐光翠

(新鄉(xiāng)醫(yī)學院公共衛(wèi)生學院，河南 新鄉(xiāng) 453003)

Leprdb/db小鼠是研究肥胖、糖尿病等疾病常用的動物模型，其具有高血糖、高血脂、胰島素抵抗等特性[1]。與采用化學藥物刺激建立的糖尿病模型相比，其發(fā)病與人2型糖尿病發(fā)病過程更為相似[2-3]。其發(fā)病機制是Leprdb/db小鼠的瘦素受體(leptin receptor，LR)基因胞內外顯子區(qū)發(fā)生一個G-T的點突變，而造成瘦素受體變短失功能，不能將信號傳至胞內[4]。由于純合Leprdb/db小鼠不育，需通過雜合子交配進行繁殖。本研究采用TaqMan熒光定量探針技術，在常規(guī)PCR的基礎上加入熒光標記探針來對雜合子Leprdb/+小鼠子代進行早期、快速基因分型。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

SPF級Leprdb/+動物購自Jackson實驗室(北卡羅來納大學易憲文教授贈送)，于IVC 動物房常規(guī)飼養(yǎng)【SYXK(豫) 2014-0005】，飼養(yǎng)期間給予SPF級嚙齒類動物標準顆粒飼料(上海斯萊康提供)；室溫20～22℃，明暗周期12 h/12 h，相對濕度60%～70%。按實驗動物使用的3R原則給予人道關懷，自由攝食、進水。

1.1.2 試劑與儀器

TRIS購自北京索萊寶，NaOH購自天津德恩，HCL購自鄭州派尼，EDTA購自Sigma公司，Hot Start Fluorescent PCR Core Kit 購自上海生工；熒光定量PCR儀(羅氏Light Cycler 480)。

1.2 方法

1.2.1 小鼠DNA提取

將8周齡Leprdb/+小鼠按雌雄比為1∶1進行合籠。參考Truett GE的方法[5]，取待鑒定子代小鼠約0.5 mm鼠尾放入PCR管中，在提取DNA前一直低溫保存。加入75 μL堿性溶液(25 mmol/L NaOH, 0.2 mmol/L EDTA，pH 12)；將PCR管放入金屬恒溫氣浴器中，95℃，30 min，冷卻至室溫后加入75 μL中和液(40 mmol/L TRIS-HCl，pH 5)，震蕩混勻；取2 μL混合液用于PCR反應。

1.2.2 探針和引物的設計

從NCBI SNP 數(shù)據(jù)庫網(wǎng)站(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/snp/)獲得Lepr基因序列及待測SNP 位點信息(基因序列號rs1801133)。用Premier 6.0軟件設計常規(guī)PCR 擴增引物，采用Primer Express 3.0 設計TaqMan探針和引物。TaqMan探針分別采用FAM 和HEX 熒光素進行標記。樣本為等位基因1(GG)純合子時，PCR 擴增過程中僅能檢測到FAM 熒光，為藍色熒光；樣本為等位基因2(TT)的純合子時，PCR 擴增過程中僅能檢測到HEX 熒光，為綠色熒光；樣本為雜合子(GT)時，PCR 擴增過程中可同時檢測到FAM 和HEX 兩種熒光，表現(xiàn)為紅色熒光。探針和引物由上海生工生物技術有限公司合成。上游引物為5′ -ACC AAC TTC CCA ACA GTC CA-3′，下游引物為5′-TGA TGC CCT GAA AAT CAA GC-3′；野生型探針為HEX-5′-TTT GAT GGA GGGAAA CAA ACC TA-BHQ-X-3′，突變型探針為FAM-5′-TTT TGA TGG AGGTAA ACA AAC CTA A -BHQ-X-3′。

1.2.3 PCR反應體系及反應條件

使用TaqMan探針的20 μL反應體系中基因組DNA 2 μL (60 ng)，上下游引物各0.5 μL (0.25 μmol/L)，TaqMan探針0.8 μL (0.25 μmol/L)，2× Hotstart Fluo-PCR mix (ABI 公司) 10 μL，雙蒸水6.2 μL。完成上述步驟后，把加好樣品的384孔板放在LightCycler 480 Software Setup (Roche 羅氏)熒光定量PCR儀進行反應。PCR 擴增循環(huán)條件：95℃ 4 min，其后的40 個循環(huán)為95℃ 15 s、40℃ 60 s， 40℃ 1 min 復性和延伸時收集熒光信號。PCR 擴增完成儀器終點讀板讀取數(shù)據(jù)，SDS 軟件自動進行基因分型。

2 結果

2.1 Leprdb/+小鼠子代分型情況及基因頻率Hardy-Weinberg平衡檢驗

共采集樣本228例，采用TaqMan探針熒光定量PCR 技術終板讀數(shù)結果見圖1。結果在228份樣品中Leprdb/db41例，基因型頻率為0.1929；Leprdb/+123例，基因型頻率為0.5395；Lepr+/+64例，基因型頻率為0.2807。經(jīng)HW (Hardy-Weinberg)平衡檢驗，計算χ2值為5.42，P值大于0.05，符合HW群體遺傳平衡法則。G等位基因頻率為0.5504，T等位基因頻率為0.4496，經(jīng)Hardy-Weinberg平衡檢驗，計算χ2值為2.32，P值大于0.05，符合HW群體遺傳平衡法則。

2.2 TaqMan探針熒光定量PCR反應終點熒光檢測結果

采用TaqMan 探針實時熒光分型法獲得明確的分型結果。rs1801133 位點基因型檢測結果如下：藍色熒光樣本為等位基因1(GG)純合子；綠色熒光樣本為等位基因2(TT)的純合子，紅色熒光樣本為等位基因3(GT)雜合子(見圖1)。

注：橫坐標：FAM信號強度值；縱坐標：VIC信號強度值；藍色點：Allele X 純合子；綠色點：Allele Y 純合子；紅色點：雜合子。圖1 TaqMan探針熒光定量PCR反應終點熒光散點圖Note. Abscissa: FAM signal intensity value. Ordinate: VIC signal intensity value. Blue dot: Allele X homozygote. Green dot: Allele Y homozygote. Red dot: heterozygote.Fig.1 TaqMan fluorescence quantitative PCR reaction end point fluorescence scatter plot

2.3 TaqMan探針法Leprdb/+小鼠子代分型結果與小鼠肥胖表現(xiàn)型判斷結果

比較Leprdb/db純合子小鼠在2個月時表現(xiàn)為肥胖，可通過表現(xiàn)型進行判斷基因型(見圖2)。與TaqMan探針法分型Leprdb/d b小鼠結果進行比較分析，結果見表1。根據(jù)計算公式，靈敏度=真陽性數(shù)/(真陽性數(shù) + 假陰性數(shù))×100%，特異度=真陰性數(shù)/(真陰性數(shù) + 假陽性數(shù))×100%，Taqman探針法分型Leprdb/db小鼠靈敏度為97.56%，特異度為99.47%。

圖2 2月齡Leprdb/db肥胖小鼠和Leprdb/+瘦小鼠肥胖表現(xiàn)型比較Fig.2 Comparison of obesity phenotype between a 2-month sold Leprdb/db obese mouse and Leprdb/+ lean mouse

肥胖ObesityTaqman探針法GenotypingusingTaqManprobe陽性(+)陰性(-)總計Total陽性(+)40141陰性(-)1186187總計Total41187228

3 討論

培育和建立疾病動物模型是深入研究疾病發(fā)生發(fā)展機制的重要基礎，通過對模型動物的研究有助于認識疾病發(fā)生發(fā)展規(guī)律以及進行干預效果評價[6]。瘦素受體缺陷的Leprdb/db小鼠模型具有糖脂代謝紊亂的特性，有助于研究肥胖、糖尿病等疾病，是國內外常用疾病動物模型之一。純合Leprdb/db小鼠的瘦素受體基因發(fā)生了單位點的突變，因此，可借助與新發(fā)展的單核苷酸多態(tài)性(SNP)技術對其進行基因分型。

TaqMan探針熒光PCR技術是一種通過檢測PCR 過程中及結束后產(chǎn)生的熒光信號，來區(qū)分等位基因類型的SNP 檢測技術[7]。TaqMan技術進行基因分型的原理是在熒光探針的兩端分別標記有不同的熒光基團和熒光淬滅基團，在反應進行過程中，探針特異的在兩條引物之間的位置與模板特異性結合，不能在其他位置結合。如果探針完整，熒光基團所發(fā)出的熒光能量可以被熒光淬滅基團所吸收，儀器就不能檢測到熒光信號。當探針和模板結合后，熒光基團游離出來，產(chǎn)生熒光信號而被儀器所檢測到。不同的目的基因片段位點的堿基不同，所呈現(xiàn)的熒光也不一樣。

本研究成功建立了對Lepr基因SNP 位點(rs1801133)的TaqMan探針熒光定量PCR 技術分型方法。PCR反應終點熒光散點圖結果表明三種基因型區(qū)別明顯，未見無法識別樣本。經(jīng)Hardy-Weinberg (HW)平衡檢驗和動物表現(xiàn)型比較分析表明，TaqMan探針熒光PCR 法用于Leprdb/db基因SNP 分型結果準確、可靠，具有較高的敏感度和特異度。此方法為培育Leprdb/db模型動物提供快速的方法和手段。傳統(tǒng)對Leprdb/db模型動物野生型和突變型等位基因的分型方法主要是用聚合酶鏈反應限制性內切酶片段長度多態(tài)性分析 (RFLP)，該方法需先完成對靶基因的擴增和鑒定，耗時長，操作步驟復雜，不利于方法的標準化[8]。隨著熒光定量PCR 儀的廣泛應用，TaqMan探針熒光PCR 技術操作便捷，可短時間內完成大量的樣品分析，并且成本低廉，滿足SNP 大規(guī)模樣本檢測的需求。該技術結合相應的軟件對產(chǎn)物進行分析，達到分析自動化，易于標準化。因此，該技術具有極為廣泛的應用前景。

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