賈振華，劉 方，宋 聰，黃亞麗，馬 宏 ，宋水山

(1.河北省科學(xué)院 生物研究所，河北 石家莊 050081；2.河北省主要農(nóng)作物病害微生物控制工程技術(shù)研究中心，河北 石家莊 050081)

hrp基因(hrp，Hypersensitive response and pathogenity gene)廣泛存在于革蘭氏陰性植物病原細(xì)菌中，能夠表達(dá)一種熱穩(wěn)定性Harpins蛋白，該蛋白不僅能夠促進植物的生長發(fā)育[1-2]，也會引起非寄主植物的過敏反應(yīng)(HR，Hypersensitive response)，Harpins蛋白能夠廣泛誘導(dǎo)植物對植物病蟲害的防衛(wèi)反應(yīng)，增強植物的免疫反應(yīng)[3-7]。研究表明，植物病原菌主要通過Ⅲ型分泌通路將Harpin蛋白分泌到植物細(xì)菌細(xì)胞外，能夠激發(fā)非寄主植物的HR或誘導(dǎo)植物對病原菌產(chǎn)生抗病性[8-11]。因而，開發(fā)新型Harpin蛋白和研究Harpin誘導(dǎo)防衛(wèi)機制已成為新研究熱點。自1986 年Lindgren等[12]首次報道hrp基因以來，人們對hrp基因進行了廣泛的研究。HarpinEa是一種從梨火疫歐文氏桿菌(Erwiniaamylovora)中分離到的Harpin蛋白，它能夠誘發(fā)煙草HR反應(yīng)[12-13]。1995年Cui等[14-15]借助分子生物學(xué)手段首次從胡蘿卜軟腐歐文氏菌(E.carotovorasubsp.carotovora)Ecc71中分離到hrpN基因并克隆該基因。國內(nèi)科研人員越來越多地研究Harpin蛋白和hrp基因，其中對來源于胡蘿卜軟腐歐文氏菌的Harpin蛋白的研究有了很大的進展，對其表達(dá)hrp基因克隆的研究也有了很大的突破，科研人員分別從E.carotovorasubsp.carotovoraCSSY002、carotovoraCSDS001以及betavasculorumCSL101等菌株中克隆到不同基因序列的hrp基因，這些hrp基因均能表達(dá)氨基酸序列不同程度差異的Harpin蛋白，但這幾種Harpin蛋白均能誘導(dǎo)煙草過敏反應(yīng)。攜帶hrp基因的不同植物病原菌攜帶的hrp基因具有一定的保守性，但也存在著很大的差異性，而其表達(dá)的Harpin蛋白對誘導(dǎo)不同的植物產(chǎn)生抗性也不同。本研究主要報道高致病性病原菌胡蘿卜軟腐歐文氏 (E.carotovorapv.carotovora) Ecc36菌株的胞外酶活性，對其致病性進行了鑒定，克隆了Ecc36菌株中的hrpNEccPR基因，并進行了篩選和測序，通過構(gòu)建的pET30a-EccPR質(zhì)粒在大腸桿菌工程菌株BL21(DE3)中高效IPTG誘導(dǎo)表達(dá)HrpNEccPR蛋白，鑒定產(chǎn)物HrpNEccPR蛋白的生物學(xué)活性。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

Ecc36菌株由河北省科學(xué)院生物研究所生物工程實驗室收藏；大腸桿菌工程菌株BL21(DE3) (大連寶生物工程有限公司)；pET28a(+)質(zhì)粒(大連寶生物工程有限公司)；LB培養(yǎng)基利用文獻[9-10]中的方法進行配制；抗性培養(yǎng)基為LB培養(yǎng)基中加入50 μg/mL卡那霉素(Km)。提取試劑盒(大連寶生物工程有限公司)；DNA 純化試劑盒(Qiagen公司)；DNA標(biāo)記系統(tǒng)(Promega公司)。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌株Ecc36 胞外酶的檢測 參考文獻[15-16]配制菌株Ecc36胞外酶的瓊脂固體平板培養(yǎng)基，利用文獻[17]中的方法檢測Ecc36菌株分泌的多聚半乳糖醛酸酶(Polygalacturonase，Peh)、蛋白酶(Protease，Prt)、纖維素酶(Cellulase，Cel)及果膠酶(Pectate lyase，Pel)活性。通過平板上菌落周圍的透明圈大小分析酶活性水平。

1.2.2 菌株Ecc36 對植物的致病性 挑取Ecc36菌株單菌落，培養(yǎng)24 h后，用無菌水將菌體稀釋成5×109cfu/mL的菌懸液，利用懸浮液接種于大白菜，每個孔接種0.05 mL，28 ℃保濕培養(yǎng)，48 h后根據(jù)大白菜軟腐程度判斷菌株致病情況。

1.2.3 菌株Ecc36 過敏反應(yīng)測試 將菌株Ecc36單菌落接種到LB 液體培養(yǎng)基，將菌株28 ℃培養(yǎng)24 h后，用無菌10 mmol/L氯化鎂溶液稀釋成2×108cfu/mL菌懸液，采用0.3 mL菌懸液注射到煙草葉片的方法來檢測Ecc36過敏反應(yīng)活性，用無菌10 mmol/L氯化鎂溶液作為對照。接種24 h后，觀察煙草葉片是否出現(xiàn)壞死斑現(xiàn)象。

1.2.4hrpNEccPR基因的鑒定 利用Southern雜交方法鑒定hrpNEccPR基因，用EcoRⅠ消化Ecc36菌株染色體DNA，以地高辛標(biāo)記的Ecc36菌株hrpNDNA為探針進行Southern雜交。雜交條件見參考文獻[18]。

1.2.5 攜帶hrpNEccPR工程菌的構(gòu)建 參考hrpNEcc71基因，合成文獻[19]中報道的hrpNEcc71上下游引物，進行PCR 擴增，反應(yīng)條件如下：95 ℃ 5 min；95 ℃ 1 min，58 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min，循環(huán)25次。將純化的PCR產(chǎn)物，經(jīng)內(nèi)切酶BamHⅠ和Hind Ⅲ進行酶切構(gòu)建到質(zhì)粒載體pET30(+)上，形成了pET30a-EccPR表達(dá)質(zhì)粒。基因測序由上海生工完成，根據(jù)測序結(jié)果，hrpNEccPR基因進行分析?；驍U增和克隆方法見文獻[20-22]。將質(zhì)粒pET30a-EccPR轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)，構(gòu)建高效表達(dá)的大腸桿菌工程菌。

1.2.6 HrpNEccPR的誘導(dǎo)表達(dá)及檢測 將工程菌BL21(DE3)在卡那霉素抗性的LB液體培養(yǎng)基中37 ℃培養(yǎng)，當(dāng)培養(yǎng)菌液的OD600=0.6～0.8時，加入終濃度為0.8 mmol/L的 IPTG進行誘導(dǎo)培養(yǎng)，8 h后，離心收集菌體，4倍體積的緩沖溶液重懸，煮沸10 min，收集上清液。

HrpNEccPR蛋白的12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE) 檢測方法參照文獻[23]。

1.2.7 HrpNEccPR的活性檢測 利用HrpNEccPR蛋白分別配制濃度為100，50，25 μg/mL蛋白水溶液，分別接種到煙草葉片，24 h后檢查HR枯斑，水為對照。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株Ecc36 的致病性及其過敏反應(yīng)

菌株Ecc36 是一種軟腐病致病菌株，其致病性由植物細(xì)胞壁降解酶類(Plant cellwall-degrading enzymes，PCWDEs) 決定[24-25]，這些酶類分別為果膠酶(Pel)、多聚半乳糖醛酸酶(Peh)、蛋白酶(Prt)和纖維素酶(Cel)。胞外酶檢測結(jié)果顯示，Ecc36菌株能分泌Pel、Peh、Prt、Cel，且這4種酶具有較高活性(圖1)。將Ecc36菌株接種于大白菜并溫育48 h，大白菜出現(xiàn)明顯的軟腐病斑塊，而對照(CK)不產(chǎn)生軟腐病癥(圖2)，說明Ecc36菌株具有較強致病性，也推斷出Ecc36菌株高致病性可能與胞外酶的活性有關(guān)系。為了檢測Ecc36菌株過敏反應(yīng)癥狀，將Ecc36菌株接種于煙草葉片，以MgCl2為陰性對照，試驗結(jié)果表明，Ecc36菌株培養(yǎng)液及上清液均能引起煙草的過敏反應(yīng)(圖3)，說明Ecc36菌株分泌物中含有Harpin蛋白或者相似的物質(zhì)。

圖1 Ecc36菌株分泌的胞外酶Fig.1 Extracellular enzymes produced by Ecc36

圖2 Ecc36菌株引起大白菜軟腐Fig.2 Soft rot caused by Ecc36 in chinese cabbage tissue

2.2 hrpNEccPR 基因的鑒定及克隆

成地高辛標(biāo)記的hrpN基因核苷酸序列探針，建立Ecc36基因文庫，通過菌落原位雜交技術(shù)，對Ecc36基因文庫進行篩選。圖4顯示，從該文庫中篩選出3個陽性克隆菌，分別為34號、63號和89號克隆菌斑。通過EcoRⅠ消化的89號菌斑(Ecc36-89)染色體DNA、Ecc71 DNA和大腸桿菌BL21 DNA，進行Southern雜交，試驗結(jié)果顯示，Ecc71具有陽性雜交帶片段，Ecc36-89也出現(xiàn)了陽性雜交帶片段，而陰性對照大腸桿菌BL21染色體DNA沒有出現(xiàn)陽性克隆雜交帶(圖5)。結(jié)果表明，Ecc36基因組中含有hrpN基因。

A.MgCl2溶液；B.Ecc36培養(yǎng)液；C.Ecc36培養(yǎng)液上清液。A. MgCl2 solution；B. Culture solution with Ecc36；C. Supernatant of Ecc36 culture solution.

圖4 原位雜交結(jié)果Fig.4 In situ hybridization

圖5 hrpN基因Southern 雜交Fig.5 Southern Blot analysis of hrpN gene

2.3 hrpNEccPR 基因的核苷酸序列及HrpNEccPR 蛋白的氨基酸序列

將Ecc36-89基因組中克隆的hrpN基因命名為hrpNEccPR基因，hrpNEccPR基因測序結(jié)果表明，其編碼開放閱讀框(ORF)為1 254個核苷酸(圖6)，與來自其他hrpNEch、hrpNEcc編碼基因相比分別具有87.8%和86.6%的序列同源性。

hrpNEccPR基因編碼的蛋白HrpNEccPR由417個氨基酸殘基組成，理論分子量45.27 ku，理論等電點5.73，序列中富含甘氨酸(G)。Ecc36 與其他幾個菌株來源的hrpN編碼氨基酸序列(HrpNEch、HrpNEcc)同源性較高，通過和其他hrpN基因編碼的蛋白序列相比較，同源性達(dá)到43%(圖7)，而且C末端和N末端的同源性非常高，推測是其功能區(qū)域。這也和hrpN基因編碼的蛋白功能一致，說明了生物的遺傳多樣性。

圖6 hrpNEccPR基因序列Fig.6 HrpNEccPR gene sequence

圖7 HrpNEccPR蛋白序列Fig.7 hrpNEccPR protein sequence

2.4 攜帶hrpNEccPR 基因的工程菌誘導(dǎo)表達(dá)

將hrpNEccPR基因構(gòu)建在pET30a，命名為pET30a-EccPR，并轉(zhuǎn)入BL21(DE3)中，獲得大腸桿菌工程菌BL21(pET30a-EccPR)，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)工程菌BL21(pET30a-EccPR)，SDS-PAGE(濃度為12%)蛋白電泳結(jié)果顯示(圖8) ，含有空載體質(zhì)粒的BL21(DE3)大腸桿菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后不產(chǎn)生目的蛋白條帶，工程菌BL21(pET30a-EccPR)經(jīng)IPTG誘導(dǎo)能夠產(chǎn)生目的條帶，不經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，也不會產(chǎn)生HrpNEccPR蛋白目的條帶。這些結(jié)果表明，工程菌在IPTG誘導(dǎo)下能夠表達(dá)HrpNEccPR蛋白。

2.5 HrpNEccPR 蛋白誘導(dǎo)過敏反應(yīng)

植物過敏反應(yīng)已經(jīng)成為檢測一種蛋白或者小分子化合物具備Harpin類蛋白條件的一種重要生物測試方法，為檢測HrpNEccPR蛋白的生物學(xué)活性，將純化的HrpNEccPR蛋白(圖8)接菌于煙草葉片，結(jié)果顯示，純化的HrpNEccPR蛋白能誘導(dǎo)煙草葉片產(chǎn)生過敏反應(yīng)(圖9)，這與已報道的其他Harpin類蛋白的生物學(xué)活性一致，也說明HrpNEccPR蛋白是Harpin類蛋白的一種。試驗結(jié)果也顯示，HrpNEccPR蛋白誘發(fā)的植物過敏反應(yīng)斑塊大小與其濃度有關(guān)，隨著HrpNEccPR蛋白濃度的增加，過敏反應(yīng)病斑隨之?dāng)U大，50 μg/mL的HrpNEccPR蛋白即能顯著誘導(dǎo)過敏反應(yīng)，而對照處理不引起過敏反應(yīng)。

M.Marker； 1.BL21(DE3)/ pET-28a(+) + IPTG ； 2.BL21(DE3)/ pET30a-EccPR；3.BL21(DE3)/ pET30a-EccPR+IPTG ； 4.提純的HrpNEccPR蛋白。

M.Marker； 1.BL21(DE3) carrying pET28a(+) + IPTG； 2.BL21(DE3) carrying pET30a-EccPR，no IPTG； 3.BL21(DE3) carryingpET30a-EccPR+IPTG； 4.Purified HrpNEccPR.

圖8HrpNEccPR蛋白在工程菌中的IPTG誘導(dǎo)表達(dá)
Fig.8ExpressionofHrpNEccPRinducedbyIPTGinengineeringstrain

A.水；B.HrpNEccPR 50 μg/mL； C.HrpNEccPR 200 μg/mL；D. HrpNEccPR 100 μg/mL。A.H2O； B.HrpNEccPR 50 μg/mL； C.HrpNEccPR200 μg/mL； D.HrpNEccPR 100 μg/mL.

3 討論與結(jié)論

Harpin蛋白是一類這些年來一直被關(guān)注的重要生物效應(yīng)分子，Cui等[17]通過胡蘿卜軟腐歐文氏菌胡蘿卜亞種Ecc71研究發(fā)現(xiàn)了由hrp基因編碼的Harpin 蛋白，該蛋白是引發(fā)非寄主植物過敏性反應(yīng)的重要因子，試驗也證明，該蛋白能夠誘導(dǎo)煙草葉片產(chǎn)生過敏反應(yīng)，因而，hrp基因的遺傳組成、表達(dá)調(diào)控及產(chǎn)物、功能已成為研究該領(lǐng)域的重點內(nèi)容。通過對植物細(xì)胞壁降解酶類檢測和分析，發(fā)現(xiàn)胡蘿卜軟腐歐文氏Ecc36菌株具有很強的胞外酶分泌活性，能夠降解植物細(xì)胞壁[26]，也是Ecc36的關(guān)鍵致病因子。hrpNEccPR基因測序結(jié)果顯示，與其他幾種來源于胡蘿卜軟腐歐文氏菌的Harpin蛋白編碼基因序列具有很高的同源性，HrpNEccPR蛋白的氨基酸序列分析表明，其氨基酸序列與HrpNEcc蛋白、HrpNEch蛋白序列具有很高的同源性。而通過工程菌高效表達(dá)的HrpNEccPR蛋白仍具有Harpin蛋白的活性，能誘導(dǎo)植物產(chǎn)生HR反應(yīng)，這些結(jié)果表明，HrpNEccPR蛋白能夠提高植物本身的免疫機能，誘導(dǎo)植物對脅迫環(huán)境產(chǎn)生抗性。Harpin蛋白主要來源于革蘭氏陰性植物病原細(xì)菌，在梨火疫歐文氏桿菌和胡蘿卜軟腐歐文氏菌中也存在Harpin蛋白表達(dá)基因，張玨等[20]報道了HarpinCSDS001誘導(dǎo)植物抗性、促進植物生長發(fā)育的作用機制，曹茂林等[27]報道了胡蘿卜歐文氏菌CSSY002表達(dá)的Harpin蛋白生物學(xué)活性，Kariola等[28]報道，胡蘿卜軟腐歐文氏菌胡蘿卜亞種細(xì)菌產(chǎn)生的Harpin蛋白能夠誘導(dǎo)擬南芥的防衛(wèi)反應(yīng)。HrpNEccPR蛋白是胡蘿卜軟腐歐文氏菌Ecc36菌株表達(dá)的蛋白激發(fā)子，它能誘導(dǎo)植物產(chǎn)生免疫反應(yīng)，使植物發(fā)生過敏壞死反應(yīng)，筆者正在通過室內(nèi)和田間試驗研究HrpNEccPR蛋白的抗病性、抗蟲性、抗逆性、促進生長和發(fā)育等特性。希望通過這一系列的基礎(chǔ)和應(yīng)用研究，能將HrpNEccPR蛋白開發(fā)成新型、安全、高效的植物誘抗劑，使HrpNEccPR蛋白在未來的農(nóng)業(yè)高新生物技術(shù)領(lǐng)域中扮演重要角色。

利用煙草驗證了胡蘿卜軟腐歐文氏菌Ecc36菌株能夠引起過敏反應(yīng)(HR)，克隆了Ecc36菌株的hrpN基因(hrpNEccPR基因)的開放閱讀框，通過基因測序和比對，與其他軟腐歐文氏菌Harpin蛋白有較高的同源性，表明hrpNEccPR基因表達(dá)的蛋白具有Harpin蛋白特性。構(gòu)建hrpNEccPR基因表達(dá)載體(pET30a-EccPR)，并獲得表達(dá)HrpNEccPR蛋白大腸桿菌工程菌，誘導(dǎo)獲得的HrpNEccPR蛋白純化后，具有激發(fā)植物免疫反應(yīng)的生物活性。

參考文獻：

[1] 羅樹凱，梁虎軍，陳 婧，等. 3種植物生長調(diào)節(jié)劑、免疫誘抗劑對促進棉花生長的效果[J]. 中國棉花，2016，43(3)：24-26.

[2] Dong Y，Li P，Zhang C. Harpin Hpa1 promotes flower development inImpatiensandParochetusplants[J].Botanical Studies,2016,57:22.

[3] Tristan B，Sabrina S，Claude P，et al. The HrpN effector ofErwiniaamylovora，which is involved in type Ⅲ translocation，contributes directly or indirectly to callose elicitation on apple leaves[J]. Molecular Plant-Microbe Interactions，2011，24 (5)：577-584.

[4] Kong X，Li D. Hydrogen peroxide is not involved in HrpN fromErwiniaamylovora-induced hypersensitive cell death in maize leaves[J]. Plant Cell Reports，2011，30(7)：1273-1279.

[6] Zhang H J，Teng W J，Liang J A，et al. MADS1，a novel MADS-box protein，is involved in the response ofNicotianabenthamianato bacterial harpin(Xoo)[J]. Journal of Experimental Botany，2016，67(1)：131-141.

[7] Liu H，Wang Y，Zhou X，Wang C，et al. Overexpression of a harpin-encoding genepopWfromRalstoniasolanacearumprimed antioxidant defenses with enhanced drought tolerance in tobacco plants[J]. Plant Cell Rep，2016，35(6)：1333-1344.

[8] He S Y，Nomura K，Whittam T S. Type Ⅲ protein secretion mechanism in mammalian and plant pathogens[J]. Biochim Biophys Acta，2014，1694(1-3)：181-206.

[9] 王 歡，田沂民，董漢松. 水稻水通道蛋白OsPIP1；3與白葉枯病菌harpin蛋白Hpa1互作關(guān)系研究[J]. 植物生理學(xué)報，2016,52(8)：1223-1230.

[10] 李 芳，陳建明，陳忠其，等. 植物免疫誘抗劑對番茄灰霉病和早疫病的抑菌效果[J]. 農(nóng)藥，2016,55(3)：214-216.

[11] Aljaafri W A，Mcneece B T，Lawaju B R，et al. A harpin elicitor induces the expression of a coiled-coil nucleotide binding leucine rich repeat (CC-NB-LRR) defense signaling gene and others functioning during defense to parasitic nematodes[J]. Plant Physiology and Biochemistry，2017，121：161-175.

[12] Lindgren P B，Peet R C，Panopoulos N J. Gene cluster ofPseudomonassyringaepv.phaseolicolacontrols pathogenicity of bean plants and hypersensitivity on nonhost plants[J]. Journal of Bacteriology，1986，168(2)：512-522.

[13] Wei Z M，Laby R J，Zumoff C H，et al. Harpin，elicitor of hypersensitive response produced by the plant pathogen[J]. Erwinia amylovora Science，1992，257(5066)：85-88.

[14] Delaney T，Ukness S，Vernooij B，et al. A control role of salicylic acid in plant disease resistence[J]. Science，1994，266(5188)：1274-1250.

[15] Cui Y，Chatterjee A，Liu Y，et al. Identification of a global repressor gene，rsmA，ofErwiniacarotovorasubsp.carotovrathat controls extracellular enzymers，N-(3-Oxohexanoyl)-L-Homoserine lactone，and pathogenicity in Soft-RottingErwiniaspp. [J]. Journal of Bacteriology，1995，177(17)：5108-5115.

[16] Dimlioglu G，Das Z A，Bor M，et al. The impact of GABA in harpin-elicited biotic stress responses inNicotianatabaccum[J]. Journal of Plant Physiology，2015，188：51-57.

[17] Cui Y，Madi L，Mukherjee A，et al. The RsmA-mutants ofErwiniacarotovorasubsp.Carotovorastrain Ecc71 overexpresshrpNEccand elicit a hypersensitive reaction-like response in tobacco leaves[J]. Molecular Plant-Microbe Interaction，1996，9(7)：565-573.

[18] 周長發(fā)，張 銳，張 曉，等. 地高辛隨機引物法標(biāo)記探針的Southern雜交技術(shù)優(yōu)化[J]. 中國農(nóng)業(yè)科技導(dǎo)報，2009，11(4)：123-128.

[19] Cui Y，Mukherjee A，Dumenyo C K，et al. rsmC of the soft-rotting bacteriumErwiniacarotovorasubsp.carotovoranegatively controls extracellular enzyme and harpin(Ecc)production and virulence by modulating levels of regulatory RNA(rsmB)and RNA-binding protein(RsmA)[J].Journal Bacteriology，1999，181(19)：6042-6052.

[20] 張 玨，曹茂林，黃玉碧，等.HrpNCSDS001基因克隆及其表達(dá)產(chǎn)物誘導(dǎo)擬南芥基因表達(dá)譜變化的研究[J]. 遺傳，2007，29(5)：629-636.

[21] 薩姆布魯克J，拉塞爾 D W.分子克隆實驗指南[M]. 3版. 北京：科學(xué)出版社，2005.

[22] 林燕燕，陶宗婭，崔亞亞，等. EcbCSL101菌株hrpN基因的克隆、表達(dá)及HarpinEcbCSL101蛋白的生物學(xué)活性[J]. 微生物學(xué)通報，2008，35(6)：888-892.

[23] Laemmli U K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4[J]. Nature，1970，227(5259)：680-685.

[24] Chatterjee A K，Dumenyo C K，Liu Y，et al. Erwinia：genetics of pathogenicity factors[J]. Academic Press，2015，2(6)：236-260.

[25] Chang X，Seo M，Takebayashi Y，et al. Jasmonates are induced by the PAMP flg22 but not the cell death-inducing elicitor Harpin inVitisrupestris[J]. Protoplasma，2017，254(1)：271-283.

[26] Cui Y，Chatterjee A，Chatterjee A K. Effects of the twocomponent system comprising GacA and GacS ofErwiniacarotovorasubsp.carotovraon the production of global regulatory rsmB RNA，extracellular enzymes，and HarpinEcc[J]. Mol Plant Microbe Interact，2001，14(4)：516-526.

[27] 曹茂林，張 玨，湯 承，等. 胡蘿卜軟腐歐文氏菌CSSY002菌株hrpN基因的克隆、鑒定及其表達(dá)產(chǎn)物Harpin蛋白的活性分析[J]. 應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報，2007，13(2)：161-165.

[28] Kariola T，Palomaki T A，Brader G，et al.Erwiniacarolavorasub sp.carotovoraand Erwinia-derived elicitors HrpN and PehA trigger distinct but interacting defense responses and cell death inArabidopsis[J]. Mol plant-Microbe Interact，2003，16(3)：179-187.