王喜紅，朱利娟，易想煉，趙 靜，向思亭，譚柱良，袁志航*，易金娥,2*

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，長沙 410128； 2.湖南畜禽安全生產(chǎn)協(xié)同創(chuàng)新中心，長沙 410128)

隨著養(yǎng)殖業(yè)的迅速發(fā)展，氧化應激已經(jīng)成為當代畜牧業(yè)熱議的話題。腸道不僅是營養(yǎng)物質吸收的主要場所，也是動物機體內最大的免疫器官和分泌器官[1-2]。有文獻報道，氧化應激能引起胃腸道功能障礙，導致畜禽免疫力下降，生產(chǎn)性能降低，肉品品質下降，甚至引起死亡[3]，這給養(yǎng)殖效益帶來了不言而喻的損害。因此，尋找純天然的抗氧化劑及預防和修復腸道氧化損傷的方法迫在眉睫。

樺木酸(betulinic acid, BA)是一種植物源性五環(huán)三萜類物質，廣泛分布在自然界的各種植物中。早在兩百年以前，美國人常用白樺樹皮來泡茶，用于益氣養(yǎng)身以及治療胃腸道疾病和痢疾[4-5]。隨后研究發(fā)現(xiàn)，BA具有抗炎、抗氧化應激、提高機體免疫力等多種生物活性[6-11]。此外，BA具有極低的毒性，即使使用劑量高達500 mg·kg-1時，機體并沒有出現(xiàn)明顯的毒性現(xiàn)象[5,12]。我們前期試驗發(fā)現(xiàn)，BA對地塞米松誘導的淋巴細胞凋亡具預防性的保護作用，該保護作用與BA能提高抗氧化酶活性，抑制自由基和脂質過氧化物產(chǎn)生，提高抗氧化力有關；進一步研究發(fā)現(xiàn)，BA阻斷活性氧(reactive oxygen species，ROS)對線粒體膜通透性的影響和膜通透性下降，有效清除ROS對細胞的損傷，通過抗氧化應激從線粒體信號轉導通路和內質網(wǎng)信號轉導通路減少淋巴細胞凋亡，從而對淋巴細胞起到保護作用[13-15]，證實BA的免疫調節(jié)作用有賴于抗氧化應激機能的發(fā)揮。BA對腸道氧化損傷調節(jié)是否具有改善作用，還未見報道。本試驗采用腹腔注射環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide, Cy)誘導小鼠腸道氧化損傷模型，研究BA對腸道氧化損傷的保護作用，旨在為建立緩解畜禽腸道氧化應激及預防和修復腸道氧化損傷的新方法提供理論依據(jù)和探索新的途徑，為畜禽腸道健康的研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗試劑

BA以白樺樹皮(2016年春季收集于吉林省長春市，經(jīng)60 ℃烘干后貯藏在黑暗、干燥處備用)為原料，從白樺樹皮中提取樺木醇，經(jīng)瓊斯試劑氧化制備中間產(chǎn)物樺木酮酸后，用硼氫化鈉還原合成BA，具體按文獻方法[16]制備，HPLC測定BA純度為96.53%；注射用Cy(批號：12042725)購自江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司；小鼠分泌型免疫球蛋白α(secretory immunoglobulin a, SIgA)ELISA試劑盒購自上海博谷生物科技有限公司；超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、還原型谷胱甘肽(glutathione, GSH)和丙二醛(malondialdehyde, MDA)試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。

1.2 試驗方法

將25只健康KM小鼠，4～5 周齡，SPF級，體重(20±2)g，放置在相對濕度為50%～70%，溫度為21～25 ℃的飼養(yǎng)房中預飼養(yǎng)1 W后，隨機分為5組：即對照(NC)組、Cy組、0.5 mg·kg-1BA組、5.0 mg·kg-1BA組和50.0 mg·kg-1BA組。整個試驗期間觀察小鼠的生長狀況，稱量小鼠的初體重和末體重。NC組和Cy組給予等量的1%可溶性淀粉，其余組分別按0.5、5.0、50.0 mg·kg-1BA給藥，將BA混懸于1%的可溶性淀粉中，按每20 g體重0.2 mL灌胃，1次·d-1，連續(xù)灌胃14 d。在第15、16天，除NC組外，其余各組連續(xù)2 d腹腔注射Cy(50 mg·kg-1)，建立小鼠腸道黏膜損傷模型，NC組注射等量的生理鹽水，禁食16 h(自由飲水)后，眼眶采血撲殺，收集血液，分離血清，置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。頸椎脫臼處死小鼠，取肝、脾和胸腺，分別稱取器官質量(精確至0.000 1)。打開腹腔，剝離小腸，剪取兩段空腸，一段在無菌生理鹽水中輕輕晃動除凈腸道內容物，截取空腸中部，置于冰上，沿腸管縱向剪開，用冰冷的PBS沖洗腸組織，用玻璃切片刮取空腸黏膜，檢測SIgA的分泌。另一段空腸組織按組織與預冷生理鹽水的質量體積比為1︰9制成10%組織勻漿，3 000 r·min-1離心15 min，收集上清液，檢測SOD、GSH和MDA水平。

1.3 檢測指標

1.3.1 BA對小鼠脾、胸腺、肝指數(shù)的測定 計算脾指數(shù)、胸腺和肝指數(shù)，單位以g·g-1表示。根據(jù)以下公式計算臟器器官指數(shù)。

臟器器官指數(shù)=(臟器器官/體重)×100(g·g-1)

1.3.2 小腸黏膜SIgA分泌水平的檢測 嚴格按照試劑盒說明書操作，采用ELISA法檢測腸黏膜SIgA分泌水平。

1.3.3 血清和腸道抗氧化能力的測定 采用硫代巴比妥酸法檢測MDA的含量；二硫代二硝基苯甲酸法測定GSH含量；黃嘌呤氧化酶法測定SOD的活性。MDA、GSH和SOD水平的檢測均按試劑盒說明書嚴格操作。

1.4 數(shù)據(jù)分析與處理

2 結 果

2.1 BA對小鼠器官指數(shù)的影響

BA連續(xù)灌胃14 d，小鼠表現(xiàn)未見異常反應，也無死亡現(xiàn)象，表明BA對小鼠并無顯著毒性。由表1可知，與NC組相比，Cy組小鼠脾指數(shù)顯著降低(P<0.05)，胸腺指數(shù)和肝指數(shù)極顯著降低(P<0.01)，說明Cy導致免疫器官和肝萎縮。與Cy組相比，BA低、中劑量組脾指數(shù)和胸腺指數(shù)有所增加，但差異不顯著(P>0.05)；BA低、中劑量組能劑量依賴性提高肝指數(shù)，中劑量組升高顯著(P<0.05)。

與NC組相比，a表示P<0.05，b表示P<0.01；與Cy組相比，c表示P<0.05

a.P<0.05, b.P<0.01 as compared with the NC group; c.P<0.05 as compared with the Cy group

2.2 BA對小鼠腸道黏膜SIgA分泌的影響

由表2可知，與NC組相比，Cy組SIgA的含量顯著下降(P<0.05)。與Cy組相比，BA各劑量組SIgA的含量呈上升趨勢，尤其以BA中劑量組差異極顯著(P<0.01)。這說明BA對Cy抑制腸黏膜SIgA的分泌具有改善作用。

與NC組相比，a表示P<0.05；與Cy組相比，c表示P<0.05，d表示P<0.01

a.P<0.05 as compared with the NC group; c.P<0.05, d.P<0.01 as compared with the Cy group

2.3 BA對小鼠血清和腸道抗氧化能力的影響

由表3可知，與NC組相比，Cy組血清中MDA含量顯著升高(P<0.05)，SOD和GSH活性變化無明顯影響；與Cy組比較，BA各劑量組中MDA有下降趨勢，但差異不顯著(P>0.05)，SOD和GSH活性無顯著性差異(P>0.05)。

由表4可知，與NC組相比，Cy組小腸組織中MDA含量升高，但差異不顯著(P>0.05)，SOD活性未見明顯變化，但GSH含量顯著上升(P<0.05)。與Cy組比較，BA各劑量組腸道MDA含量呈下降趨勢，但差異不顯著(P>0.05)，SOD和GSH活性無明顯變化(P>0.05)。

項目Items組別GroupsNCCy0.5mg·kg-1BA5.0mg·kg-1BA50.0mg·kg-1BAMDA/(nmol·mL-1)17.27±5.4925.51±3.75a23.88±3.2120.61±1.7423.29±1.58SOD/(U·mL-1)243.61±38.54240.94±19.48285.78±37.13242.79±37.40256.95±43.12GSH/(U·mL-1)14.40±2.5119.61±8.4322.15±5.4020.53±3.5416.55±1.37

與NC組相比，a表示P<0.05

a.P<0.05 as compared with the NC group

項目Items組別GroupsNCCy0.5mg·kg-1BA5.0mg·kg-1BA50.0mg·kg-1BAMDA/(nmol·mg-1)1.13±0.261.84±0.971.24±0.601.06±0.261.22±0.42SOD/(U·mg-1)0.96±0.261.07±0.350.99±0.440.93±0.241.23±0.16GSH/(U·mg-1)4.68±0.107.32±1.59a6.71±1.396.43±1.687.72±2.03

與NC組相比，a表示P<0.05

a.P<0.05 as compared with the NC group

3 討 論

Cy是常用的一種免疫抑制劑，尤其是對胃腸道的毒副作用最為明顯，例如造成嘔吐、腹瀉等，主要原因是Cy能夠促進機體釋放更多的自由基，促進腸道氧化損傷，破壞腸黏膜結構的完整性，降低機體免疫力[17-20]。脾和胸腺是機體最重要的免疫器官[21-22]。肝是最重要的代謝兼排毒器官，國內外研究報道肝也是免疫器官之一[23-25]。有文獻報道，機體免疫力的強弱可以通過免疫器官質量與體重的比值來反映[26]。另有文獻報道，動物發(fā)生應激并且免疫力低下會加劇對腸道的損傷[27]。在我們前期研究中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，BA能增強免疫器官的抗氧能力和免疫力，并對酒精性肝損傷有預保護作用，而這種作用依賴于BA的抗氧化應激機能的發(fā)揮[13,28]。本試驗發(fā)現(xiàn)，Cy能顯著降低脾、胸腺、肝器官指數(shù)，這說明Cy成功誘導氧化應激模型，在氧化應激狀態(tài)下引起免疫器官萎縮，用BA預處理后緩解了Cy引起的降低趨勢，尤其是中劑量效果最好。說明BA對Cy誘導的臟器萎縮有一定的保護作用，進而保護了腸道黏膜屏障，增強了腸道的抗氧化能力。

黏膜免疫是機體的第一道免疫防線，而腸黏膜免疫的主效因子是SIgA[29-30]。SIgA能調控腸道內微生態(tài)平衡，干擾并阻止致病抗原附著宿主細胞、減輕病原菌毒力，從而減少病原體的傳播及感染[31]。有文獻報道，SIgA分泌增加可以增強腸黏膜免疫力和抗病力，在免疫防御系統(tǒng)中占有非常重要的作用[32]。另有文獻報道，SIgA明顯下降，腸道免疫屏障受損，與腸道脂質過氧化增強有關[33]。在以往的研究中發(fā)現(xiàn)，BA具有很強的抗氧化能力和免疫調節(jié)能力，且通過清除活性氧自由基，對Dex誘導的氧化損傷中脂質過氧化有一定的調節(jié)作用[10-11,34]。本試驗結果顯示，Cy顯著降低小鼠腸道SIgA的含量，說明Cy引起的腸道氧化應激進一步造成小鼠腸黏膜免疫屏障損傷；當用BA預處理后，能明顯提高SIgA含量，說明BA對小鼠腸黏膜氧化損傷時SIgA的分泌有改善作用，從而對腸道免疫屏障起到一定保護作用，尤其是中劑量效果最好，進一步促進腸道增強抗氧化能力。

MDA屬于不飽和脂肪酸過氧化產(chǎn)物中的一種，含量的高低可以反映脂質過氧化程度的強弱[11]。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，BA預處理后，通過降低肝組織MDA含量、提高GSH水平，增強GSH-Px和SOD活性，保護酒精誘導的肝損傷，并且這種保護作用可能與BA自身的抗氧化性有關[13]。本試驗MDA結果與其相似，BA預處理后，血清和小腸中MDA含量均呈下降趨勢，但是，可能由于小鼠個體差異較大，每組小鼠僅5只，導致MDA差異不顯著，說明BA對Cy導致的脂質過氧化具有預保護作用。SOD是機體重要的抗氧化酶，可以調節(jié)機體氧化和抗氧化平衡[10,35]，而本試驗中血清和小腸中SOD活力并未見明顯變化，有可能是BA和50 mg·kg-1Cy對SOD活力并不起作用，也有可能由于小鼠個體差異較大所導致的誤差，具體原因有待后續(xù)試驗進一步驗證。GSH是機體重要的抗氧化劑，通過清除活性氧，保護機體的細胞膜結構以及其功能的完整性[36]，而值得注意的是，本試驗Cy處理后，小腸中GSH含量顯著上升，血清中GSH含量也呈上升趨勢，可能是機體的一種代償反應，由于Cy造腸道急性氧化應激模型，刺激腸道分泌過量GSH，維持機體氧化系統(tǒng)平衡。崔筱琳等根據(jù)近年來谷胱甘肽防治疾病研究進展的報道中提出假設觀點，當組織發(fā)生病變，將降解GSH抵抗氧化應激帶來的損傷，機體捕捉到相關信號后，迅速促進組織中合成和釋放大量GSH來適應新環(huán)境，隨著組織病變的不斷發(fā)展，GSH的消耗率將大于合成率，所以在發(fā)病初期，組織中GSH水平要比正常組織高[37]。BA處理后，血清和腸道的GSH水平變化無顯著影響，但BA低、中劑量組小腸中GSH水平呈量效遞減關系，使其表達量逐步趨于正常，BA高劑量未起到一個積極的作用?？傮w表明，BA具有提高動物體抗氧化能力和緩解Cy導致的脂質過氧化的潛力，尤其是中劑量效果最好。BA通過清除機體內過量ROS，緩解腸道和機體脂質過氧化，維持機體氧化系統(tǒng)平衡，提高動物機體和腸道的抗氧化能力。

4 結 論

BA通過緩解免疫器官萎縮，促進腸黏膜SIgA的分泌，降低機體及腸道組織局部MDA水平，增強機體和腸道組織局部的抗氧化功能，減輕Cy引起的氧化損傷。說明BA對Cy誘導的腸道氧化損傷具有預保護作用，其具體機制有待后續(xù)進一步研究。

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