禇 穎，馬文杰，胡衛(wèi)國(guó)，陳 茹，邱建華，郭慧君，李宏梅

(山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，山東省動(dòng)物生物工程與疾病防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東省畜禽疫病防制工程技術(shù)研究中心，泰安 271018)

TRIM25是TRIM(Tripartite motif)蛋白家族中的成員，從屬于 C-Ⅳ亞家族[1]。該蛋白N端具有TRIM蛋白家族典型的RING、B-box、Coiled-coil(RBBC)結(jié)構(gòu)域，C端還有一個(gè)PRY/SPRY結(jié)構(gòu)域。該蛋白質(zhì)的RING 結(jié)構(gòu)域是一個(gè)富含半胱氨酸的保守結(jié)構(gòu)域，具有泛素連接酶的特性，可以把線性化或多聚化的泛素分子轉(zhuǎn)移到靶蛋白上，調(diào)節(jié)靶蛋白的生物活性[2]；C端的PRY/SPRY結(jié)構(gòu)域是一段具有很大柔性的結(jié)構(gòu)域，可以與靶蛋白結(jié)合，并使之發(fā)生泛素化[3]。

TRIM25蛋白有兩個(gè)重要的作用備受關(guān)注，一是通過(guò)泛素化細(xì)胞生長(zhǎng)抑制因子14-3-3δ使其降解而促進(jìn)細(xì)胞增殖，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生[4]；二是參與機(jī)體的先天性抗RNA病毒反應(yīng)[1]。一些研究表明，TRIM25的過(guò)表達(dá)能抑制人艾滋病毒(HIV-1)、鼠白血病病毒(MLV)、禽白血病病毒(ALV)和B型乙肝病毒等RNA病毒在細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制[5-6]。另外，一些RNA病毒利用TRIM25蛋白可以抑制抗病毒因子的產(chǎn)生，進(jìn)而產(chǎn)生免疫逃避，如A型禽流感病毒(AIV)利用其自身的非結(jié)構(gòu)蛋白(NS1)可以結(jié)合TRIM25，并抑制視黃酸誘導(dǎo)基因蛋白(RIG-I)依賴的Ⅰ型抗病毒因子的產(chǎn)生，為 AIV-A宿主細(xì)胞內(nèi)復(fù)制和宿主間傳播感染提供了條件[7-8]。更值得關(guān)注的是，已有研究報(bào)道以TRIM25為靶點(diǎn)對(duì)Ⅰ型干擾素抗病毒反應(yīng)進(jìn)行人工控制，用于一些RNA病毒的防治[9]。

Z. Q. Feng等2015年首次報(bào)道了雞TRIM25全基因，比較發(fā)現(xiàn)與人和小鼠的TRIM25相似性分別僅為在47.6%和45.7%,熒光定量檢測(cè)發(fā)現(xiàn)在雞免疫組織(如胸腺、法氏囊)和肺等含量較高[10]。然而，對(duì)于雞TRIM25蛋白的組織分布、生物學(xué)功能及作用機(jī)制了解還很少。本研究旨在克隆雞TRIM25抗原基因，構(gòu)建重組原核表達(dá)質(zhì)粒，獲得雞TRIM25蛋白，制備抗雞TRIM25的多克隆抗體，建立檢測(cè)其表達(dá)的免疫組化方法，為研究雞TRIM25蛋白生物學(xué)特性、組織分布和抗病毒機(jī)制提供物質(zhì)基礎(chǔ)和方法依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和其他實(shí)驗(yàn)材料

BALB/c小鼠購(gòu)自山東大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；兔購(gòu)自泰安市岱岳區(qū)范鎮(zhèn)貴合畜禽養(yǎng)殖場(chǎng)。Trans-1、BL21、pEASY-Blunt E1表達(dá)載體購(gòu)自全式金有限公司。HRP酶標(biāo)二抗購(gòu)自博奧森生物有限公司；Bradford蛋白濃度測(cè)定試劑盒、超純RNA提取試劑盒和FastQuant cDNA第一鏈合成試劑盒均購(gòu)自北京天根生化科技有限公司；TME單組份底物顯色液購(gòu)自北京索萊寶生物科技有限公司；質(zhì)粒抽提試劑盒、PCR產(chǎn)物純化試劑盒購(gòu)自O(shè)MEGA公司；弗氏佐劑購(gòu)自Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 引物的設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)已發(fā)表的TRIM25基因序列(GenBank：KM879874.1)設(shè)計(jì)引物，對(duì)保守序列的TRIM25的RBBC基因進(jìn)行擴(kuò)增。上游引物：5′-CGCGGATCCCATCTGCCTCAGCATCTT-3′ ；下游引物：5′-CCGGAATTCATCCACAGACACATTCACT-3′引物由華大基因有限公司合成。

1.2.2 雞TRIM25基因的獲取 2周齡海蘭褐雛雞脾，剪碎，研磨，按RNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取總RNA。按FastQuant cDNA第一鏈合成試劑盒說(shuō)明書(shū)逆轉(zhuǎn)錄，得到cDNA。利用設(shè)計(jì)合成的引物，以cDNA為模板，按50 μL的擴(kuò)增體系PCR擴(kuò)增TRIM25基因。PCR擴(kuò)增條件：95 ℃ 2 min；95 ℃，20 s；60 ℃，20s ；72 ℃，15 s，循環(huán)35次，72 ℃ 5 min。1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定擴(kuò)增結(jié)果。

1.2.3 克隆載體的構(gòu)建與鑒定 PCR產(chǎn)物經(jīng)膠回收試劑盒純化后與pMD18-T simple載體連接，得到重組連接載體，命名為：pMD18-T-TRIM25；并轉(zhuǎn)化至Trans1-T1感受態(tài)細(xì)胞，挑取菌落，接種于LB液體培養(yǎng)基(50 μg·mL-1Amp+)，37 ℃振搖12 h，用DNA質(zhì)粒試劑盒提取重組質(zhì)粒，BamHⅠ和EcoRⅠ雙酶切鑒定重組質(zhì)粒，并測(cè)序比對(duì)基因序列。

用pEASY-Blunt E1表達(dá)質(zhì)粒與目的基因構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒，命名為pEASY-Blunt E1-TRIM25，按說(shuō)明用目的基因正向引物和T7 Terminator 引物PCR擴(kuò)增鑒定陽(yáng)性克隆。1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定結(jié)果，并測(cè)序分析。

1.2.4 雞TRIM25蛋白的表達(dá)、純化及鑒定 將含目的基因的陽(yáng)性菌接種于含氨芐的LB固體培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)8～10 h；次日挑取單菌落接種于含氨芐的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩過(guò)夜培養(yǎng)；按1∶100比例轉(zhuǎn)種于500 mL液體培養(yǎng)基；培養(yǎng)至OD600 nm約為0.6，加入1 mmol·L-1的IPTG，振搖培養(yǎng)4 h，取培養(yǎng)液SDS蛋白電泳分析蛋白表達(dá)結(jié)果。用抗His標(biāo)簽蛋白的單克隆抗體通過(guò)Western blot方法鑒定目的蛋白質(zhì)。

按照說(shuō)明，用蛋白質(zhì)純化柱純化His-TRIM25重組蛋白，通過(guò)SDS蛋白電泳分析純化效果；用BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒測(cè)定純化后的TRIM25蛋白的濃度。

1.2.5 血清抗體的制備 4只2月齡新西蘭兔和16只6周齡BALB/c小鼠，取血清保存作為陰性對(duì)照。將純化的重組TRIM25蛋白與弗氏佐劑乳化后背部皮下多點(diǎn)注射兔(兔每只200 μg蛋白抗原；鼠每只100 μg蛋白抗原)，間隔2周加強(qiáng)免疫2次，最后一次免疫2周采集抗血清。以間接ELISA方法檢測(cè)抗體效價(jià)。

1.2.6 血清抗體效價(jià)檢測(cè) 參考發(fā)表的間接 ELISA法[11]測(cè)定抗體效價(jià)。用純化的TRIM25重組蛋白質(zhì)作包被抗原，封閉，加入稀釋的兔、鼠血清孵育，分別加入相應(yīng)的酶標(biāo)羊抗兔和羊抗鼠的二抗，顯色。用酶標(biāo)儀在OD450 nm時(shí)檢測(cè)吸光度值。判定標(biāo)準(zhǔn)：陽(yáng)性對(duì)照、陽(yáng)性血清OD450 nm值>1.0，陰性血清與陰性對(duì)照的OD450 nm值<0.2，檢測(cè)樣品OD450 nm值>0.2，S/N>2.1時(shí)，達(dá)到此標(biāo)準(zhǔn)的血清的最大稀釋倍數(shù)為其抗體效價(jià)。

1.2.7 雞TRIM25蛋白抗體介導(dǎo)的免疫組化方法建立 將青年海蘭褐雞肺、脾和肝樣品進(jìn)行常規(guī)石蠟包埋，制作連續(xù)切片厚度為5 μm，相鄰切片分為2套，貼于玻片上。按常規(guī)步驟建立檢測(cè)組織TRIM25表達(dá)的免疫組化方法，陰性對(duì)照用未免疫兔血清代替一抗，顯微鏡觀察并拍照。

2 結(jié) 果

2.1 TRIM25基因的克隆與表達(dá)

利用設(shè)計(jì)的引物對(duì)TRIM25基因進(jìn)行擴(kuò)增，凝膠電泳結(jié)果顯示(圖1)所提取的基因大小1 012 bp左右，這與TRIM25的功能結(jié)構(gòu)域RING、B-box和Coiled-coil包含的基因序列大小基本一致，測(cè)序結(jié)果顯示該基因與發(fā)表的雞TRIM25基因相應(yīng)序列是一致的，表明目的基因克隆成功。

2.2 重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定

利用BamHⅠ和EcoRⅠ酶對(duì)構(gòu)建的重組pMD18-T-TRIM25質(zhì)粒進(jìn)行鑒定，核酸電泳得到預(yù)期大小的兩條電泳條帶，其中含TRIM25目的基因條帶(圖2)。用TRIM25目的基因正向引物和T7 Terminator 引物對(duì)構(gòu)建的表達(dá)質(zhì)粒pEASY-Blunt E1-TRIM25進(jìn)行PCR擴(kuò)增鑒定，核酸電泳獲得預(yù)期基因片段，結(jié)果見(jiàn)圖3，其中包含TRIM25目的基因片段。測(cè)序結(jié)果顯示，重組質(zhì)粒中插入片段的序列與上述所克隆測(cè)序的基因序列完全一致。

M. DNA 相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn); 1.目的基因PCR產(chǎn)物M. DNA marker; 1. Chicken TRIM25 gene圖1 雞TRIM25基因的克隆鑒定Fig.1 Identification of cloned chicken TRIM25 gene

M. DNA 相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn); 1.目的基因；2.雙酶切結(jié)果M. DNA marker; 1. Chicken TRIM25 gene; 2. Gene fragments after being digested圖2 重組pMD18-T-TRIM25質(zhì)粒雙酶切鑒定Fig.2 Identification of recombinant plasmid pMD18-T-TRIM25

2.3 TRIM25蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)、純化及鑒定

M. DNA 相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn); 1和2.目的基因引物和T7 Terminator 引物的PCR產(chǎn)物M. DNA marker; 1 and 2. PCR amplified products with the primers of chicken TRIM25 and T7 Terminator圖3 表達(dá)質(zhì)粒pEASY-Blunt E1-TRIM25的鑒定Fig.3 Identification of the expressed plasmid pEASY-Blunt E1-TRIM25

將重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入表達(dá)菌BL21內(nèi)，1.0 mmol·L-1的IPTG 37 ℃誘導(dǎo)蛋白表達(dá)，將表達(dá)的蛋白質(zhì)經(jīng)SDS-PAGE分析，結(jié)果見(jiàn)圖4A。圖4A中泳道2顯示目的蛋白獲得大量表達(dá)，蛋白大小約48 ku，而未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的菌體未表達(dá)或表達(dá)極少的目的蛋白質(zhì)(泳道1)。對(duì)表達(dá)的蛋白指標(biāo)利用His標(biāo)簽蛋白進(jìn)行純化，經(jīng)SDS-PAGE分析可見(jiàn)獲得純化的蛋白質(zhì)條帶，結(jié)果見(jiàn)圖4B第3泳道蛋白質(zhì)條帶。

2.4 TRIM25蛋白的鑒定

將純化的蛋白質(zhì)，以His標(biāo)簽單克隆抗體為一抗，HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG為二抗，進(jìn)行Western blot分析，結(jié)果見(jiàn)圖5。結(jié)果顯示，所表達(dá)的蛋白質(zhì)可與His標(biāo)簽單抗發(fā)生特異性反應(yīng)，表明所誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)包含預(yù)期的TRIM25目的蛋白。

M.蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn); 1.未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的菌體裂解物; 2.經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后菌體裂解物; 3.純化后的TRIM25蛋白M. Protein marker; 1. The expressed products without induction of IPTG; 2. The expressed products with induction of IPTG; 3. The purified products of recombinant chicken TRIM25圖4 雞TRIM25重組蛋白的表達(dá)及純化Fig.4 The expressed and purified products of recombinant chicken TRIM25

M. 蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn); 1.His標(biāo)簽單抗介導(dǎo)的Western blot 結(jié)果M. Protein marker; 1. Western blot mediated by MAb against His marked protein圖5 雞TRIM25重組蛋白的Western blot鑒定Fig.5 Identification of recombinant chicken TRIM25 with Western blot mediated by His-MAb

2.5 血清抗體效價(jià)的測(cè)定

將純化后的TRIM25重組蛋白為免疫原接種兔和BLAB/c小鼠，經(jīng)三次免疫后，對(duì)兔和小鼠血清抗體效價(jià)進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，兔血清中抗體效價(jià)達(dá)到1∶106以上，鼠血清中抗體效價(jià)達(dá)到1∶107以上。

2.6 雞肺、脾和肝組織中TRIM25蛋白的分布檢測(cè)

使用制備的多克隆抗體建立免疫組化方法，對(duì)青年海蘭褐雞肺、脾、肝組織中TRIM25蛋白進(jìn)行檢測(cè)。圖6結(jié)果顯示，在雞肺、脾和肝中細(xì)胞內(nèi)均存在不同程度TRIM25的表達(dá),肺組織中主要出現(xiàn)在三級(jí)支氣管和肺房以及血管相應(yīng)組織內(nèi)(圖6A2)，高倍鏡下顯示陽(yáng)性細(xì)胞主要為雞肺房?jī)?nèi)皮細(xì)胞、周?chē)牧馨图?xì)胞、巨噬細(xì)胞以及血管內(nèi)皮細(xì)胞、淋巴細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)(圖6A3)。脾組織主要出現(xiàn)在脾髓生發(fā)中心脾淋巴細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞、淋巴細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中(圖6B2和6B3)。肝組織中肝小葉肝細(xì)胞和淋巴細(xì)胞以及血管內(nèi)皮細(xì)胞胞質(zhì)均出現(xiàn)較多表達(dá)(圖6C2和6C3)。

3 討 論

TRIM25蛋白是近些年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的一種機(jī)體先天性蛋白分子，具有廣泛的生物學(xué)活性，該蛋白質(zhì)通過(guò)泛素化靶蛋白而參與機(jī)體一系列生物反應(yīng)[12]。比較發(fā)現(xiàn)，不同動(dòng)物的TRIM25蛋白在結(jié)構(gòu)上存在差異，雞TRIM25蛋白與人和小鼠的同源性相對(duì)較低[10]，很難用人和鼠的TRIM25蛋白抗體用于雞TRIM25蛋白的研究。由于缺乏識(shí)別雞TRIM25蛋白的抗體試劑，限制了對(duì)雞TRIM25蛋白進(jìn)行深入研究。本研究根據(jù)已發(fā)表的雞TRIM25蛋白的基因序列，對(duì)其抗原指數(shù)分析發(fā)現(xiàn)在雞TRIM25的相對(duì)保守的功能結(jié)構(gòu)域RING、B-box和Coiled-coil(RBBC結(jié)構(gòu))，大小為1 012 bp的基因片段上具有較高的抗原指數(shù)(結(jié)果未列出)。根據(jù)該結(jié)果，設(shè)計(jì)基因引物從海蘭褐雞脾組織中擴(kuò)增出目的基因，用該基因構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒，獲得雞TRIM25的蛋白抗原。

A1, B1, C1分別為無(wú)抗體血清處理的肺、脾、肝; A2-A3, B2-B3, C2-C3分別為T(mén)RIM25抗體處理的肺、脾、肝; 箭頭為雞TRIM25陽(yáng)性細(xì)胞A1, B1, and C1 are the slices of chickens’ lungs, spleens and livers treated by control sera; A2-A3, B2-B3 and C2-C3 are the slices of chickens’ lungs, spleens and livers treated by TRIM25-antibody sera, respectively; Arrows of line, positive cells to chicken TRIM25圖6 兔源雞TRIM25抗體介導(dǎo)的免疫組化方法對(duì)雞肺、脾、肝組織中TRIM25表達(dá)的檢測(cè)Fig.6 Detection for TRIM25 expression in chicken’s lungs, spleens and livers with Immunohistochemistry method mediated by the prepared rabbit’s antibody

先前大量報(bào)道用pET表達(dá)載體構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒對(duì)目的基因進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)[13]，本研究利用經(jīng)pET改造的表達(dá)質(zhì)粒pEASY-Blunt E1對(duì)目的基因進(jìn)行連接，構(gòu)建pEASY-Blunt E1-TRIM25重組表達(dá)質(zhì)粒。由于該質(zhì)粒利用T7lac啟動(dòng)子嚴(yán)謹(jǐn)調(diào)控，N端含有His蛋白純化標(biāo)簽和氨芐青霉素篩選標(biāo)記，能夠簡(jiǎn)單、快速、高效地對(duì)目的基因進(jìn)行連接、表達(dá)和篩選，同時(shí)根據(jù)提供的T7 Promoter物或Terminator引物，方便地對(duì)構(gòu)建的重組表達(dá)質(zhì)粒進(jìn)行驗(yàn)證(通過(guò)PCR擴(kuò)增即可)。另外，該質(zhì)粒在感受態(tài)細(xì)胞克隆效率高，篩選效率也大大提高。

對(duì)構(gòu)建的重組表達(dá)質(zhì)粒pEASY-Blunt E1-TRIM25轉(zhuǎn)化至表達(dá)菌體內(nèi)，借鑒我們先前的表達(dá)條件[13]，用1 mmol·L-1的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)，對(duì)目的基因獲得較大量的表達(dá)。由于該表達(dá)的目的蛋白質(zhì)存在于菌體的包涵體內(nèi)，利用超聲波破碎法獲得游離態(tài)的重組蛋白質(zhì)經(jīng)His標(biāo)簽蛋白的Ni-純化層析柱純化，獲得純度達(dá)到95%以上的目的蛋白。蛋白質(zhì)濃度檢測(cè)發(fā)現(xiàn)能夠達(dá)到抗原接種要求。

利用該抗原分別接種兔和BALB/c小鼠，目的是能夠制備出用于不同研究的識(shí)別抗體。由于獲得兔源血清抗體數(shù)量較多，可用于免疫組化、ELISA包被和免疫印跡分析等，而鼠源的抗體具有效價(jià)高、特異性較強(qiáng)，可用于免疫組化和免疫印跡分析。從我們接種后檢測(cè)血清抗體效價(jià)來(lái)看，小鼠的血清抗體效價(jià)要比兔血清抗體效價(jià)高很多，在特異性上幾乎沒(méi)有差異(結(jié)果未展示)。

利用制備的兔源血清抗體，建立免疫組化方法，發(fā)現(xiàn)制備的血清抗體經(jīng)1∶200倍稀釋、與組織4 ℃過(guò)夜孵育效果獲得較好的免疫組化顯色反應(yīng)。肺、脾、肝三種組織中檢測(cè)比較發(fā)現(xiàn)，在三種組織均檢測(cè)出一定數(shù)量的陽(yáng)性細(xì)胞，這與Z. Q. Feng等利用熒光定量檢測(cè)到的結(jié)果[10]基本一致。而在本研究中發(fā)現(xiàn)這些陽(yáng)性細(xì)胞主要為肺內(nèi)三級(jí)支氣管、肺房的上皮細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞、淋巴細(xì)胞內(nèi)；脾生發(fā)中心的脾淋巴細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞和顆粒細(xì)胞；肝小葉的內(nèi)皮細(xì)胞、肝細(xì)胞和血竇內(nèi)皮細(xì)胞等，統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)這些陽(yáng)性細(xì)胞多為免疫細(xì)胞(如淋巴細(xì)胞、顆粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等)以及增殖旺盛的細(xì)胞(如上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞等)，這可能與TRIM25的抗感染和介導(dǎo)細(xì)胞增殖等作用密切相關(guān)。

4 結(jié) 論

本研究從海蘭褐雞脾中擴(kuò)增TRIM25基因，構(gòu)建重組原核表達(dá)質(zhì)粒，誘導(dǎo)表達(dá)雞TRIM25蛋白，然后獲得能夠識(shí)別雞TRIM25蛋白，且具有較高效價(jià)的兔源和鼠源血清抗體，建立定性檢測(cè)TRIM25表達(dá)的免疫組化方法，初步檢測(cè)了雞TRIM25在肺、脾和肝組織中的分布，為深入研究TRIM25蛋白的功能提供了物質(zhì)基礎(chǔ)和方法依據(jù)。

參考文獻(xiàn)(References)：

[1] OZATO K, SHIN D M, CHANG T H, et al. TRIM family proteins and their emerging roles in innate immunity[J].NatRevImmunol, 2008, 8(11): 849-860.

[2] DESHAIES R J, JOAZEIRO C A P. RING domain E3 ubiquitin ligases[J].AnnRevBiochem, 2009, 78: 399-434.

[3] SONG B, GOLD B, O′HUIGIN C, et al. The B30.2(SPRY) domain of the retroviral restriction factor TRIM5α exhibits lineage-specific length and sequence variation in primates[J].JVirol, 2005, 79(10): 6111-6121.

[4] URANO T, SAITO T, TSUKUI T, et al. Efp targets 14-3-3σ for proteolysis and promotes breast tumour growth[J].Nature, 2002, 417(6891): 871-875.

[5] UCHIL P D, QUINLAN B D, CHAN W T, et al. Trim E3 ligases interfere with early and late stages of the retroviral life cycle[J].PLoSPathog, 2008, 4(2): e16.

[6] ZHANG S J, GUO J T, WU J Z, et al. Identification and characterization of multiple TRIM proteins that inhibit hepatitis B virus transcription[J].PLoSOne, 2013, 8(8): e70001.

[7] GACK M U, ALBRECHT R A, URANO T, et al. Influenza A virus NS1 targets the ubiquitin ligase TRIM25 to evade recognition by the host viral RNA sensor RIG-I[J].CellHostMicrobe, 2009, 5(5): 439-449.

[8] RAJSBAUM R, ALBRECHT R A, WANG M K, et al. Species-specific inhibition of RIG-I ubiquitination and IFN induction by the influenza A virus NS1 protein[J].PLoSPathog, 2012, 8(11): e1003059.

[9] INN K S, GACK M U, TOKUNAGA F, et al. Linear ubiquitin assembly complex negatively regulates RIG-I- and TRIM25-mediated type i interferon induction[J].MolCell, 2011, 41(3): 354-365.

[10] FENG Z Q, CHENG Y, YANG H L, et al. Molecular characterization, tissue distribution and expression analysis ofTRIM25 inGallusgallusdomesticus[J].Gene, 2015, 561(1): 138-147.

[11] ZHANG D D, LI H M, ZHANG Z S, et al. Antibody responses induced by recombinant ALV-A gp85 protein vaccine combining with CpG-ODN adjuvant in breeder hens and the protection for their offspring against early infection[J].AntiviralRes, 2015, 116: 20-26.

[12] 劉慶祥. TRIM家族蛋白對(duì)I型干擾素信號(hào)通路的調(diào)控作用[J]. 中山大學(xué)研究生學(xué)刊: 自然科學(xué)、醫(yī)學(xué)版, 2015, 36(4): 42-52.

LIU Q X. Functions of TRIM family proteins in type I interferon signaling pathway[J].JournaloftheGraduatesSunYat-SenUniversity:NaturalSciences,Medicine, 2015, 36(4): 42-52. (in Chinese)

[13] 劉海港, 李宏梅, 王樹(shù)迎, 等. 山羊β雌激素受體多克隆抗體的制備及免疫組化方法的建立[J]. 畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào), 2013, 44(2): 302-308.

LIU H G, LI H M, WANG S Y, et al. Preparation of polyclonal antibody against goat estrogen receptor β and its application in immunohistochemistry assay[J].ActaVeterinariaetZootechnicaSinica, 2013, 44(2): 302-308. (in Chinese)