劉 潔, 王寶亮, 錢仁義

河南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院腦病科(鄭州450000)

腦梗死發(fā)病率、致殘率高，我國每年約有160萬人死于此病。雖然現(xiàn)已確立了超早期溶栓治療的有效性，但國際上的溶栓治療時間窗嚴格限制在3～4.5 h內[1]。電針即將電刺激與傳統(tǒng)中醫(yī)的針灸相結合，被廣泛應用于腦卒中臨床及其機制研究動物模型中。研究表明，電針能有效減少腦水腫的形成及腦梗死的面積，并能改善腦血流的分布及對大腦有明顯的神經保護作用[2]。PI3K/AKT信號通路是膜受體信號向細胞內轉導的重要途徑，同時大量實驗中發(fā)現(xiàn)其在神經系統(tǒng)疾病中參與細胞增殖、分化、代謝等生物學活動[3-4]。因此本研究通過建立MCAO模型給予不同介入時間的電針治療來闡明腦梗死后電針治療最佳時間窗及其可能機制。

材料與方法

1 材 料

1.1 實驗動物：健康的SPF級Sprague-Dawley(SD)雄性大鼠126只，由我院實驗動物中心提供，大鼠年齡大概在8周至10周，體重在250～280 g范圍內，自由取食，2只大鼠共住一籠，在無菌的層流通風的動物飼養(yǎng)房中飼養(yǎng)，合格證號：SCXK(湘)2015-0004。實驗操作部分在我院醫(yī)學科學研究中心進行。

1.2 實驗試劑：蘇木素染色劑 Sigma 公司；一抗，兔抗大鼠Anti-VEGF(血管內皮因子抗體)，北京博奧森生物公司；二抗，羊抗兔IgG 抗血清，北京博奧森生物公司；即用型SABC 免疫組化試劑盒，武漢博士德生物公司；DAB染色試劑盒，南京凱基生物公司；其他免疫組化試劑,福州邁新生物公司；定量PCR試劑盒，Invitrogen Life Technologies公司；SDS-PAGE 凝膠制備試劑盒，武漢谷歌生物技術有限公司；蛋白抽提試劑盒，武漢谷歌生物技術有限公司；Bradford 蛋白濃度測定試劑盒，碧云天生物技術研究所生產；超敏ECL 化學發(fā)光試劑盒BeyoECL Plus 碧云天生物技術研究所生產；其余試劑均為國產分析純。

2 方 法

2.1 動物分組:SD 大鼠隨機分為為缺血組(CI)h 和假手術組(Sham)。缺血組參照Zea Longa[5]線栓法建立大鼠右側大腦中動脈閉塞(MCAO)腦缺血再灌注模型，假手術組僅暴露右側頸總動脈，不予阻斷血流。缺血組隨機分為模型組、模型干預組(1 h后開始電針組、6 h后開始電針組、12 h后開始電針組、24 h后開始電針組、48 h后開始電針組)。

2.2 建立大鼠MCAO模型:健康成年雄性 SD 大鼠，體重250～ 280g，適應性飼養(yǎng)1周后參照Zea-Longa 線栓法[15]制作右側大腦中動脈栓塞模型(MCAO model)。

2.3 大鼠MCAO 模型神經功能缺損評分:大鼠MCAO模型制作成功后，按Zea-Longa[6]標準進行大鼠腦缺血再灌注神經功能缺損評分，評分于大鼠腦缺血1.5 h再灌注1 h后進行。該標準根據大鼠神經損傷癥狀進行評分，標準如下：0分：無神經損傷癥狀；1分：不能完全伸展對側(患側)前爪；2分：向對側(患側)轉圈；3分：向對側(患側)傾倒；4分：不能自發(fā)行走，意識喪失；5分：動物死亡。其中評分為1～3分且無蛛網膜下腔出血的大鼠納入實驗，0分、4分和5分剔除，并隨機補充。

2.4 選穴與治療方法:穴位定位參照李忠仁《實驗針灸學》[7]，“百會”穴位于頭部，前發(fā)際正在直上5 寸，或兩耳尖連線中點處；“水溝穴”位于面部，當人中溝的上13 與中13 交點處；“曲池”穴位于肘橫紋外側端，屈肘，尺澤與肱骨外上髁連線中點；“足三里”穴位于小腿前外側，當犢鼻下3 寸，距脛骨前緣一橫指(中指)。治療方案：假手術組、模型組不予任何治療處理，其余治療組分別于缺血再灌注后1 h、6 h、12 h、24 h、48 h 開始行電針治療，均1d1次，每次持續(xù)30 min，連續(xù)5 d。用32#1 寸針灸針，直刺以上四個穴位，深度約7 mm，快速捻轉至針下沉澀感后，接韓式穴位神經刺激儀(HANS-200，南京濟生醫(yī)療科技有限公司)，等幅疏密波，頻率為2/100 Hz，電流強度2mA，以動物肢體微顫為度。具體操作方法: 兩人配合操作，一人用手抓取SD 大鼠以固定，另一人做提插操作手法。模型組和假手術組的SD 大鼠與其他各個電針組在相應時間段內，施以同等條件抓取，但不實施任何針刺干預。

2.5 實驗指標：所有實驗動物在構建MACO 模型成功治療5 d后再次行神經功能學評分，隨后快速斷頭取腦，行TTC 染色觀察腦梗死體積，取海馬及紋狀體組織分別行免疫組化染色檢測Bax、Bcl-2 的表達，RT-PCR檢測PI3K1、AKT 基因含量和表達情況，具體實驗步驟嚴格按照試劑盒說明進行。

3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 15.0統(tǒng)計學軟件。數(shù)值變量以平均值±標準差表示，分類變量以范圍和中位數(shù)(Range，Median)表示；數(shù)值變量方差齊性資料采用單因素方差分析(兩兩比較采用SNK 檢驗)，方差非齊性資料采用秩和檢驗；分類變量進行卡方檢驗；均為雙側檢驗，P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 電針對MCAO 模型大鼠神經功能缺損的影響 見表1。假手術組評分為0，未見腦缺血再灌注神經功能損壞表現(xiàn)。MCAO模型組神經功能評分明顯高于假手術組，說明局部腦組織缺血后造成了明顯的神經功能障礙。腦缺血1.5 h 再灌注后6 h 和12 h組電針處理后，神經功能評分明顯低于MCAO組(P<0.05)，提示電針治療能夠改善局灶性缺血再灌注損傷后的神經功能。而1 h、24 h、48 h 電針治療組動物神經功能缺損評分與MCAO 組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，提示過早或過晚進行電針治療干預均不能改善局灶性腦缺血再灌注損傷后的神經功能。

2 各組大鼠腦梗死體積比較 見表1。與MCAO 組相比，6 h、12 h 電針治療組右側腦梗死體積比明顯減小(P<0.05)，1 h、24 h、48 h 電針治療組右側腦梗死體積比改變差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

表1 不同時間電針治療對大鼠MCAO 模型神經功能缺損及腦梗死體積百分比的影響

注：與假手術組組相比，#P<0.05；與MCAO相比，*P<0.05

3 大鼠紋狀體區(qū)域Bax、Bcl-2 的蛋白表達 如圖1，圖2所示，大鼠紋狀體區(qū)域假手術組(Sham 組)bcl-2、bax 表達陰性，各組非缺血側未見明顯染色。如表2所示，與假手術組(Sham 組)比較，MCAO 組紋狀體組織Bax 的表達明顯升高(P<0.01)。與MCAO 組比較，6 h 電針治療組紋狀體組織Bax 表達顯著降低(P<0.01)，1 h 電針治療組、12 h 電針治療組、24 h 電針治療組、48 h 電針治療組紋狀體組織Bax 表達與MCAO 組比較明顯降低(P<0.05)。與假手術組(Sham 組)比較，MCAO 組紋狀體區(qū)域Bcl-2 表達差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。與MCAO 組比較，6 h 電針治療組紋狀體區(qū)域Bcl-2 表達顯著降低(P<0.01)，1 h 電針治療組、12 h 電針治療組、24 h 電針治療組、48 h 電針治療組紋狀體區(qū)域Bcl-2 表達與MCAO 組比較明顯降低(P<0.05)。

表2 大鼠紋狀體區(qū)域Bax、Bcl-2的OD值

注：與假手術組組相比，#P<0.05；與MCAO相比，*P<0.05

4 針刺對MCAO 模型大鼠腦組織AKT-1、PI3K 的影響 見表3。

表3 不同介入時間電針治療對紋狀體AKT-1/PI3KmRNA 相對表達量的影響

注：與假手術組組相比，#P<0.05；與MCAO相比，*P<0.05

圖1 紋狀體區(qū)域Bax 的表達(免疫組化染色×400)

圖2 紋狀體區(qū)域Bcl-2 的表達(免疫組化染色×400)

MCAO 模型紋狀體組織AKT-1 mRNA表達與假手術組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；與MCAO 組比較，6 h 電針治療組AKT-1mRNA 表達顯著增加(P<0.01)；1 h 電針治療組、12 h 電針治療組、24 h 電針治療組、48 h 電針治療組mRNA 表達明顯增加(P<0.05)(表3)。假手術組腦組織中少量PI3K mRNA 表達； MCAO 模型紋狀體組織PI3K mRNA 表達與假手術組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；與MCAO 組比較，1 h 電針治療組、6 h電針治療組AKT-1 mRNA 表達明顯增加(P<0.05)；12 h 電針治療組、24 h 電針治療組、48 h 電針治療組mRNA 表達無明顯增加(P>0.05)。

討 論

目前作為將傳統(tǒng)的針灸治療與現(xiàn)代的電極刺激結合的產物，電針可通過肌肉組織和神經組織的電刺激達到治療腦梗塞的目的以及提高腦梗塞患者的生活質量[8]。在亞洲國家中，針灸已經被廣泛應用在神經系統(tǒng)疾病當中，而針灸因為其特殊的療效已經越來越被西方國家所重視。盡管針灸在臨床應用的實驗室依據還待有效的數(shù)據進一步來證明，但在過去的十年期間人們在針灸的臨床應用中所積累的各種評價和現(xiàn)有的數(shù)據的表明：其在一些神經系統(tǒng)疾病中，如面神經炎、脊髓損傷、三叉神經痛的治療效果是顯著的。這些針灸治療的臨床研究可以通過PubMed和個人文件中檢索獲得，并通過美國預防服務工作組對其進行評價總結[9]，而對于電針治療腦梗塞的臨床療效已經得到了很多學者的認可，電針刺激百會穴可以有效地降低腦卒中后的腦萎縮的發(fā)生率[10]。電針可以使大腦的局部血流增加[11]。而且大量臨床循證醫(yī)學支持急性期的治療優(yōu)于恢復期和后遺癥期[12]，但有些學者認為并非越早給予治療就越好[13]。所以我們推測可能存在一個腦梗塞的最佳治療時間窗，而這個時間窗尚需我們進一步探索。

Bcl-2蛋白家族主要參與細胞的內源性凋亡途徑完成對細胞凋亡的調控。研究發(fā)現(xiàn)B細胞淋巴瘤/白血病基因-2(Bcl-2)基因家族在神經元死亡中起著重要的作用，主要通過調節(jié)線粒體外細胞膜的通透性，來參與神經元的內在細胞凋亡途徑[14]，Bcl-2基因家族主要由促進細胞凋亡蛋白(包括BaK，Bax等)、抗細胞凋亡蛋白(包括Bcl-2，Bcl-xl和Bcl-w等)、和BH3-only蛋白(包括Bid、Bak、Puma等)組成。目前研究證實的抑制凋亡基因有Bcl-2、Bcl-xl等，而促進凋亡基因的有Bax、Bak等。

磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)家族參與了細胞的凋亡以及存活等主要功能，其能通過活化產生的第二信使—3,4-二磷酸磷脂酰肌醇[PI(3,4)P2]和3,4,5-三磷酸磷脂酰肌醇[PI(3,4,5)P3]，進而進一步的活化。哺乳動物細胞中，PI3K分為I、II及III型，其中I型可以通過結合酪氨酸激酶連接受體和G蛋白連接受體，進而傳遞下游信號，在外部刺激的作用下，產生第二信使磷脂酰肌醇3,4,5三磷酸(PIP3)，PIP3與細胞內的的信號蛋白Akt和PDK1結合，進而使Akt被PDK1磷酸化而活化。正常情況下，PI3K/AKT信號通路在誘導凋亡的過程中，主要的功能是磷酸化下游蛋白而實現(xiàn)細胞存活，這種作用大于誘導凋亡的作用，甚至可以通過某些途徑實現(xiàn)抑制凋亡誘導蛋白的作用[15]。

本文通過研究不同介入時間的電針治療對大鼠MCAO模型局灶性腦缺血再灌注損傷的神經保護作用，探索電針治療的最佳介入治療時間窗，以及探索其發(fā)揮神經保護作用的可能機制。本研究結果提示電針可增強AKT-1和PI3K的表達，從而激活PI3K/AKT信號轉導通路信號通路，發(fā)揮神經保護作用。因此，本研究選擇了PI3K和AKT-1作為凋亡指標，通過研究我們發(fā)現(xiàn)再灌注后6 h進行電針治療對腦缺血再灌注損傷治療的效果比較好。結果提示電針可增強AKT-1和PI3K的表達，從而激活PI3K/AKT信號轉導通路信號通路，發(fā)揮神經保護作用。上述結果均進一步證實大鼠MCAO模型局灶腦缺血再灌注后6 h是電針治療的較好時機。

綜上所述，本實驗的結果提示，電針治療能夠很好的改善大鼠腦缺血再灌注損傷，缺血1.5h后再灌注后6h是電針介入治療的較好時機。電針治療可以增強Bcl-2、AKT-1和PI3K的表達，降低Bax的表達，來抑制細胞凋亡并激活PI3K/AKT信號轉導通路信號通路，而發(fā)揮神經保護作用。

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