王鳳芹， 張 林， 路則慶， 汪以真*

(浙江大學飼料科學研究所，農(nóng)業(yè)部華東動物營養(yǎng)與飼料重點實驗室，浙江省飼料及動物營養(yǎng)研究實驗室，浙江杭州 310058)

多糖的生物活性與其結(jié)構(gòu)密切相關(guān)，因此了解多糖的結(jié)構(gòu)有助于更好地利用和開發(fā)多糖。完整的多糖結(jié)構(gòu)分析是在將多糖進行提取、分離、純化獲得均一性組分后，進行包括分子量范圍、單糖的組成、連接類型、單糖和糖苷鍵的構(gòu)型及重復(fù)單元等的分析[1]。細菌多糖通常是由雙糖至八糖形成的規(guī)則的重復(fù)單位構(gòu)成，而這些重復(fù)單位則是由2～4種單糖所組成，其中許多糖鏈上又攜帶有乙酰、丙酮酸、糖醛酸等特征基團[2]。在多糖的結(jié)構(gòu)研究中，單糖組成分析是必不可少的環(huán)節(jié)。糖類物質(zhì)在紫外區(qū)無吸收，采用示差折光檢測的靈敏度低且不利于梯度洗脫。為此，在進行高效液相色譜(HPLC)分析時，常采用衍生化處理，將糖類組分轉(zhuǎn)變?yōu)閹Оl(fā)色基團的分子[3 - 4]，主要的衍生化試劑有1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)[5 - 6]、1-(2-萘基)-3-甲基-5-吡唑啉酮(NMP)[7]、對氨基苯甲酸(p-AMBA)。衍生化后的產(chǎn)物經(jīng)HPLC分離、紫外檢測器檢測[4 - 6]。

本研究在文獻報道方法的基礎(chǔ)上，對PMP衍生單糖和糖醛酸進行了系統(tǒng)研究，分別考察了不同pH值、不同的檢測時間以及不同的反應(yīng)時間對于單糖和糖醛酸衍生反應(yīng)物的影響，并利用優(yōu)化的方法測定了細菌多糖中的單糖和糖醛酸組成。為進一步對細菌多糖的生理活性研究提供理論依據(jù)。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Waters Alliance 2695高效液相色譜系統(tǒng)(美國，Waters公司)，含Waters 2998二極管陣列檢測器和Empower 3色譜工作站；集熱式恒溫加熱磁力攪拌器(杭州惠創(chuàng)儀器設(shè)備有限公司)。

1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)、D -甘露糖、D -葡萄糖醛酸、D -葡萄糖、D -半乳糖、D -木糖、D -巖藻糖和乙腈均為色譜純，購于Sigma公司；KH2PO4、HCl、NaOH、三氯甲烷均為分析純，購于國藥集團化學試劑有限公司。實驗用水為超純水。

細菌多糖樣品：EnterobactercloacaeZ0206細菌由本課題組分離、馴化、鑒定并保存[8]。該細菌分泌的多糖經(jīng)過醇沉烘干為該研究所用的樣品。

1.2 實驗方法

1.2.1單糖和糖醛酸衍生物的制備精確稱取20 mg左右甘露糖、葡萄糖醛酸、葡萄糖、半乳糖和巖藻糖，溶解于水中并定容，配制成甘露糖濃度為1 mmol/L，葡萄糖醛酸濃度為0.5 mmol/L，葡萄糖濃度為2 mmol/L，半乳糖濃度為2 mmol/L，巖藻糖濃度為1 mmol/L的混合標樣。取10～200 μL混合標樣于2 mL 離心管中，用水補足至200 μL，每支離心管中再加入50 μL 1 mmol/L木糖。依次加入50 μL 0.5 mol/L PMP甲醇溶液和50 μL 0.3 mol/L NaOH溶液，蓋上蓋子，70 ℃水浴反應(yīng)60 min，冷卻后加入50 μL 0.3 mol/L HCl中和。先用0.5 mL三氯甲烷萃取兩次(用移液槍從底部取出三氯甲烷，棄去)，再用1 mL三氯甲烷萃取1次，8 000 r/min離心5 min，取上清液進行HPLC分析。以葡萄糖為例，單糖與PMP衍生的反應(yīng)方程式[9]如圖1所示。

圖1 葡萄糖與PMP的反應(yīng)方程式Fig.1 Labeling reaction of glucose with PMP

1.2.2細菌多糖的水解精確稱取25 mg左右細菌多糖樣品于水解管中，加入4 mL 3 mol/L三氟乙酸，再加入625 μL 10 mmol/L木糖溶液。封管，并在120 ℃烘箱中水解1 h。之后取出冷卻至室溫，調(diào)節(jié)pH值略偏堿性(用pH=1～12試紙比對)，并用水定容至25 mL。衍生反應(yīng)：取定容后的樣品溶液200 μL，之后操作同標準樣品。

1.2.3色譜條件色譜柱：XBridgeTMC18柱(250×4.6 mm，5 μm)；流動相：50 mmol/L KH2PO4溶液(pH=5.5)-乙腈(體積比78∶22)；檢測波長：245 nm；流速：1 mL/min；進樣體積：10 μL。

2 結(jié)果與討論

2.1 細菌多糖水解條件的優(yōu)化

文獻報道樣品水解時間通常選擇為2 h[10 - 11]或者8 h[12]。在本研究中對樣品水解時間進行了考察，當水解溫度設(shè)定為120 ℃，用3 mol/L 三氟乙酸分別水解樣品1 h和2 h，發(fā)現(xiàn)其色譜峰面積沒有太大的變化。最終，選擇的樣品水解時間為1 h。另外，為了避免三氟乙酸對分析結(jié)果的影響，文獻一般采用氮吹的方法去除三氟乙酸[13 - 14]。而在本研究中，直接用NaOH溶液中和樣品水解液中的三氟乙酸，調(diào)節(jié)pH至略偏堿性。本研究省略氮氣吹干水解液步驟，直接中和，中和溶液直接進行PMP衍生化，這對于開發(fā)快速定量單糖組成很有意義。

2.2 衍生反應(yīng)酸度的選擇

文獻報道[15]，為降低糖的PMP衍生物在萃取溶劑三氯甲烷中的損失，需要將衍生反應(yīng)體系的pH值調(diào)節(jié)成酸性，本研究調(diào)節(jié)pH值在2～11之間，以考察不同的衍生體系的pH值對萃取效果的影響，結(jié)果見圖2。當pH值在2～8時，單糖-PMP衍生物的峰面積變化并不明顯，此現(xiàn)象說明pH值在2～8之間，衍生物穩(wěn)定存在，并且不會對三氯甲烷的萃取效果產(chǎn)生影響。并不需要用過量的酸使該體系的pH為3～4[16]或4～5[14]。但是當pH值繼續(xù)升高時，葡萄糖、半乳糖和木糖三種糖衍生物的峰面積變小，此現(xiàn)象說明在較高pH值時，可能是由于部分單糖的PMP衍生物在三氯甲烷中有一定的溶解度造成在萃取過程中損失，這與文獻報道[16]一致。因此，本研究確定調(diào)節(jié)pH值在2～8之間，擴大了pH的范圍，以便于實際操作。

2.3 衍生反應(yīng)時間的選擇

參考文獻方法[4]，設(shè)定衍生溫度為70 ℃，本研究考察了衍生時間對于各單糖和糖醛酸衍生化產(chǎn)率的影響。取甘露糖濃度為1 mmol/L，葡萄糖醛酸濃度為0.5 mmol/L，葡萄糖濃度為2 mmol/L，半乳糖濃度為2 mmol/L，巖藻糖濃度為1 mmol/L的混合標樣160 μL。用水補足至200 μL，每支離心管中再加入50 μL 1 mmol/L木糖。依次加入50 μL 0.5 mol/L PMP甲醇溶液和50 μL 0.3 mol/L NaOH溶液，蓋上蓋子，設(shè)定溫度為70 ℃分別衍生10、20、30、40、60和80 min。再按實驗步驟進行處理，HPLC進行分析。實驗結(jié)果表明：在反應(yīng)初期隨著反應(yīng)時間的延長，各單糖和糖醛酸的PMP衍生物峰面積不斷增加。當反應(yīng)時間為60 min時，再增加反應(yīng)時間，色譜峰面積與60 min時基本持平(圖3)。因此，選擇衍生時間為60 min，這與文獻報道的趨勢基本一致[4]。

圖2 單糖和糖醛酸標準品PMP衍生物不同pH值下的峰面積Fig.2 Peak areas of PMP-labeled monosaccharides and galacturonic acid under different pH value

圖3 反應(yīng)時間對5種單糖和糖醛酸-PMP衍生物峰面積的影響Fig.3 Effect of reaction time on the peak area of PMP-labeled monosaccharides and galacturonic acid

2.4 衍生產(chǎn)物穩(wěn)定性考察

為了考察5種單糖和葡萄糖醛酸的衍生產(chǎn)物的穩(wěn)定性，本研究考察了衍生物日內(nèi)和日間的保留時間以及峰面積的變化。實驗結(jié)果表明，在反應(yīng)結(jié)束后的48 h內(nèi)單糖和糖醛酸的衍生物峰日內(nèi)保留時間的相對標準偏差(RSD)≤0.32%，日內(nèi)峰面積RSD≤2.96%，日間保留時間RSD≤0.47%，日間峰面積RSD≤2.58%。因此，在48 h內(nèi)分析衍生物完全可以得到準確的實驗結(jié)果，見表1。

表1 單糖和糖醛酸標準品PMP衍生物分析的日內(nèi)和日間精密度(n=6)Table 1 Precision for the analysis of PMP-labeled monosaccharides and galacturonic acid(n=6)

2.5 標準曲線及檢出限

圖4 5種單糖和1種糖醛酸-PMP衍生物的色譜圖Fig.4 Chromatogram of PMP derivatives of 5 monosaccharides and galacturonic acid

分別取10、20、40、60、80、100、120、160及200 μL混合標樣于2 mL離心管中，然后分別用水補足至200 μL，每支離心管中再加入50 μL 1 mmol/L木糖，再加入50 μL水。按實驗方法進行衍生化并進行HPLC分析，色譜圖見圖4。

在系列濃度下，以單糖和糖醛酸濃度與木糖濃度比值為橫坐標，以單糖和糖醛酸峰面積與木糖峰面積比值為縱坐標制作標準曲線，得線性方程與相關(guān)系數(shù)，以3倍信噪比計算得到4種單糖和糖醛酸的檢出限，結(jié)果見表2。由此可見，本方法的線性范圍寬，檢測靈敏度較高。

2.6 單糖及糖醛酸的回收率分析

通過對細菌多糖樣品水解產(chǎn)物進行衍生化，再對衍生物進行3次平行分析。得到甘露糖、葡萄糖醛酸、葡萄糖、半乳糖和巖藻糖含量比為：1.77∶0.44∶8.52∶1.32∶1.67，精密度分析范圍為0.52%～3.12%(表3)。以細菌多糖為材料進行方法的加標回收率考察?；旌蠘藰臃?個濃度梯度加入到樣品中，進行測定，結(jié)果如表3所示。甘露糖、葡萄糖醛酸、葡萄糖、半乳糖和巖藻糖的平均加標回收率分別為88.0%、89.3%、100.3%、95.8%和94.7%，RSD分別為6.56%、6.67%、2.66%、7.42%和7.05%。表明方法的準確度和精密度可以滿足細菌多糖中單糖和糖醛酸的測定要求。

表2 回歸方程、線性范圍及檢出限Table 2 Calibration curves and detection limits of 4 monosaccharides and galacturonic acid

表3 方法的加標回收率與精密度(n=3)Table 3 The recoveries and RSD of present method(n=3)

3 結(jié)論

綜上所述，本實驗建立了細菌多糖中單糖和糖醛酸的PMP柱前衍生化-高效液相色譜測定法。實驗優(yōu)化了衍生條件，整個實驗前處理步驟中避免了氮氣吹干、水解產(chǎn)物干燥等過程，并且擴大了衍生化pH值范圍。結(jié)果表明該方法準確、簡單、快速，具有良好的重現(xiàn)性。應(yīng)用該方法成功分離并定量分析了細菌多糖中4種單糖和1種糖醛酸。

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