張 蕾，代松寶，張麗琳，時培殿，王家順，任 婕，黃金海

(天津大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，天津 300072)

豬圓環(huán)病毒(Porcinecircovirus，PCV)屬于圓環(huán)病毒科圓環(huán)病毒屬，為已知最小的動物病毒之一，圓環(huán)病毒分為感染鳥類和感染哺乳動物類2種，感染哺乳動物類的即為豬圓環(huán)病毒。豬圓環(huán)病毒的基因組為單股負(fù)鏈的閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)，大小為1.7～2.0 kb[1-2]?；蚪M為雙義鏈，正義鏈和反義鏈均可以編碼蛋白[3]。PCV分為2個血清型：Ⅰ型(PCV1)和Ⅱ型(PCV2)，其中，PCV1無致病性，而PCV2則是多種豬病的病原體[4]。目前，已知和PCV2相關(guān)的豬病有：豬斷奶后衰竭綜合征(PMWS)、豬皮炎與腎炎綜合征(PDNS)、增生性壞死性肺炎(PNP)、豬呼吸道綜合征(PRDC)、繁殖障礙、先天性產(chǎn)顫抖、腸炎等[5]。PCV2病毒因有存活能力強(qiáng)、傳播范圍廣、易誘發(fā)其他疾病共感染的特點(diǎn)而給全球的養(yǎng)豬業(yè)造成了嚴(yán)重的危害。

已有報道，PCV2可通過MyD88-NF-κB途徑調(diào)節(jié)IL-4和IL-12的分泌，研究發(fā)現(xiàn)，PCV2可通過激活MyD88啟動NF-κB信號途徑，通過IκBα的磷酸化降解激活NF-κB，促使其入核與DNA結(jié)合，調(diào)控相關(guān)細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)[6-7]。PCV2感染肺巨噬細(xì)胞后，TNF-α、IL-8分泌量會下降[8]，且巨噬細(xì)胞趨化因子Ⅱ(Macrophage-derived chemotactic factor-Ⅱ，AMCF-Ⅱ)、粒細(xì)胞集落刺激因子(Granulocyte colony-stimulating factor，G-CSF)、單核細(xì)胞趨化因子(Monocyte chemotactic protein-1，MCP-1)的mRNA表達(dá)量均會一定程度下調(diào)[9]。Darwich等[10]研究表明，PCV2的核酸以及基因組的特殊結(jié)構(gòu)(ODN)可抑制PBMCs中IFN-α、IL-12p40、IL-10和IL-6的表達(dá)。綜上可知，PCV2對宿主的先天性免疫存在潛在的調(diào)控作用，但PCV2對作為介導(dǎo)天然免疫反應(yīng)重要防線的β干擾素是否也具有調(diào)控作用，目前未見報道。

病毒感染細(xì)胞后，釋放核酸，被胞漿中特異的模式識別受體識別，經(jīng)過相應(yīng)配體的結(jié)合和下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，啟動干擾素和其他細(xì)胞因子基因的轉(zhuǎn)錄[11-12]。TLR9是發(fā)現(xiàn)較早的病毒DNA模式識別受體，AIM2、IFI16、DDX41、cGAS是后來逐漸發(fā)現(xiàn)的其他胞質(zhì)DNA感受器[13-16]。通過模式識別受體對病毒DNA的識別引發(fā)級聯(lián)反應(yīng)，最終同IFN-β上游的-100～-50 bp處啟動子區(qū)有順式作用元件(Positive regulatory domain，PRD)相應(yīng)的ISRE、NF-κB、AP-1啟動子區(qū)結(jié)合，啟動IFN-β[17]。

本研究利用 IFN-β啟動子報告基因檢測、相對熒光定量等試驗(yàn)方法，探究PCV2調(diào)控Ⅰ干擾素通路的作用機(jī)制，為該病的防治提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)所有PCV2毒株為天津大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室在PK-15細(xì)胞上增殖后收集保存，所用PK-15細(xì)胞為本實(shí)驗(yàn)室凍存。真核細(xì)胞表達(dá)載體pcDNA3.1、RIG-I-FLAG、IFN-β-Luc、NF-κB-Luc、ISRE-Luc質(zhì)粒、TBK1表達(dá)質(zhì)粒、IRF3-5D-Flag、仙臺病毒(Sendaivirus，SEV)由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 主要試劑

TRIzol LS reagent、DEPC購自Invitrogen公司；TranScript First-Strand cDNA Synthessis SuperMix購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；分子克隆相關(guān)試劑：E.coliDH5α感受態(tài)、Fast pfu DNA聚合酶購自全式金公司；限制性內(nèi)切酶XbaⅠ和BamHⅠ、T4DNA連接酶均為New England Biolabs公司產(chǎn)品；無內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒購自Promega公司；細(xì)胞培養(yǎng)相關(guān)試劑：FBS、PBS、青-鏈霉素、0.25%胰酶、DMEM 培養(yǎng)基購于Gibco公司；轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000 Reagent購自ThermoFisher 公司。熒光素酶報告檢測試劑：D-Luciferase粉末購自Sigma公司；Glycylglycine購自北京索萊寶科技有限公司；鼠抗HA標(biāo)簽單抗、鼠抗β-actin 單抗、兔鼠抗-V5 標(biāo)簽單抗、辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗鼠抗體購自全式金公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 細(xì)胞與病毒增殖 細(xì)胞培養(yǎng)于含有10% FBS 和1%青-鏈霉素的H-DMEM 完全培養(yǎng)基中，置于37 ℃，5% CO2孵箱中培養(yǎng)。PCV2毒株按MOI為0.5感染PK-15細(xì)胞及PAM細(xì)胞，感染后2，6，12，24，36，48 h分別收集細(xì)胞，提取總RNA，相對熒光定量PCR檢測PCV2感染不同時間先天性免疫分子的變化。相對熒光定量PCR體系為：總RNA(50 ng)8 μL，2×TS Reaction Mix 10 μL，Oligo(dT) 18 (50 pmol/L) 1 μL，RT Enzyme Mix 1 μL，ddH2O 8.2 μL，反應(yīng)條件為：95 ℃ 30 s；95 ℃ 10 s，56 ℃退火15 s，72 ℃ 30 s，共進(jìn)行40個循環(huán)。95 ℃持續(xù)15 s，60 ℃ 15 s，升溫至95 ℃持續(xù)20 min，采集擴(kuò)增產(chǎn)物的解鏈曲線。相對熒光定量PCR中的Ct值代表模板中目標(biāo)基因的含量，通過與β-actin進(jìn)行比較，細(xì)胞因子mRNA相對定量PCR結(jié)果采用2-ΔΔCt法進(jìn)行分析。利用Duncan法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析(P<0.05時表示差異顯著)。

1.3.2 質(zhì)粒構(gòu)建、轉(zhuǎn)染及蛋白檢測 根據(jù)GenBank(DQ910866.1、DQ235696.1、EF514716.2)基因序列設(shè)計(jì)PCV2ORF1、ORF2、ORF3基因擴(kuò)增引物。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。使用濃度25 pmol/μL的引物見表1。根據(jù)相應(yīng)基因序列設(shè)計(jì)引物，將PCV2ORF1、ORF2、ORF3基因連接到pcDNA3.1真核表達(dá)載體上，將一定量的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞，轉(zhuǎn)染48 h后收獲細(xì)胞，加入適量含蛋白酶抑制劑、RIPA裂解液(50 mmol/L Tris-HCl，pH值7.5，150 mmol/L NaCl，1%NP-40)冰浴裂解30 min，裂解液于4 ℃、8 000 r/min離心5 min，收集上清進(jìn)行 SDS-PAGE，之后將蛋白轉(zhuǎn)膜至硝酸纖維膜上，經(jīng)5%牛奶封閉30 min，一抗4 ℃孵育過夜，HRP標(biāo)記二抗室溫孵育1 h后，用化學(xué)發(fā)光顯色底物及Chemi Doc TMXRS系統(tǒng)檢測。

表1 PCV2基因擴(kuò)增引物Tab.1 Amplification primers of different PCV2 protein genes

注：灰色部分為酶切位點(diǎn)。

Note：Enzyme cutting site was showed in gray.

1.3.3 熒光素酶報告檢測 將IFN-β啟動子熒光素酶的報告質(zhì)粒 IFN-β-Luc和熒光素酶內(nèi)參質(zhì)粒 Laz-luc共轉(zhuǎn)染PK-15細(xì)胞，設(shè)置不接種(Mock)和接種PCV2(0.5 moi)組，并將PK-15細(xì)胞接種SeV作為陽性對照，24 h后檢測 IFN-β啟動子熒光素酶活性。為了進(jìn)一步研究PCV2感染是否能抑制Poly(dA∶dT)誘導(dǎo)的IFN-β轉(zhuǎn)錄，將 IFN-β啟動子熒光素酶的報告質(zhì)粒IFN-β-Luc和熒光素酶內(nèi)參質(zhì)粒Laz-luc共轉(zhuǎn)染PK-15細(xì)胞，隨后分別設(shè)0.00(Mock)，1.00，0.10，0.01 moi劑量的PCV2接種組，接種設(shè)置為24 h后用Poly(dA：dT)刺激，24 h后檢測 IFN-β啟動子熒光素酶活性。

為了進(jìn)一步研究PCV2編碼的3個主要蛋白ORF1/ORF2/ORF3哪個對干擾素具有調(diào)控作用，使用Lipofectamine 2000將pcDNA3.1-ORF1、pcDNA3.1-ORF2、pcDNA3.1-ORF3各0.5 μg同0.5 μg IFN-β-Luc、NF-κB-Luc、AP-1-Luc及0.5 μg 內(nèi)參Laz-luc質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染24孔板中的HEK293T細(xì)胞，轉(zhuǎn)染24 h后，加入SEV(20 HA/mL)刺激18 h后收集細(xì)胞，進(jìn)行熒光素酶報告檢測。確定了PCV2編碼蛋白對干擾素具有調(diào)控作用后，進(jìn)一步將0.5 μg IFN-β-Luc、NF-κB-Luc、AP-1-Luc與0.5 μg 內(nèi)參Laz-luc質(zhì)粒同不同劑量的pcDNA3.1-ORFs(0.05，0.10，0.20，0.40 μg)轉(zhuǎn)染細(xì)胞，用Poly(dA∶dT)或cGAS質(zhì)粒作為誘導(dǎo)劑激活干擾素信號通路。

數(shù)據(jù)平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤差通過GraphPad Prism 5.01分析處理得到。通過t檢驗(yàn)計(jì)算P值，P值小于0.05時認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 pcDNA3.1-ORF1/ORF2/ORF3真核表達(dá)的構(gòu)建

基因擴(kuò)增產(chǎn)物與目的大小相符，陽性克隆測序正確，表明已成功構(gòu)建了ORF1/ORF2/ORF3的pcDNA3.1真核表達(dá)載體。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞裂解產(chǎn)物的相對分子量大小正確，能特異性表達(dá)相應(yīng)大小的ORF1/ORF2/ORF3蛋白(圖1)。

A.ORF1-3基因片段分別為945，702，345 bp；B.ORF1-3表達(dá)蛋白分子量分別為37.8，27.5，13.5 ku。A.ORF1-3 PCR products，945，702，345 bp respectively；B.The expression products of PCV2 ORF1-3，37.8，27.5，13.5 ku，respectively.

2.2 PCV2體外感染對天然免疫反應(yīng)的抑制效應(yīng)

2.2.1 PCV2感染對白細(xì)胞介素mRNA的影響 如圖2所示，整體上看，IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10的轉(zhuǎn)錄在病毒感染初期會有一個上升過程，但在感染后期均會受到不同程度的抑制。IL-1β和IL-8是天然免疫應(yīng)答過程中最重要的調(diào)節(jié)因子，其參與炎癥反應(yīng)、增強(qiáng)免疫介導(dǎo)的組織損傷；IL-8是一種重要的趨化性細(xì)胞因子，趨化和激活中性粒細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞及T細(xì)胞進(jìn)入感染部位。PCV2感染后IL-8在12 h的升高說明病毒成功感染細(xì)胞，后期可能與細(xì)胞浸潤和肉芽腫形成相關(guān)；IL-10是一種介導(dǎo)免疫抑制的細(xì)胞因子，可以抑制Th1細(xì)胞應(yīng)答、抑制巨噬細(xì)胞的抗原提呈功能及其細(xì)胞因子的合成，PCV2感染導(dǎo)致IL-10轉(zhuǎn)錄的上調(diào)和感染豬胸腺的衰竭有關(guān)。

圖2 PCV2感染PK-15細(xì)胞因子IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10轉(zhuǎn)錄時相Fig.2 The transcriptional profiles of cytokines IL-1β，IL-6，IL-8，IL-10 in PCV2 inoculated PK-15 cells

2.2.2 PCV2感染對抗原提呈分子mRNA的影響 如圖3所示，PCV2感染后MHCⅠ、MHCⅡ類分子在感染早期的轉(zhuǎn)錄水平較高，其中，MHCⅠ的峰值出現(xiàn)在感染后12 h，MHCⅡ則能持續(xù)較高水平地表達(dá)，在感染24 h后開始下降?？乖岢始?xì)胞后期受到抑制可能和IL-10的高水平表達(dá)有關(guān)，IL-10的上調(diào)會降低MHC類分子的表達(dá)，損害抗原提呈細(xì)胞的抗原提呈能力。

圖3 PCV2感染PK-15細(xì)胞MHCⅠ，MHC Ⅱ的轉(zhuǎn)錄表達(dá)Fig.3 The transcriptional changes of MHCⅠand MHCⅡ in PCV2 infected cells

2.2.3 PCV2感染對模式識別受體TLRs、cGAS的影響 TLR樣受體是一種廣泛存在的模式識別受體，其中，TLR3、TLR7、TLR9主要負(fù)責(zé)識別病毒的核酸，我們已經(jīng)證實(shí)，PCV2感染會引起先天性免疫細(xì)胞因子IL-1、IL-6、IL-8、IL-12、TNF-α等的變化，這種變化是否和TLR受體相關(guān)？PAM細(xì)胞感染PCV2后0，6，12，24，48 h各時間點(diǎn)收集細(xì)胞，提取總RNA，利用相對熒光定量的方法檢測TLR3、TLR7、TLR9的mRNA水平，結(jié)果如圖4所示。在PCV2感染12 h以內(nèi)TLRs的轉(zhuǎn)錄水平不會有顯著的變化，但在感染12 h以后便開始顯著升高，其中，TLR7隨感染時間變化不明顯，TLR9有先上升后下降的趨勢，在24 h時達(dá)到最大值，隨后開始下降(圖4)。

圖4 PCV2感染對TLR3/7/9、cGAS轉(zhuǎn)錄的影響Fig.4 The transcription levels of TLR3/7/9 and cGAS in PCV2 inoculated cells

2.2.4 PCV2體外感染對Ⅰ型干擾素及轉(zhuǎn)錄因子的影響 Ⅰ型干擾素是機(jī)體天然免疫重要的抗病毒蛋白。對PCV2感染后細(xì)胞Ⅰ型干擾素IFN-α、IFN-β、IFN-γ的轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行動態(tài)分析發(fā)現(xiàn)，PCV2感染對IFN-α的影響不明顯，但可以下調(diào)IFN-β、IFN-γ的mRNA，轉(zhuǎn)錄因子NF-κB上調(diào)，而IRF3的轉(zhuǎn)錄水平被下調(diào)(圖5)。

圖 5 PCV2感染PK-15細(xì)胞后Ⅰ型干擾素及轉(zhuǎn)錄因子NF-κB、IRF3轉(zhuǎn)錄的變化Fig.5 The transcription levels changes of type Ⅰ interferon and transcription factor NF-κB and IRF3 in PCV2 inoculated cells

2.2.5 PCV2體外感染PK-15對IFN-β及其啟動子的抑制 IFN-β是先天性免疫的第一道防線，采用熒光素酶報告檢測系統(tǒng)檢測PCV2感染PK-15細(xì)胞后IFN-β的表達(dá)情況及其啟動子的激活情況，分別用DNA模式識別受體相關(guān)的配體去激活I(lǐng)FN-β信號通路，然后檢測PCV2感染后對IFN-β的影響(圖6)，結(jié)果顯示PCV2感染不能激活I(lǐng)FN-β的轉(zhuǎn)錄，并且能夠抑制Poly(dA∶dT)、cGAS誘導(dǎo)的IFN-β轉(zhuǎn)錄，且呈現(xiàn)接種劑量依賴性。

A.與Sev相比；B.PCV2劑量效應(yīng)；C.不同激活配體處理；*.P<0.05，**.P<0.01。圖7-9同。A.Sev stimulated cells；B.Dose-dependent effect of PCV2 treated cells；C.PCV2 blocked Ploy(dA∶dT)，cGAS induced activity of IFN-β.*.P<0.05,**.P<0.01.The same as Fig.7-9.

2.3 PCV2 ORF1、ORF2對IFN-β的調(diào)控作用

為了確定PCV2 ORF1、ORF2、ORF3這3個主要蛋白的調(diào)控作用，將PCV2表達(dá)質(zhì)粒ORF1、ORF2、ORF3分別同IFN-β-Luc、NF-κB-Luc、IRF3-Luc、AP-1-Luc質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染細(xì)胞，24 h后加入Sev作為誘導(dǎo)劑激活I(lǐng)FN-β通路。如圖7所示，PCV2感染抑制Poly(dA∶dT)和cGAS誘導(dǎo)的IRF3、NF-κB的活化，但不影響AP-1的活化。ORF1可以通過NF-κB啟動子激活I(lǐng)FN-β的表達(dá)，ORF2可通過NF-κB和IRF3啟動子抑制IFN-β的表達(dá)，ORF3則沒有明顯的作用。

圖7 不同PCV2 ORF表達(dá)蛋白對干擾素誘導(dǎo)啟動子活化的影響Fig.7 The regulation roles of different PCV2 ORF expression protein in inducing IFN activation

2.4 ORF1 和ORF2通過NF-κB、IRF3對IFN-β的作用

PCV2感染可以抑制Ploy(dA∶dT)、cGAS誘導(dǎo)的IFN-β產(chǎn)生，且呈劑量依賴關(guān)系。以cGAS為誘導(dǎo)劑檢測過表達(dá)ORF1、ORF2時，對IFN-β及其啟動子的活性調(diào)控的結(jié)果如圖8所示，ORF1可以通過NF-κB啟動子激活I(lǐng)FN-β的表達(dá)，并且呈劑量依賴效應(yīng)；ORF2可以通過NF-κB和IRF3啟動子抑制IFN-β的表達(dá)，并且呈劑量依賴效應(yīng)。

水泡性口炎在許多細(xì)胞上都有它的受體，因此可以感染多種細(xì)胞系，并且已知它是一種對Ⅰ型干擾素敏感的病毒。筆者用表達(dá)綠色熒光蛋白標(biāo)記的水泡性口炎病毒(GFP-VSV)間接判斷ORF1、ORF2表達(dá)蛋白對細(xì)胞干擾素產(chǎn)生的影響，生長狀態(tài)良好的PK-15細(xì)胞，分別轉(zhuǎn)染ORF1、ORF2的表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染24 h后，按moi 0.01的濃度接種GFP-VSV。接種后18 h收獲細(xì)胞，用4%的多聚甲醛固定細(xì)胞后，用DAPI染細(xì)胞核，熒光倒置顯微鏡觀察視野中GFP-VSV的細(xì)胞數(shù)量并做統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果如圖9所示，ORF1轉(zhuǎn)染細(xì)胞VSV-GFP病毒增殖明顯受到抑制，ORF2轉(zhuǎn)染細(xì)胞后VSV-GFP病毒的增殖卻顯著增強(qiáng)。

圖8 PCV2 ORF1和ORF2影響的干擾素活化途徑分析Fig.8 Effects of over expression of PCV2 ORF1/ORF2 on cGAS-triggered IFN-β promoter activation

A、B.ORF1 轉(zhuǎn)染組；C、D.ORF2 轉(zhuǎn)染組。A，B.ORF1-treated cells；C，D.ORF2-treated cells.

3 討論

PCV2感染PK-15細(xì)胞檢測其對細(xì)胞先天性免疫因子的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，NF-кB、IL-6、IL-8細(xì)胞因子在病毒感染后其轉(zhuǎn)錄水平均較高，而IFN-β、IL-1β、TNF-α、MHC Ⅰ、MHC Ⅱ細(xì)胞因子后期受到抑制[18]，說明PCV2造成感染細(xì)胞的免疫抑制，這也解釋了感染PCV2的仔豬通常會伴隨著豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)、豬肺炎支原體、細(xì)菌性敗血癥和肺炎等其他疾病，PCV2感染造成機(jī)體免疫抑制使得仔豬繼發(fā)性易感性增加。病毒感染使TLRs轉(zhuǎn)錄水平試驗(yàn)中TLR3的轉(zhuǎn)錄水平隨PCV2感染會升高，可能的原因?yàn)榧?xì)胞的RNA聚合酶Ⅲ以PCV2基因組為模板合成5′-三磷酸雙鏈RNA，它可被TLR3識別，進(jìn)而通過TRIF途徑發(fā)揮抗病毒效應(yīng)，但對TLR7的轉(zhuǎn)錄水平?jīng)]有影響。TLR9識別病毒非甲基化的CpG DNA，通過對PCV2的序列分析發(fā)現(xiàn)，PCV2基因中富含若干CpG DNA基序可以激活TLR9，PCV2感染后24，36 h TLR9 mRNA表達(dá)量升高，可能與PCV2基因組中CpG的釋放內(nèi)陷進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)有關(guān)。

病毒感染機(jī)體后，機(jī)體的細(xì)胞內(nèi)模式識別受體會識別和提呈病毒的病原相關(guān)分子，啟動天然免疫，經(jīng)一系列的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，最終誘導(dǎo)Ⅰ型干擾素等細(xì)胞因子的表達(dá)，這是很多病毒用來逃逸先天性免疫的主要手段之一[19]。研究發(fā)現(xiàn)，仙臺病毒(Simaianvirus)的V蛋白、埃博拉病毒(Ebolavirus)的VP35可以通過抑制IRF3的功能從而抑制干擾素的轉(zhuǎn)錄，到達(dá)逃逸先天性免疫的目的。丙型肝炎病毒(HepatitisCvirus)NS3/4A既可以抑制IRF3的功能，也可以通過降解MAVS蛋白來抑制先天性免疫；流感病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白NS1可以通過和RIG結(jié)合而抑制IRF3的功能，從而成功地進(jìn)行免疫逃逸。HCV的NS5A蛋白通過抑制MyD88、痘病毒(Vacciniavirus)的A52R通過與IRAK2的相互作用抑制TLR介導(dǎo)的Ⅰ型干擾素轉(zhuǎn)錄[19-22]。研究發(fā)現(xiàn)，PCV2通過IRF3、NF-κB啟動子抑制干擾素的產(chǎn)生，但PCV2 ORF1和ORF2在對干擾素的調(diào)控方面表現(xiàn)出相反的特性，ORF1通過NF-κB激活干擾素的產(chǎn)生，Meng[23]研究發(fā)現(xiàn)，PCV2 復(fù)制時激活 NF-κB，細(xì)胞用NF-κB抑制劑處理可以減少病毒的復(fù)制，說明NF-κB 的活化在協(xié)同多種控制免疫反應(yīng)的細(xì)胞基因表達(dá)上發(fā)揮重要的作用，從而促進(jìn)病毒的復(fù)制?，F(xiàn)在還不清楚其具體分子機(jī)制。另有研究表明，PCV2基因序列中含有的干擾素刺激應(yīng)答元件(ISRE)使得PCV2感染早期能夠利用干擾素進(jìn)行病毒復(fù)制[24]。這可能為ORF1激活I(lǐng)FN-β提供了一種解釋。

IRF-3被上游信號分子激活后磷酸化入核，再與細(xì)胞核內(nèi)的組蛋白乙?；D(zhuǎn)移酶結(jié)合，改變?nèi)旧w的構(gòu)象，然后與干擾素啟動子DNA結(jié)合，通過這一系列的活化過程來啟動干擾素的表達(dá)。NF-κB的活化包括IκB降解和P65磷酸化2個過程，IκB降解后釋放NF-κB P50/P65異源二聚體，P65磷酸化，最終進(jìn)入細(xì)胞核與細(xì)胞核內(nèi)的組蛋白乙?；D(zhuǎn)移酶結(jié)合，改變?nèi)旧w的構(gòu)象，然后與干擾素啟動子DNA結(jié)合，啟動干擾素的表達(dá)[25-26]，因此，欲進(jìn)一步研究ORF1/ORF2調(diào)控干擾素的機(jī)制，需要研究ORF1/ORF2對IRF3的磷酸化二聚化入核的影響[27-29]。

研究中利用雙報告基因檢測技術(shù)、相對熒光定量等試驗(yàn)方法，發(fā)現(xiàn)PCV2抑制Ⅰ型干擾素通路，但其編碼的ORF1蛋白通過NF-κB激活I(lǐng)FN-β的產(chǎn)生，ORF2通過NF-кB、IRF3啟動子抑制IFN-β的產(chǎn)生，這為認(rèn)識PCV2免疫抑制機(jī)制提供了新依據(jù)。

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