郭士格，南楠，尹德東，周芳，王樹芳，劉建兵，賀斌，王介東，徐祥波，陳西華*

(1.北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院研究生院，北京 100730；2.國家衛(wèi)生計生委科學(xué)技術(shù)研究所，北京 100081；3.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院，新鄉(xiāng) 453003；4.山西醫(yī)科大學(xué)，太原 030001)

月經(jīng)是女性重要的生理現(xiàn)象，子宮內(nèi)膜異常出血嚴(yán)重影響女性的生活質(zhì)量，每年尋求治療的婦女?dāng)?shù)量龐大[1]。但是有關(guān)人類月經(jīng)生理和病理的許多問題仍沒有得到解答。

Markee[2]將兔的子宮內(nèi)膜移植于雌性獼猴眼前房內(nèi)，觀察到蛻膜化的子宮內(nèi)膜在孕酮撤退后，螺旋動脈強烈收縮，推測螺旋動脈收縮引起的組織低氧是造成子宮內(nèi)膜崩解的關(guān)鍵因素。低氧誘導(dǎo)因子HIF1A是應(yīng)答低氧的首要轉(zhuǎn)錄因子[3]。在低氧條件下，HIF1A的降解受到阻斷，HIF1A轉(zhuǎn)運到細(xì)胞核與HIF1B形成異源二聚體[4]，結(jié)合于DNA中的低氧反應(yīng)元件并調(diào)控下游基因表達(dá)。本研究采用的HIF1A抑制劑甲氧雌二醇(Methoxyestradiol，2ME)具有解聚微管蛋白的作用，從而抑制HIF1A進(jìn)入細(xì)胞核[5]。

血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)是一個編碼HIF1A轉(zhuǎn)錄活性的關(guān)鍵應(yīng)答基因[6]。VEGF的所有亞型及其受體均在子宮內(nèi)膜中表達(dá)[7]。VEGF在女性增殖期中期表達(dá)上調(diào)并且促進(jìn)血管增生[8-10]。

有研究分別利用人子宮內(nèi)膜組織塊、人內(nèi)膜基質(zhì)原代細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)，探討了孕酮撤退和低氧對VEGFmRNA的調(diào)節(jié)作用[11-12]。但是在活體內(nèi)，孕酮撤退后HIF1A是否直接與VEGF基因的上游啟動子結(jié)合并調(diào)節(jié)其表達(dá)，并未明確闡述。本科室前期研究表明[13]，小鼠月經(jīng)樣模型崩解期，孕酮撤退后Vegf與Hif1amRNA的表達(dá)變化趨勢隨著時間的推移變化基本一致；HIF1A蛋白進(jìn)入細(xì)胞核，轉(zhuǎn)錄活性被激活，且其達(dá)峰時間點與VegfmRNA達(dá)峰時間點一致。本研究進(jìn)一步以小鼠月經(jīng)樣模型為基礎(chǔ)，研究HIF1A對VEGF的調(diào)控作用與調(diào)控關(guān)系，并在小鼠月經(jīng)樣模型中證明HIF1A能夠直接調(diào)控VEGF的表達(dá)，并在體外培養(yǎng)模擬月經(jīng)發(fā)生的人蛻膜化子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞中得到驗證。

材料和方法

一、實驗動物及細(xì)胞材料來源

實驗動物：8～10周齡C57BL6雌鼠(SPFⅡ)，根據(jù)國家衛(wèi)計委科學(xué)技術(shù)研究所動物倫理委員會許可批準(zhǔn)進(jìn)行實驗。小鼠在可控的條件下給予充足的水和食物，光照8：00～20：00，溫度(20±1)℃。

取術(shù)前三個月未用任何激素藥物給予子宮切除手術(shù)的子宮肌瘤患者增殖中、晚期或分泌早期子宮內(nèi)膜用于人子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞分離培養(yǎng)。

二、研究方法

1.小鼠月經(jīng)樣模型的建立及HIF1A抑制劑干預(yù)實驗：據(jù)前期研究建立小鼠生理性孕酮撤退月經(jīng)樣模型[14]。蛻膜化2 d后移去孕酮皮下埋植管時記為0 h。抑制劑組分別在孕酮撤退前4 h、撤退后4 h與12 h共3個時間點以腹腔注射的方式給予HIF1A抑制劑2ME 100 mg/kg(Selleck，美國)；對照組處理為同樣時間給予等量2ME的溶媒溶液。在孕酮撤退后24 h取材，-80°C保存。

2. 染色質(zhì)免疫共沉淀(ChIP)：據(jù)ChIP試劑盒(Cell Signaling，美國)操作說明書，取小鼠月經(jīng)樣模型孕酮撤退后0 h、8 h、12 h、16 h和24 h的-80°C凍存小鼠子宮，加入PBS+蛋白酶抑制劑Cocktail(PIC)溶液并剪碎；加入37%甲醛450 μl，室溫?fù)u床孵育20 min進(jìn)行蛋白質(zhì)-DNA交聯(lián)反應(yīng)。隨后加入Glycine終止反應(yīng)；樣品達(dá)到單細(xì)胞狀態(tài)，依次加入Buffer A/B，加入10～15 μl Micrococcal Nuclease，使樣品DNA被分解成150～900 bp的片段，加入100～150 μl 0.5 mol/L EDTA，終止反應(yīng)；破碎細(xì)胞，收集上清完成交聯(lián)染色體制備；用ChIP Buffer將樣品稀釋至100 μg/ml；分別加入沉降抗體：HIF1A 1 μl(1：500)(Novus，美國)、H3陽性對照組蛋白H3抗體10 μl、陰性對照正常兔IgG抗體1 μl，4°C搖床孵育過夜；各樣品加入30 μl ChIP沉降珠，4°C搖床孵育2 h；離心后保留沉淀，隨后沉降珠洗脫，樣品純化，最后利用實時熒光定量PCR檢測目標(biāo)序列的相對含量。

表1 引物序列

3.Western blot檢測：-80℃保存的小鼠子宮組織分別提取核蛋白與胞質(zhì)蛋白，加入適量蛋白酶抑制劑；將40～50 μg蛋白質(zhì)進(jìn)行10%SDS-PAGE膠電泳，轉(zhuǎn)移至PVDF膜后，分別進(jìn)行VEGF(Santa Cruz，美國)、HIF1A(Novus，美國)、β-ACTIN(北京康為世紀(jì)生物)、LAMIN-B抗體(Santa Cruz，美國)雜交，用ECL發(fā)光試劑盒(北京全式金生物)檢測。

4.人蛻膜化子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞體外模擬月經(jīng)發(fā)生：主要試劑為DMEM/F12(Gibco，美國)、雌二醇(E2)(Alfa Aesar，美國)、甲羥孕酮(MPA)(Sigma，美國)、Charcoal stripped FBS(Invitrogen，美國)。據(jù)前期研究報道建立人子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞蛻膜化模型[15]，原代培養(yǎng)2 d后，換成維持培養(yǎng)基(無酚紅DMEM/F12+抗生素+MPA 10-7mol/L、E210-8mol/L)培養(yǎng)12～24 h；更換無激素培養(yǎng)基模擬月經(jīng)發(fā)生(DMEM/F12無酚紅+10% Charcoal-stripped FBS+抗生素)，記為0 h；在處理后0 h、12 h、24 h和36 h收集細(xì)胞。

5. 實時熒光定量PCR：將-80℃保存的樣本，TRIzol法提取總RNA。將總RNA與Random primer及Oligo(dT)混合，70℃孵育10 min，迅速于冰上冷卻2～3 min，配制逆轉(zhuǎn)錄體系，30℃孵育10 min，42℃孵育60 min，70℃孵育15 min，最后冰上冷卻，獲得cDNA文庫；用實時熒光定量PCR檢測VEGF和HIF1AmRNA的表達(dá)量。所用主要試劑Real-Time PCR kit(SYBR寶生物工程)，引物序列見表1。

6.人蛻膜化內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞HIF1A敲降實驗：敲降組采用激素維持培養(yǎng)基(無酚紅DMEM/F12+2%Charcoal stripped FBS+MPA10-7mol/L、E210-8mol/L)+Hif1a敲降；相應(yīng)的陰性對照組中轉(zhuǎn)染無義序列。無抗生素?zé)o血清激素維持培養(yǎng)基(無酚紅DMEM/F12+MPA10-7mol/L、E210-8mol/L)，37°C培養(yǎng)24 h。轉(zhuǎn)染試劑為LipofectamineTM2000(Thermo Fisher，美國)，具體步驟參照產(chǎn)品說明書。轉(zhuǎn)染特異性HIF1A的siRNA序列(Gene Pharma，上海)24 h后完成敲降過程，將培養(yǎng)基更換成無激素培養(yǎng)基模擬月經(jīng)發(fā)生(無酚紅DMEM/F12+2%Charcoal stripped FBS)，記為0 h。分別在0、12、24、36 h共4個時間點收集細(xì)胞，Real-time PCR方法檢測VEGFmRNA表達(dá)量。

四、統(tǒng)計學(xué)方法

結(jié) 果

一、HIF1A與Vegf基因在小鼠月經(jīng)樣模型孕酮撤退后的結(jié)合

孕酮撤退后，ChIP實驗結(jié)果顯示HIF1A結(jié)合Vegfpromoter的相對含量在0 h較低，隨后逐漸上升，在12 h達(dá)到峰值(P<0.01)，在16 h迅速降低，24 h隨后略上升，但顯著低于12 h峰值(P<0.01)(圖1)。

二、小鼠月經(jīng)樣模型中HIF1A抑制劑對HIF1A-VEGF調(diào)控的影響

圖1 小鼠月經(jīng)樣模型崩解期HIF1A結(jié)合Vegf promoter區(qū)域的相對含量

在小鼠月經(jīng)樣模型中給予2ME抑制HIF1A功能，于孕酮撤退后24 h檢測HIF1A和VEGF蛋白的表達(dá)。HIF1A在子宮組織細(xì)胞質(zhì)中的表達(dá)在抑制劑組較陰性對照組中高(P<0.01)(圖2A)，而胞核中，在抑制劑組中較對照組低(P<0.05)(圖2B)。抑制劑組中VEGF在胞質(zhì)的表達(dá)量較對照組低(P<0.01)(圖2C)。

A：胞質(zhì)中HIF1A蛋白Western blot結(jié)果與相對表達(dá)量；B：胞核中HIF1A蛋白Western blot結(jié)果及相對表達(dá)量；C：胞質(zhì)中VEGF蛋白Western blot結(jié)果與相對表達(dá)量；相互比較，*P<0.01圖2 小鼠月經(jīng)樣模型中HIF1A抑制劑(2ME)對子宮組織HIF1A-VEGF調(diào)控的影響

三、HIF1A 與VEGF mRNA在體外模擬月經(jīng)發(fā)生(激素撤退)的人蛻膜化內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)

HIF1A與VEGFmRNA均在0 h處于較低水平，12 h略上升；與12 h相比，HIF1AmRNA在24 h、36 h顯著升高(P<0.01)，約為12 h的表達(dá)量的3倍，VEGFmRNA的表達(dá)升高更為明顯(P<0.01)(圖3)。

四、采用siRNA敲降HIF1A對HIF1A-VEGF調(diào)控的影響

使用HIF1AmRNA特異性siRNA轉(zhuǎn)入蛻膜化人ESC細(xì)胞后，HIF1AmRNA敲降效率在敲降后0 h為90%，在48 h敲降效率為88%(圖4A)。陰性對照組，VEGFmRNA表達(dá)量在激素撤退后呈上升趨勢，在0 h表達(dá)量最低，12 h略上升，在24 h和36 h表達(dá)量顯著高于12 h(P<0.01)，且36 h的表達(dá)量進(jìn)一步顯著升高(P<0.01)；而HIF1A敲降組，VEGFmRNA的表達(dá)雖略有上升，但是上升的幅度與對照組相比顯著降低(P<0.01)，且VEGFmRNA的表達(dá)量在24 h和36 h僅約為陰性對照組的1/2(圖4B)。

A：HIF1A mRNA的表達(dá)；B：VEGF mRNA的表達(dá)；相互比較，*P<0.01圖3 孕酮撤退后HIF1A和VEGF mRNA在蛻膜化人子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞的表達(dá)

A：HIF1A敲降效率；B：陰性對照組與HIF1A敲降組中VEGF mRNA的相對表達(dá)量；相互比較，*P<0.01圖4 HIF1A敲降對于孕酮撤退后蛻膜化人內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞VEGF mRNA表達(dá)的影響

討 論

本研究在小鼠月經(jīng)樣模型中探究HIF1A與VEGF的表達(dá)及其調(diào)控關(guān)系。結(jié)果顯示，在孕酮撤退0-24 h，HIF1A結(jié)合的Vegfpromoter的相對含量變化趨勢先升高后降低并在12 h達(dá)到峰值(P<0.05)。VegfmRNA在12 h出現(xiàn)的峰值與此時HIF1A與Vegfpromoter的結(jié)合關(guān)系緊密[13]，提示孕酮撤退后HIF1A入核激活，并啟動下游調(diào)控基因VegfmRNA的表達(dá)。2ME抑制HIF1A入核活化的同時，VEGF表達(dá)顯著降低(P<0.05)。綜上證明，小鼠月經(jīng)樣模型在孕酮撤退后HIF1A進(jìn)入細(xì)胞核，其轉(zhuǎn)錄因子功能被激活，并啟動下游調(diào)控基因VegfmRNA的表達(dá)。

我們進(jìn)一步在體外培養(yǎng)的人蛻膜化內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞中驗證HIF1A對VEGF的直接調(diào)節(jié)關(guān)系。結(jié)果顯示，HIF1A和VEGFmRNA均在0 h處于較低的水平，在12 h略上升，在24 h、36 h表達(dá)量顯著升高(P<0.01)。也就是說孕酮撤退顯著上調(diào)HIF1A和VEGFmRNA的表達(dá)量。體外培養(yǎng)的人蛻膜化內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞在孕酮撤退后，VEGFmRNA在HIF1A敲降組的表達(dá)雖略有上升，但是上升的幅度與對照組相比顯著降低(P<0.01)。綜上證明，在小鼠月經(jīng)樣模型和體外培養(yǎng)的人蛻膜化內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞中，孕酮撤退后HIF1A入核，其轉(zhuǎn)錄因子活性被激活，并啟動下游調(diào)控基因VegfmRNA的表達(dá)。

低氧誘導(dǎo)因子HIF1A是應(yīng)答低氧的主要轉(zhuǎn)錄因子[3]。2002年Zhang等[16]發(fā)現(xiàn)HIF1A僅在少數(shù)分泌晚期和月經(jīng)期前的人子宮內(nèi)膜中表達(dá)。2006年，Critchley等[17]發(fā)現(xiàn)HIF1A蛋白和HIF1AmRNA在分泌期功能層人子宮內(nèi)膜，特別是月經(jīng)期人子宮內(nèi)膜組織中高表達(dá)。低氧條件下，HIF1A的降解被阻斷，HIF1A積累并與HIF1B結(jié)合形成異源二聚體轉(zhuǎn)運至細(xì)胞核內(nèi)，與基因組中的低氧反應(yīng)元件結(jié)合，調(diào)控下游靶基因的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)。血管內(nèi)皮生長因子VEGF是一個編碼HIF1A轉(zhuǎn)錄活性的關(guān)鍵應(yīng)答基因[6]。本科室前期研究表明，在小鼠月經(jīng)樣模型崩解期，孕酮撤退后VEGF與HIF1AmRNA的表達(dá)量時相變化相一致[13]。

本研究以小鼠月經(jīng)樣模型為基礎(chǔ)，明確了在孕酮撤退后HIF1A轉(zhuǎn)錄因子功能被激活，并直接結(jié)合于Vegfpromoter區(qū)，啟動下游調(diào)控基因VegfmRNA的表達(dá)。進(jìn)一步利用人子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞體外培養(yǎng)模擬月經(jīng)發(fā)生(激素撤退)，驗證了HIF1A對VEGF的直接調(diào)節(jié)關(guān)系。

子宮內(nèi)膜異常出血是影響女性生殖健康的重要因素。闡明子宮內(nèi)膜崩解出血生理機制，有助于促進(jìn)異常出血機制的研究、治療策略探尋及女性生殖健康水平的提升。

【參考文獻(xiàn)】

[1] Maybin JA，Critchley HO. Menstrual physiology： implications for endometrial pathology and beyond[J]. Hum Reprod Update，2015，21：748-761.

[2] Markee JE. Menstruation in intraocular transplants in the rhesus monkey[J]. Contr Embryol Carnegie Instn，1940，177：211-308.

[3] Semenza GL，Wang GL. A nuclear factor induced by hypoxia via de novo protein synthesis binds to the human erythropoietin gene enhancer at a site required for transcriptional activation[J]. Mol Cell Biol，1992，12：5447-5454.

[4] Wang GL，Jiang BH，Rue EA，et al. Hypoxia-inducible factor 1 is a basic-helix-loop-helix-PAS heterodimer regulated by cellular O2 tention[J]. Proc Natl Acad Sci USA，1995，92：5510-5514.

[5] Martin C，Yu AY，Jiang BH，et al. Cardiac hypertrophy in chronically anemic fetal sheep： Increased vascularization is associated with increased myocardial expression of vascular endothelial growth factor and hypoxia-inducible factor 1[J]. Am J Obstet Gynecol，1998，178： 527-534.

[6] Thom R，Rowe GC，Jang C，et al. Hypoxic induction of vacular endothelial growth factor(VEGF) and angiogenesis in muscleby truncated peroxisome proliferator-activated receptor coactivator(PGC)-1α[J]. Biol Chem，2014，289：8810-8817.

[7] Smith SK. Angiogenesis，vascular endothelial growth factor and the endometrium[J]. Hum Reprod Update，1998，4： 509-519.

[8] Rogers PA，Lederman F，Taylor N. Endometrial microvascular growth in normal and dysfunctional states[J]. Hum Reprod Update，1998，4：503-508.

[9] Punyadeera C，Thijssen VL，Tchaikovski S，et al. Expression and regulation of vascular endothelial growth factor ligands and receptors during menstruation and post-menstrual repair of human endometrium[J]. Mol Hum Reprod，2006，12：367-375.

[10] Chennazhi KP，Nayak NR. Regulation of angiogenesis in the primate endometrium： vascular endothelial growth factor[J]. Semin Reprod Med，2009，27：80-89.

[11] Maybin J A，Hirani N，Brown P，et al. The regulation of vascular endothelial growth factor by hypoxia and prostaglandin F2α during human endometrial repair[J]. J Clin Endocrinol Metab，2011，96：2475-2483.

[12] Tsuzuki T，Okada H，Cho H，et al. Hypoxic stress simultaneously stimulates vascular endothelial growth factor via hypoxia-inducible factor-1alpha and inhibits stromal cell-derived factor-1 in human endometrial stromal cells[J]. Hum Reprod，2012，27：523-530.

[13] 莊太鳳，陳西華，賀斌，等. HIF1A與VEGF在小鼠月經(jīng)樣模型的表達(dá)與共定位[J]. 生殖醫(yī)學(xué)雜志，2017，26：808-813.

[14] 曹惠子，陳西華，賀斌，等.環(huán)氧合酶在小鼠子宮內(nèi)膜崩解過程中的定位[J]. 基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué)，2015，34：304-307.

[15] 胡琳莉. 子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞分化過程中細(xì)胞周期界面的調(diào)控機制研究[D]. 武漢：華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬同濟醫(yī)院，2009：13-22.

[16] Zhang J，Salamonsen LA. Expression of hypoxia-inducible factors in human endometrium and suppression of matrix metalloproteinases under hypoxic conditions do not support a major role for hypoxia in regulating tissue breakdown at menstruation[J]. Hum Reprod，2002，17：265-274.

[17] Critchley HO，Osei J，Henderson TA，et al. Hypoxia-inducible factor-1alpha expression in human endometrium and its regulation by prostaglandin E-series prostanoid receptor 2(EP2)[J]. Endocrinology，2006，147：744-753.