李芳玉，夏小婷，賈玉堂，黨瑞華，陳 宏，雷初朝*

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物科技系統(tǒng)，陜西 楊凌 712100；2.安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，安徽 合肥 230031)

中國(guó)黃牛是指除牦牛和水牛以外的所有家牛，起源上包括普通牛和瘤牛兩個(gè)牛種，二者的共同祖先是原牛[1]。作為世界牛品種資源寶庫(kù)的重要組成部分，我國(guó)地方黃牛品種具有豐富的遺傳多樣性。1986年，邱懷[2]在《中國(guó)牛品種志》將中國(guó)地方黃牛品種按照地理分布區(qū)域的不同，把中國(guó)黃牛分為北方黃牛、中原黃牛和南方黃牛3大類。大別山牛以分布在大別山而定名，是南方黃牛代表品種之一，屬于役肉兼用型牛。主要產(chǎn)區(qū)為湖北省大別山西部的黃陂﹑大悟﹑英山﹑羅田﹑紅安﹑麻城和安徽省大別山東部的金寨﹑岳西﹑六安﹑舒城﹑桐城﹑潛山﹑太湖﹑宿松等縣。大別山牛具有適應(yīng)性好、抗病力強(qiáng)、耐粗飼等優(yōu)點(diǎn)，對(duì)高溫、高濕和寒冷具有較強(qiáng)的耐受性，經(jīng)改良后雜交優(yōu)勢(shì)明顯，是我國(guó)優(yōu)良地方品種之一。 Y染色體由雄性特異區(qū)(MSY)和擬常染色體區(qū)(PAR)兩部分組成，其中MSY區(qū)在減數(shù)分裂時(shí)不與X染色體發(fā)生重組，具有父系遺傳特性，且Y染色體的單倍型完整，具有較低的突變率，不易受重組和回復(fù)突變等因素影響，是探明父系遺傳多樣性、起源和馴化歷史等研究的理想工具[3]。利用位于Y染色體MSY區(qū)的單核苷酸多態(tài)性(Y-SNPs)和微衛(wèi)星(Y-STRs)標(biāo)記可以確定牛的Y染色體單倍型組(即普通牛Y1和Y2單倍型組，瘤牛Y3單倍型組)，對(duì)闡明家牛的遺傳多樣性、群體結(jié)構(gòu)以及父系起源歷史發(fā)揮了重要作用。根據(jù)以往的一些研究表明[1,4]，利用Y-SNPs可以區(qū)分Y1、Y2和Y3三種單倍型組，而利用Y-STRs可以更精細(xì)地區(qū)分每個(gè)單倍型組中豐富的單倍型。 常振華等[4]基于Y-SNPs標(biāo)記(DDX3Y-7、UTY-19、ZFY-9和ZFY-10)和 Y-STRs標(biāo)記(INRA189和BM861)對(duì)16個(gè)中國(guó)地方黃牛品種284頭公牛進(jìn)行了父系遺傳多樣性及起源分析，結(jié)果在16個(gè)黃牛品種中僅發(fā)現(xiàn)普通牛Y2和瘤牛Y3單倍型組，未檢測(cè)到普通牛Y1單倍型組，得出結(jié)論為中國(guó)黃牛存在普通牛Y2和瘤牛Y3兩種父系起源，普通牛在北方占優(yōu)勢(shì)，瘤牛主要分布在南方，中原地區(qū)為二者交匯處。但是其研究并未涉及到大別山牛。本研究利用2個(gè)Y-SNPs標(biāo)記UTY-19和ZFY-10及2個(gè)Y-STRs標(biāo)記INRA189和BM861對(duì)49頭大別山牛公牛進(jìn)行多態(tài)性檢測(cè)，通過分析大別山牛Y染色體的單倍型組成，來探明該品種的遺傳多樣性、群體遺傳結(jié)構(gòu)及父系起源。

1 材料與方法

1.1 采樣及基因組DNA提取

在安徽省太湖縣大別山牛保種場(chǎng)采集大別山牛公牛的耳組織低溫保存帶回實(shí)驗(yàn)室，常規(guī)酚-氯仿法提取基因組DNA，稀釋濃度至10～20 ng/μL，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 引物合成和PCR擴(kuò)增

參照G?therstr?m等[5]和Ginja等[6]報(bào)道的2個(gè)家牛Y-SNPs標(biāo)記(即UTY-19和ZFY-10)以及Edwards等[7]的研究中的Y-STRs標(biāo)記(INRA189和BM861)合成四對(duì)引物(表1)，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 家牛2個(gè)Y-SNPs位點(diǎn)及2個(gè)Y-STRs位點(diǎn)的名稱、位置、退火溫度與引物序列

25 μL PCR體系：2×PrimeSTAR Max Premix (上海寶生物公司)10.5 μL，上、下游引物(10 pmol/L)各0.5 μL，模板DNA 1 μL，超純水12.5 μL。PCR反應(yīng)程序：98℃變性10 s，X℃(表1)退火15 s，72℃延伸10 s，35個(gè)循環(huán)，后冷卻至4℃保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)過1.5%瓊脂糖凝膠(含 GoldView 核酸染料)電泳后，凝膠成像系統(tǒng)拍照檢測(cè)。

1.3 測(cè)序、單倍型組分型及單倍型頻率計(jì)算

將Y-SNPs標(biāo)記的PCR純化產(chǎn)物送生工生物工程(上海)股份有限公司，用3730XL型DNA測(cè)序儀(Applied Biosystems公司)進(jìn)行正、反向測(cè)序，測(cè)序結(jié)果用Chromas 2.3軟件進(jìn)行查看和校正，得到每頭大別山牛公牛的2個(gè)Y-SNPs標(biāo)記(UTY-19和ZFY-10)測(cè)序序列。2個(gè)Y-STRs標(biāo)記的PCR產(chǎn)物送生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行熒光分型，獲得INRA189和BM861的等位基因大小。根據(jù)Y-SNPs標(biāo)記和Y-STRs標(biāo)記的數(shù)據(jù)聯(lián)合分析，獲得大別山牛公牛的單倍型，再用Arlequin 3.0軟件進(jìn)行單倍型多樣度計(jì)算。

2 結(jié)果與分析

通過對(duì)49頭大別山牛公牛的2個(gè)Y-SNPs(UTY-19和ZFY-10)標(biāo)記的測(cè)序分析以及參考G?therstr?m等[5]和Ginja等[6]對(duì)家牛Y染色體單倍型組的判定標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)果表明：這2個(gè)Y-SNPs標(biāo)記在49頭大別山牛中均沒有多態(tài)性，與G?therstr?m等[5]對(duì)家牛Y1、Y2、Y3單倍型組的判定標(biāo)準(zhǔn)相比，其中UTY-19標(biāo)記發(fā)現(xiàn)一個(gè)對(duì)應(yīng)的A 堿基，在ZFY-10標(biāo)記發(fā)現(xiàn)1個(gè)對(duì)應(yīng)的T堿基和1個(gè)GT插入/缺失，表明49頭大別山牛只包含Y3一種單倍型組(表2)。對(duì)49頭大別山牛公牛的2個(gè)Y-STRs(INRA189和BM861)標(biāo)記進(jìn)行多態(tài)性分析，結(jié)果顯示，INRA189只有一個(gè)等位基因，大小為88 bp，而BM861也只有一個(gè)大小為156 bp的等位基因?！浇Y(jié)合Y-SNPs和Y-STRs標(biāo)記確定大別山牛的單倍型為Y3-88-156(表2)，說明大別山牛只有一個(gè)瘤牛父系起源。大別山牛的單倍型多樣度為0，說明其父系遺傳多樣性很低，遺傳基礎(chǔ)非常穩(wěn)定。

表2 大別山牛的Y染色體單倍型

3 討論

利用Y-SNPs標(biāo)記可以判斷家牛的Y1、Y2和Y3單倍型組，而Y-STRs標(biāo)記可以反映黃牛3種單倍型組內(nèi)豐富的Y染色體單倍型與遺傳多樣性。將Y-SNPs與Y-STRs分子標(biāo)記結(jié)合使用可以完整地反映Y染色體單倍型結(jié)構(gòu)，這種方法目前已經(jīng)廣泛用于家牛的遺傳多樣性和父系起源研究[3]。Edwards等[7]利用Y-SNPs與Y-STRs方法研究了世界范圍的138個(gè)牛品種，分析了不同品種Y染色體單倍型的地理分布情況，發(fā)現(xiàn)歐洲牛只擁有普通牛單倍型組，而瘤牛單倍型組主要分布在亞洲西南部。Li等[8]對(duì)16個(gè)中國(guó)地方黃牛品種共302頭黃牛公牛的4個(gè)Y-SNPs標(biāo)記(DDX3Y-7、ZFY-9、ZFY-10和UTY-19)和2個(gè)Y-STRs標(biāo)記(INRA189和BM861)進(jìn)行了多態(tài)性分析，與常振華等[4]的結(jié)論一致，但是卻發(fā)現(xiàn)有些個(gè)體含有Y1單倍型組，推測(cè)在中國(guó)黃牛中低頻率的Y1單倍型組可能是由于外來牛品種的雄性滲入的原因[8]。趙曉誠(chéng)等[9]利用Y-SNPs標(biāo)記分析陜西嶺南牛的遺傳多樣性，發(fā)現(xiàn)嶺南牛屬于南方黃牛類型，有普通牛Y2和瘤牛Y3 兩個(gè)父系起源，尤以瘤牛起源為主。

本研究中，利用Y-SNPs與Y-STRs分子標(biāo)記相結(jié)合的方法對(duì)大別山牛的Y染色體多態(tài)性進(jìn)行研究，分析其遺傳多樣性及父系起源。利用Y-SNPs標(biāo)記確定大別山牛只有一個(gè)Y3單倍型組，利用Y-STRs標(biāo)記的等位基因大小確定了大別山牛Y3單倍型組中詳細(xì)的單倍型，結(jié)果顯示49頭大別山牛全部為Y3-88-156單倍型，單倍型頻率為1，說明大別山牛只有一個(gè)瘤牛父系起源。Jia等[10]利用mtDNA D-loop序列研究六個(gè)亞洲國(guó)家家牛的母系起源，其中對(duì)3頭大別山牛進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)3頭大別山牛均為瘤牛I1支系，結(jié)合本文研究結(jié)果，說明從父系和母系角度都支持大別山牛為瘤牛起源。

單倍型多樣度是衡量一個(gè)群體變異程度的重要指標(biāo)。Li等[8]對(duì)16個(gè)中國(guó)地方黃牛品種共302頭黃牛公牛的父系遺傳多樣度表明，各個(gè)品種的平均單倍型多樣度值為0.683±0.013；而本研究中大別山牛的單倍型頻率為1，單倍型多樣度為0，說明大別山牛的父系遺傳多樣性很低，父系遺傳單一，品種很純。由于大別山牛所處地理位置較為偏僻，與外界基因交流少，牛群多為封閉性選育和小群飼養(yǎng)，公牛有效群體較小等原因?qū)е缕溥z傳多樣性很低。因此，應(yīng)該樹立正確的品種資源保護(hù)意識(shí)，建立健全大別山牛保種體系，從而使這一優(yōu)良種質(zhì)資源得到有效保護(hù)和利用。

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