于德彬， 李志剛， 劉 鵬， 向殿軍

(內(nèi)蒙古民族大學農(nóng)學院，內(nèi)蒙古通遼 028042)

大豆(GlycinemaxL.)富含蛋白質(zhì)和異黃酮，是一種糧油兼用作物，亦可用于飼料、工業(yè)原料和藥用[1]。隨著經(jīng)濟的發(fā)展和人們生活水平的提高，居民對植物油脂和肉制品的需求逐年增多，導致我國大豆需求量逐年增加。2016年我國進口轉(zhuǎn)基因大豆8 391萬t，較2015年增加222萬t，對外依賴度已經(jīng)高達87%[2]。相反，我國大豆種植面積卻在減少，主要歸因于國產(chǎn)大豆產(chǎn)量低，種植效益遠不如水稻、玉米等作物，以及國外轉(zhuǎn)基因大豆進口沖擊。提高國產(chǎn)大豆產(chǎn)量是解決這一嚴峻問題的重要途徑之一。

雜種優(yōu)勢是生物界普遍存在的一種現(xiàn)象，已經(jīng)在高粱、玉米、水稻等多種糧食作物和蔬菜中得到廣泛的應用，是提高作物產(chǎn)量和加速植物遺傳改良進程的重要途徑之一。大量研究結(jié)果表明，利用大豆雜交種可提高大豆產(chǎn)量[3-4]。雜交豆1號是世界上第1個通過審定的大豆雜交種，由吉林省農(nóng)業(yè)科學院趙麗梅等利用“三系”法選育，2年區(qū)試平均較對照增產(chǎn)21.9%[5]。吉林省農(nóng)業(yè)科學院于2006年又選育審定了2年區(qū)試平均較對照增產(chǎn)22.7%的雜交豆2號新品種[6]，之后他們的雜交豆3號、雜交豆5號、吉育607、吉育609等多個大豆雜交種相繼通過審定[7-10]。雜優(yōu)豆1號是世界上第1個通過審定的夏大豆雜交種，由安徽省農(nóng)業(yè)科學院選育，2年區(qū)試平均較對照增產(chǎn)15.37%[11]，之后他們又選育審定了2年區(qū)試平均較對照增產(chǎn)5.81%的雜優(yōu)豆2號高蛋白雜交大豆品種[12]。

然而，大豆雜交種目前還沒有得到大規(guī)模運用，其主要原因是受制于大豆制種技術(shù)，制種的產(chǎn)量低是限制大豆雜交種推廣的主要因素。因此選育優(yōu)良的不育系(龍骨瓣開張時間長及程度大、柱頭壽命長、蜜腺引誘昆蟲造訪的特性等)、保持系和恢復系(花粉數(shù)量多、散粉性好、龍骨瓣開張時間長及程度大、花粉壽命長、蜜腺引誘昆蟲造訪的特性等)，選配高產(chǎn)的雜交組合，是推動大豆雜交種商業(yè)化生產(chǎn)的主要途徑。本研究對3個大豆恢復系及8個大豆不育系的花器官形態(tài)特征進行了研究，同時對不育系和恢復系的小孢子發(fā)育過程及花蕾中保護酶活性進行了測定分析，旨在揭示大豆雄性不育系小孢子敗育的細胞學機制和生化特性，為大豆雄性不育系的選育及利用、推動大豆雜交種的商業(yè)化生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料為8個大豆雄性不育系和3個大豆恢復系，由吉林省農(nóng)業(yè)科學院大豆研究中心提供。8個大豆雄性不育系命名為M1、M2、M3、N4、M5、M6、M7、M8；3個大豆恢復系命名為N1、N2、N3。

1.2 試驗設(shè)計

大豆雄性不育系和恢復系材料于2016年春種植于內(nèi)蒙古民族大學北區(qū)試驗教學基地。試驗地位于內(nèi)蒙古通遼地區(qū)，年平均降水量361.6 mm，無霜凍期150 d，≥10 ℃活動積溫3 200 ℃。試驗土壤類型以黃沙土和栗沙土為主，0～20 cm 土層土壤空隙度為34%～38%、有機質(zhì)含量為 5.31 g/kg、堿解氮含量為42.4 mg/kg，前茬為玉米，肥力中等。試驗采用裂區(qū)設(shè)計，3個恢復系為主區(qū)，8個不育系為副區(qū)，共有3個區(qū)組，重復3次，種植在網(wǎng)室且相互隔離良好的9個小區(qū)，每個小區(qū)單獨分離成8個地塊，每個地塊面積 5 m2，長5 m，寬1 m，行距0.5 m，株距0.15 m，每個小區(qū)都有網(wǎng)室隔離，防止花期昆蟲串粉，試驗面積共計450 m2，采用穴播的方式，每穴保證出苗2株，灌排水條件良好，5月21日出苗，待開花期進行人工放蜂處理。

1.3 調(diào)查與測定項目

花長、旗瓣寬、花瓣大小和龍骨瓣開張度(ODKP)調(diào)查在盛花期上午進行。從6月21日開始，每5 d從選定掛好標簽的10株大豆上取1次樣，采樣的位置是植株生長點，每次采集20～30個大豆花芽，放入裝有FAA固定液的離心管中，固定24 h以上，按陳利娜等的方法[13]制作石蠟切片，用于觀察雄性不育系和恢復系的花原基、花萼原基、花瓣原基及雌雄蕊原基、雌雄蕊和花粉粒的發(fā)育結(jié)構(gòu)。采集小花蕾、中花蕾和大花蕾時期的花芽樣本，用于檢測8個不育系與3個恢復系中過氧化物酶(POD)、超氧化物歧化酶(SOD)和過氧化氫酶(CAT)的活性以及丙二醛(MDA)含量。各指標進行3次生物學重復?？寡趸?POD、SOD、CAT)活性分別采用愈創(chuàng)木酚法[14]、氮蘭四唑(NBT)光還原法[15]和紫外分光光度法[16]進行測定。MDA含量參照Hu等的方法[17]進行測定。

1.4 數(shù)據(jù)分析

利用SPSS 16.0軟件統(tǒng)計各處理3次重復數(shù)據(jù)的平均值、各測定3次重復數(shù)據(jù)的標準差以及各指標數(shù)據(jù)間的差異顯著性，利用Excel軟件繪制柱形圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 大豆雄性不育系和恢復系的花芽分化

利用石蠟切片法，對不同發(fā)育階段的大豆花芽進行解剖結(jié)構(gòu)觀察，綜合花芽原基形態(tài)變化和花芽分化的特點，可將大豆的花芽分化過程分為5個時期，即花原基形成期、花萼原基形成期、花瓣原基及雌雄蕊原基形成期、雌雄蕊結(jié)構(gòu)形成期和花粉粒形成期(圖1)。在花芽分化的第1個時期，恢復系N1的花原基發(fā)育正常，但不育系M2的發(fā)育不完整，輸導組織的發(fā)育進程比恢復系發(fā)展緩慢(圖1-A)。在花萼原基形成期，恢復系的萼片結(jié)構(gòu)發(fā)育完整，細胞排列的緊密，而不育系的萼片原基形成的細胞排列疏松(圖1-B)?；ò暝痛菩廴镌男纬善谌鐖D1-C所示，恢復系N1開始分化出10個花粉囊和1枚雌蕊，發(fā)育走向成熟，不育系M2的花瓣原基和雌雄蕊原基形成期的維管束細胞不夠明顯。在雌雄蕊結(jié)構(gòu)形成期，恢復系N1的雄蕊分化成10枚，10個花粉囊里開始形成花藥，雌蕊只有1枚，而不育系M2維管束細胞排列不緊密，也能夠分化花藥，但花粉粒形狀不規(guī)則，可能是退化的花藥(圖1-D)?；ㄑ糠只淖詈?個時期如圖1-E所示，恢復系N1能繼續(xù)發(fā)育，10個花粉囊里產(chǎn)生大小一致、飽滿的圓形或橢圓形的花粉粒，且花粉粒數(shù)量比較多，不育系M2產(chǎn)生的花粉粒數(shù)量比較少，大小不等，形狀不規(guī)則，有的花粉粒呈三角形，有的呈空癟狀，有的呈聚集成塊的退化花粉。

2.2 大豆雄性不育系和恢復系花器外部形態(tài)比較

由表1可知，花長和旗瓣寬在恢復系和不育系及多重處理中均達到極顯著差異水平，花瓣大小在不育系和恢復系中均達到極顯著差異水平，在多重處理上沒有差異。龍骨瓣開張度在不育系中達到極顯著差異水平，在恢復系和多重處理上沒有差異。

表1花長、旗瓣寬、花瓣大小、龍骨瓣開張度的方差分析

注：“**”表示差異極顯著(P<0.01)。

由表2可知，主處理的3個恢復系中，N3的花長、旗瓣寬和花瓣面積最大，分別為8.28 mm、6.75 mm和56.04 mm2，與其他2個恢復系存在極顯著差異。副處理的8個不育系中，M4的花長、旗瓣寬和花瓣面積最大，分別為9.19 mm、7.12 mm 和65.53 mm2，明顯高于其他不育系；M5的龍骨瓣開張度最小，而M2的龍骨瓣開張度最大，為M7的3.05倍。

表2主處理和副處理的花長、旗瓣寬、花瓣大小及龍骨瓣開張度

注：同列數(shù)據(jù)后不同小寫字母、大寫字母分別表示在0.05、0.01 水平上差異顯著。表3同。

裂區(qū)設(shè)計試驗結(jié)果(表3)顯示，N3M4處理的花長最大，達9.59 mm，是最小處理N2M8的1.48倍。N3M4處理的旗瓣寬最大，達7.66 mm，明顯高于其他處理。N3M4的花瓣面積最大，達73.51 mm2，與其他處理均差異極顯著。N2M5、N1M5和N3M5處理的龍骨瓣開張度都為零，而N3M2處理的龍骨瓣開張度最大，為8.38%，比N1M7高210.4%。綜合花長、旗瓣寬、花瓣大小和龍骨瓣開張度的處理效應，N3M4處理最好。

2.3 超氧化物歧化酶(SOD)活性變化

大豆不同發(fā)育時期花蕾中SOD活性的測定結(jié)果(圖2)顯示，除不育系M7和M8外，所有不育系大、中、小花蕾的SOD活性均比3個恢復系高。恢復系N2和N3花蕾的SOD活性都隨著花蕾的發(fā)育進程而逐漸上升，而恢復系N1中花蕾的SOD活性要比小花蕾和大花蕾高。不育系M2的SOD活性的最高值出現(xiàn)在中花蕾時期，而其余7個不育系SOD活性的最高值均出現(xiàn)在大花蕾時期。

表3裂區(qū)處理間花長、旗瓣寬、花瓣大小和龍骨瓣開張度

2.4 過氧化物酶(POD)活性變化

POD活性的測定結(jié)果(圖3)表明，在小花蕾時期，有6個不育系(M1、M2、M3、M5、M6和M7)的POD活性顯著高于3個恢復系；而在中花蕾和大花蕾時期，8個不育系的POD活性均明顯高于3個恢復系?；謴拖礜2的POD活性隨著花蕾的發(fā)育逐漸降低，恢復系N3的POD活性呈先降低后升高的趨勢，而恢復系N1的POD活性呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。多數(shù)不育系的POD活性隨著花蕾的發(fā)育而逐漸增加，而不育系M5花蕾中POD活性則不斷減弱；不育系M2和M8的POD活性在小花蕾階段稍低，到中花蕾階段有一定幅度上升，而在大花蕾階段又開始下降。

2.5 過氧化氫酶(CAT)活性變化

圖4結(jié)果顯示，不育系M2、M4、M5、M6和M7的CAT活性隨著花蕾的發(fā)育而呈現(xiàn)遞增趨勢；不育系M8的CAT活性在小花蕾和大花蕾時期較低，而在中花蕾時期較高；不育系M1和M3的CAT活性隨著花蕾的發(fā)育呈現(xiàn)一定的規(guī)律，即在小花蕾階段CAT活性稍高，到中花蕾階段CAT活性稍有降低，而在大花蕾階段CAT活性又開始增加，達到最高值?；謴拖礜1和N2的CAT活性隨著花蕾的發(fā)育表現(xiàn)出先增加后下降的趨勢，而恢復系N3的CAT活性最高值出現(xiàn)在大花蕾時期。隨著花蕾的發(fā)育，所有不育系的CAT活性都明顯低于3個恢復系。

2.6 丙二醛(MDA)含量變化

MDA含量的測定結(jié)果(圖5)顯示，在花蕾發(fā)育的各個時期，不育系的MDA含量均顯著高于恢復系。3個恢復系的MDA含量均隨花蕾的發(fā)育表現(xiàn)出增長趨勢。8個不育系的MDA含量均在大花蕾時期達到最高，但其變化規(guī)律有所不同。其中，3個不育系(M1、M2和M8)的MDA含量隨著花蕾的發(fā)育表現(xiàn)出升高趨勢，其余5個不育系的MDA含量隨著花蕾的發(fā)育表現(xiàn)出先降后升的趨勢。

3 討論與結(jié)論

玉米、油菜、高粱、水稻等作物利用風媒傳粉、昆蟲傳粉或人工授粉中的一種或幾種均實現(xiàn)了雜交種的大規(guī)模商業(yè)化生產(chǎn)。作為一種比較嚴格的自花授粉作物，大豆特殊的花器結(jié)構(gòu)特征決定了大豆的天然異交率一般低于1%，所以無論是不育系的選育及繁殖，還是雜交種的生產(chǎn)，其效率都比較低。大豆花數(shù)量較多，但是花器較小，附著的花粉少而黏重，另外花朵開放時，柱頭和花藥被龍骨瓣和翼瓣緊緊包住而不外露，大面積異花間通過風媒傳粉和人工授粉是難以實現(xiàn)的。目前大豆雜交種的制備主要通過昆蟲(苜蓿切葉蜂、薊馬等)進行傳粉[5，18]，所以對雜交種生產(chǎn)的氣候條件較為苛刻。良好的環(huán)境條件能使大豆花開放度較高，散粉性能好，分泌花蜜多，傳粉昆蟲活躍。內(nèi)蒙古通遼地區(qū)年平均降水量361.6 mm，年蒸發(fā)量1 705.6 mm，屬半干旱大陸性季風氣候[19]，大豆開花期少雨，且耕地有良好的地下水灌溉條件，所以較適合大豆雜交種的生產(chǎn)。在該環(huán)境下，恢復系中，N3的花長、旗瓣寬和花瓣面積最大，可達8.28 mm、6.75 mm和56.04 mm2；不育系中，M4的花長、旗瓣寬和花瓣面積最大，可達9.19 mm、7.12 mm 和65.53 mm2。

參考文獻：

[1]郝東旭，胡景輝. 轉(zhuǎn)基因技術(shù)及在大豆中的應用研究[J]. 華北農(nóng)學報，2013，28(增刊1)：41-44.

[2]錢云開，高 飛，王海洋，等. 16種轉(zhuǎn)基因大豆品系的實時熒光PCR法篩查[J]. 中國油脂，2017，42(2)：141-145.

[3]白志元，張瑞軍，雷夢林，等. 不同株系制種對大豆雜交種農(nóng)藝性狀的影響[J]. 山西農(nóng)業(yè)科學，2016，44(8)：1055-1058，1072.

[4]王志新，郭 泰，趙麗梅，等. 大豆雜交種雜種優(yōu)勢分析[J]. 中國農(nóng)學通報，2010，26(15)：185-189.

[5]趙麗梅，孫 寰，馬春森，等. 大豆昆蟲傳粉研究初探[J]. 大豆科學，1999，18(1)：73-76.

[6]彭 寶，趙麗梅，王曙明，等. 雜交豆2號選育及高產(chǎn)制種技術(shù)研究[J]. 吉林農(nóng)業(yè)科學，2008，33(2)：3-4，7.

[7]彭 寶，趙麗梅，張偉龍，等. 大豆雜交種雜交豆3號選育報告[J]. 吉林農(nóng)業(yè)科學，2010，35(6)：4-5.

[8]彭 寶，張連發(fā)，張偉龍，等. 大豆雜交種雜交豆5號選育報告[J]. 吉林農(nóng)業(yè)科學，2011，36(6)：7-8.

[9]彭 寶，張偉龍，張井勇，等. 雜交大豆新品種吉育607選育報告[J]. 大豆科技，2013(4)：31-33.

[10]彭 寶，張春寶，嚴 昊，等. 雜交大豆吉育609選育及栽培要點[J]. 大豆科技，2016(4)：29-31.

[11]張 磊，戴甌和，黃志平，等. 雜交大豆雜優(yōu)豆1號選育[J]. 大豆通報，2007(2)：14-16.

[12]黃志平，李杰坤，張 磊，等. 高蛋白雜交大豆“雜優(yōu)豆2號”選育及栽培技術(shù)[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學，2013，41(5)：2029，2133.

[13]陳利娜，薛 輝，李好先，等. 石榴花芽石蠟切片制作方法的改良[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學，2017，45(2)：1-3，16.

[14]Jiang M，Zhang J. Effect of abscisic acid on active oxygen species，antioxidative defence system and oxidative damage in leaves of maize seedlings[J]. Plant and Cell Physiology，2001，42(11)：1265-1273.

[15]Tang W，Page M. Overexpression of the arabidopsisAtEm6 gene enhances salt tolerance in transgenic rice cell lines[J]. Plant Cell，Tissue and Organ Culture (PCTOC)，2013，114(3)：339-350.

[16]劉硯韜，王振偉，張伶俐. 過氧化氫酶活性測定的新方法[J]. 華西藥學雜志，2013，28(4)：403-405.

[17]Hu T Z，Zhou N，F(xiàn)u M L，et al. Characterization ofOsLEA1aand its inhibitory effect on the resistance ofE.colito diverse abiotic stresses[J]. International Journal of Biological Macromolecules，2016，91：1010-1017.

[18]丁德榮，蓋鈞鎰. 南方地區(qū)大豆雄性不育材料的傳粉昆蟲媒介及其傳粉異交結(jié)實程度[J]. 大豆科學，2000，19(1)：74-79.

[19]邢明華，寶烏日其其格，于宏君，等. 內(nèi)蒙古通遼市干旱災害及應對措施[J]. 畜牧與飼料科學，2016，37(10)：61-62.

[20]鄭 欣，劉夏囡，鄭勝男，等. 鎘脅迫下超氧陰離子對水稻幼苗根系生長和生長素分布動態(tài)變化的影響[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學，2017，45(7)：55-58.

[21]胡月芳. 淮山多糖超聲輔助提取及清除超氧陰離子自由基的作用[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學，2017，45(4)：144-146.

[22]薛興華，司慶永，龔 寧 .外源Ca2+對金線蘭抗氧化酶活性及其同工酶的影響[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學，2016，44(4)：229-232.

[23]鄭世英，王麗燕，張海英. 鎘脅迫對兩個大豆品種抗氧化酶活性及丙二醛含量的影響[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學，2007(5)：53-55.

[24]劉齊元，程元強，朱肖文，等. 雄性不育煙草花蕾中SOD、POD和CAT活性研究[J]. 中國煙草學報，2011，17(5)：34-39.

[25]劉金兵，侯喜林，陳曉峰，等. 甜椒胞質(zhì)雄性不育系及其保持系生化特性研究[J]. 園藝學報，2006，33(3)：629-631.

[26]劉麗華，李保國，齊國輝，等. 雄性不育板栗雄花序敗育與幾種酶活性及MDA含量的關(guān)系[J]. 林業(yè)科學，2007，43(4)：121-124.

[27]趙前程，耿 宵，陳雪平，等. 花椰菜雄性不育系小孢子發(fā)育過程及其POD活性[J]. 華北農(nóng)學報，2002，17(2)：108-111.