李 璐， 張昭其， 龐學群， 王海波

(1.華南農(nóng)業(yè)大學生命科學學院，廣東廣州 510642； 2.華南農(nóng)業(yè)大學園藝學院，廣東廣州 510642； 3.廣東食品藥品職業(yè)學院，廣東廣州 510520)

熱處理是提高果蔬抗冷性的最有效采后處理之一，熱處理主要通過誘導CBF冷信號通路基因表達增強進而提高香蕉果實的抗冷性[1-2]。病害是熱帶亞熱帶果蔬貯運保鮮中存在的主要問題之一，值得注意的是，熱處理也能夠大大提高香蕉的抗病性。我們推測，熱處理在誘導抗冷性和抗病性方面可能具有共同的機理。因此，研究CBF冷信號通路基因在熱處理誘導香蕉果實抗病中的作用，將有助于進一步了解采后香蕉果實抗病機理。研究表明，熱處理能有效提高采后果實的抗病性。例如，60 ℃ 30～60 s的熱水浸泡處理能顯著地降低加利福尼亞桃、油桃、李子等水果褐斑病發(fā)生率[3]。熱處理也可有效抑制蘋果、梨果實貯藏過程中病蟲害及腐爛的發(fā)生[4]，使其在長期的低溫冷藏過程中仍然保持較好的貯藏品質(zhì)。龐學群等進一步研究發(fā)現(xiàn)，將香蕉果實進行熱處理后恢復至室溫一段時間再接種外源炭疽菌孢子，發(fā)現(xiàn)熱處理后的恢復對于誘導果實的抗病性具有較好效果[5]。在冷信號途徑的研究過程中發(fā)現(xiàn)，CBF類基因作為冷信號通路的關(guān)鍵調(diào)控基因在提高植物抗冷性中起重要作用。模式植物上的研究表明，低溫轉(zhuǎn)錄因子CBF調(diào)控的信號傳導途徑可能是誘導植物抗冷性提高的最重要途徑，即ICE-CBF-COR通路。CBF是該途徑中基因表達的“主開關(guān)”，受ICE調(diào)控的CBF轉(zhuǎn)錄因子能夠特異結(jié)合啟動子中含有CRT/DRE(C-repeat/dehydration responsive element)的順式元件，可以激活下游一系列冷調(diào)節(jié)基因COR的表達，從而提高擬南芥等植物的抗寒性[6-9]。Peng等研究發(fā)現(xiàn)，高溫和低溫均能誘導CBF冷應(yīng)答途徑相關(guān)基因的表達[10]。4 ℃低溫誘導了蝴蝶蘭PaCBF1在4 h開始表達，24 h達到最高峰。在擬南芥中過表達PaCBF1，誘導了AtCOR6.6和RD29a表達的增強?？紤]到熱處理可同時誘導采后香蕉果實的抗病性和抗冷性，CBF類基因在采后香蕉果實抗病誘導過程中是否起到一定的作用還不清楚，需要進一步研究證實。熱水處理能否通過CBF冷應(yīng)答途徑從而提高香蕉果實的抗病性，目前尚無報道。本試驗著重在于探索CBF冷信號基因通路對病害脅迫的響應(yīng)，探討熱處理是否能通過CBF途徑途徑增強采后香蕉果實的抗病性，研究CBF冷信號通路的相關(guān)基因在熱水處理誘導香蕉抗病性中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料及處理

本試驗所使用的試驗材料為香蕉品種“巴西”(Musaspp. cv. Cavendish)，購自于廣東省廣州市南沙區(qū)香蕉園，采收飽滿度及成熟度為70%～80%的青硬綠熟香蕉，在果園進行初步落梳處理后立即運回實驗室，挑選大小均勻、無病蟲害及機械損傷的香蕉果指。先用清水對挑選后的香蕉果指進行清洗，再用濃度為0.1%漂白粉溶液和0.05%咪鮮胺溶液各浸泡5 min，晾干備用。

熱處理(hot water dipping，HWD)：將上述香蕉果實分為3份，其中1份浸入熱水處理機(體積為400 L)中，溫度為 52 ℃，時間為3 min，取出晾干，并接種炭疽病菌孢子，用聚乙烯薄膜袋(厚度0.03 mm)包裝后放入(20±2) ℃恒溫箱中貯藏，作為熱處理+接種處理組。另外2份香蕉果實在25 ℃水中浸泡3 min后，取出晾干，其中1份接種炭疽病菌孢子，用聚乙烯薄膜袋(厚度0.03 mm)包裝后放入(20±2) ℃恒溫箱中貯藏，作為接種處理組；將剩余的1份香蕉果實直接用聚乙烯薄膜袋(厚度0.03 mm)包裝后放入(20±2) ℃恒溫箱中作為對照組。每處理70個香蕉果指，重復3次。在0 h、3 h、5 d、8 d、12 d、14 d、16 d取樣備用。

炭疽病菌接種處理：炭疽病菌種由華南農(nóng)業(yè)大學園藝學院采后科學與技術(shù)系提供，菌種在馬鈴薯葡萄糖瓊脂平板培養(yǎng)基(PDA)上培養(yǎng)7 d后在超凈工作臺中用無菌水和刷子刷下粉紅色的孢子，在顯微鏡下觀察并用血球計數(shù)板計算孢子濃度，然后再用無菌水將孢子液稀釋到2×105CFU/mL的濃度。將配制好濃度的炭疽病菌接種到經(jīng)過常溫自來水浸泡過3 min的香蕉果指上，用接種針在香蕉果指的側(cè)面刺3個等距離的小孔，小孔的深度約1 mm，直徑約1 mm，間距約5 cm，用吸水紙吸去果皮表面的乳液，將10 μL懸浮孢子液滴入小孔中，接種面朝上放置于塑料筐中，再用聚乙烯薄膜袋(厚度 0.03 mm)包裝。

1.2 測定方法

1.2.1 實時熒光定量引物設(shè)計 從香蕉基因組數(shù)據(jù)庫(http：//banana-genome.cirad.fr/)中搜索并挑選CBF冷信號通路中的6個相關(guān)基因序列(表1)，設(shè)計實時熒光定量引物，驗證后備用。

表1引物序列

1.2.2 實時熒光定量PCR(qRT-PCR) 實時熒光定量PCR使用儀器為BIO-RAD CFX9600，采用TOYOBO THUNDERBIRD SYBR?qPCR Mix進行Real-time PCR擴增。qRT-PCR反應(yīng)體系(20 μL)包括10 μL SYBR-Green PCR Master Mix，0.25 μL上游(10 μmol/L)和0.25 μL下游引物(10 μmol/L)，2 μL稀釋的cDNA以及7.5 μL ddH2O。反應(yīng)條件為：95 ℃ 3 min；95 ℃ 10 s，59 ℃ 10 s，72 ℃ 20 s，循環(huán)數(shù)為40。為了確認產(chǎn)物的質(zhì)量和引物的特異性，在溶解曲線中分析了產(chǎn)物的Tm(分析溶解溫度為65～95 ℃)。利用基因Actin1[11]作為內(nèi)參基因。所有的qRT-PCR反應(yīng)根據(jù)內(nèi)參基因Actin1進行Ct值校準，目的基因的相對表達水平利用公式2-ΔΔCt進行計算，重復3次。

1.2.3 病斑的測定 以病斑擴展垂直2個方向的平均寬度計算病斑大小(mm)[5]。

1.2.4 脯氨酸的測定 測定方法主要參照Demiral等的實驗方法[12]，略有改動。

1.2.4.1 試劑 2.5%酸性茚三酮溶液、3%磺基水楊酸、冰乙酸、甲苯。

1.2.4.2 繪制標準曲線 分別配制1～10 μg/mL之間的6個點制作標準曲線，取2 mL標準溶液加2 mL 3%磺基水楊酸、2 mL冰乙酸和4 mL 2.5%茚三酮，沸水浴顯色30～60 min，冷卻。加4 mL甲苯萃取，靜置后取甲苯相測定 520 nm 下的吸光度(以甲苯為空白對照；D520 nm大小在0.2～0.8之間為佳，若值太高則可以用甲苯適當稀釋)，依據(jù)脯氨酸含量和相應(yīng)吸光度繪制標準曲線。

1.2.4.3 樣品的測定 脯氨酸的提?。喝∠憬豆?.5 g，5 mL 3%磺基水楊酸提取，沸水浴10 min，冷卻。5 000 r/min離心10 min，取上清液待測。

測定：取2 mL上清液，加2 mL水，下面步驟同繪制標曲方法一致。然后根據(jù)下式計算脯氨酸含量：

單位鮮質(zhì)量樣品中脯氨酸含量(μg/g)=2.5C/m。

式中：C為根據(jù)標曲得出樣品溶液中脯氨酸濃度(μg/mL)，m為樣品質(zhì)量(g)，2.5表示溶液體積為2.5 mL。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理 采用Sigmaplot 12.5軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 熱處理對采后香蕉果實病斑發(fā)展的影響

由圖1可見，采后香蕉果實在0 d時接種炭疽病菌種，接種病斑直徑為2 mm。隨著貯藏時間的推移，無論是對照組還是熱處理+接種組，所接種的病斑直徑均呈逐漸增大的趨勢，12 d后病斑明顯增大。在0～14 d，熱水處理+接種組的病斑發(fā)展緩慢，明顯低于對照組，但在16 d時病斑發(fā)展呈現(xiàn)出暴發(fā)的癥狀?？梢?，與對照組相比，熱處理能較好地誘導采后香蕉果實的抗病性。

2.2 熱處理對采后香蕉果實脯氨酸含量的影響

由圖2可見，對照組的脯氨酸含量在3 h變化基本不大，在5 d后脯氨酸含量開始上升；與對照相比，熱處理誘導了香蕉果實脯氨酸含量的提高，約提高70%左右，熱處理果實接種后進一步提高了脯氨酸含量，約是對照的3倍左右。

2.3 熱處理對香蕉果實MaICE表達的影響

由圖3可知，香蕉果實在常溫貯藏16 d，對照的MaICE基因表達逐漸升高，在5 d時出現(xiàn)峰值，之后呈現(xiàn)下降趨勢。果實接種處理和熱處理果實接種后的MaICE基因表達則一直呈現(xiàn)下降趨勢。在8 d時分別比對照組低了約90%和95%。結(jié)合病情指數(shù)(圖1)熱處理能夠明顯減輕病害暴發(fā)，但病害脅迫和熱處理誘導的抗病效果下調(diào)了MaICE基因的表達，推測該基因可能與病害響應(yīng)相關(guān)。

2.4 熱處理對香蕉果實DREB類基因表達的影響

由圖4可知，對照組中MaDREB1D基因在常溫貯藏5 d和16 d時有2個表達高峰，且在16 d時表達量較高；果實接種后在常溫貯藏14 d時有1個表達高峰，約為對照組的2.2倍；熱處理果實接種后在3 h、5 d處有較高的表達量，并且在后期14～16 d又有持續(xù)較高的表達量，在14 d時有1個表達高峰，約為對照組的2倍。對比MaDREB1D基因表達量可知，對照組在5～8 d表達量持續(xù)較高，同時在后期14～16 d表達量亦較高，推測與果實后熟有關(guān)；明顯病癥出現(xiàn)前，該基因在果實接種組比熱處理果實接種組表達高，后期各處理表達都提高了大約1倍。可以推測病害脅迫誘導了MaDREB1D基因的表達。

由圖5可知，在對照組常溫貯藏中MaDREB1E基因表達在5～8 d時達到1個高峰，之后呈現(xiàn)下降的趨勢；與對照組相比，果實接種后在常溫貯藏中MaDREB1E基因表達在3 h時達到1個高峰，表達量提高了50倍左右，之后呈現(xiàn)下降趨勢；熱處理果實接種后對于MaDREB1E基因表達同樣在3 h處有1個表達高峰，表達量提高了30倍左右，之后的8 d也有1個表達高峰期，接著呈現(xiàn)下降趨勢。從0～3 h基因表達可以推測病害脅迫或者接種機械傷誘導了MaDREB1E基因表達；從對照組在5～8 d表達量的提高分析也可能是貯藏過程中病害脅迫誘導了MaDREB1E基因表達。

由圖6可知，對照組在常溫貯藏5 d時有1個表達高峰；與對照組相比，果實接種后在常溫貯藏過程中表達量整體呈現(xiàn)平穩(wěn)上升趨勢，在16 d時提高了25倍左右；熱處理果實接種后3 h開始MaDREB1G基因表達處于較高的水平，并在8 d時達到表達高峰，到16 d時提高了20倍左右?？芍?，果實接種組和熱處理果實接種組均誘導了MaDREB1G基因表達的上調(diào)，這可能與貯藏過程中香蕉的病害脅迫有關(guān)。熱處理接種組的基因表達整體上高于果實接種組，可以推測在后期的貯藏過程中病害脅迫對于MaDREB1G基因表達有很強的誘導作用，同時MaDREB1G基因?qū)崽幚碚T導的抗病性也有一定的響應(yīng)。

由圖7可知，對照組在常溫貯藏下MaDREB3基因表達量呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢；與對照組相比，果實接種后在常溫貯藏下MaDREB3基因表達量也呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢，無明顯差異性；熱處理果實接種后在3 h有1個表達高峰，之后一直呈現(xiàn)下調(diào)趨勢，也無明顯的差異性?？梢酝茰y，病害對MaDREB3基因表達沒有誘導作用，MaDREB3基因?qū)崽幚碚T導的抗病性沒有響應(yīng)。

2.4 熱處理對香蕉果實MaCOR413表達的影響

由圖8可知，對照組在常溫貯藏下MaCOR413基因表達量呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢。與對照組相比，果實接種組和熱處理果實接種組在常溫貯藏下MaCOR413基因表達量也同樣呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢。對比基因表達量的趨勢，果實接種組和熱處理果實接種組在8～14 d表達量略高于對照組，但二者整體呈現(xiàn)下調(diào)趨勢，且無明顯差異性，可以推測病害和熱處理誘導的抗病性在8 d以后對MaCOR413基因表達有明顯的誘導作用。

3 討論與結(jié)論

熱處理常被用于香蕉、芒果等熱帶水果的采后處理[13-14]，可以顯著提高它們的抗冷和抗病能力[1，15]，然而，香蕉等水果的抗冷誘導機制是否與抗病誘導機制相關(guān)目前尚不清楚。本試驗通過比較熱處理對采后香蕉果實病斑大小和脯氨酸含量的影響，并同時分析了抗病誘導過程中誘導CBF冷信號通路基因的表達規(guī)律，表明熱處理可抑制炭疽病的發(fā)生，并發(fā)現(xiàn)抗病誘導與冷信號通路基因具有一定的關(guān)系。由于熱處理能夠提高采后芒果果實抗冷性蛋白的含量[16]，同時也能夠誘導采后香蕉果實DREB/CBF類轉(zhuǎn)錄因子基因表達產(chǎn)生抗冷性，但是在熱處理提高采后香蕉果實抗病性的同時是否也能夠誘導DREB/CBF類轉(zhuǎn)錄因子基因表達目前還不清楚。

脯氨酸含量的升高可以減輕桃果實、小麥等果實的冷害脅迫[17-18]。本研究結(jié)果表明，熱處理誘導的香蕉果實抗病性可以明顯降低接種炭疽病菌后的病斑直徑和促進脯氨酸含量的升高，表明熱處理提高了香蕉果實的抗病力和抗脅迫能力。DREB/CBF類轉(zhuǎn)錄因子即干旱應(yīng)答元件結(jié)合蛋白質(zhì)/C-重復序列結(jié)合子，是AP2/EREBP轉(zhuǎn)錄因子家族的一個亞家族，擁有保守的AP2結(jié)構(gòu)域，能夠特異性地與抗逆基因啟動子區(qū)域的DRE/CRT順式作用元件相結(jié)合，在干旱、低溫和高鹽等非生物脅迫條件下調(diào)節(jié)一系列下游逆境應(yīng)答基因的表達，是植物逆境適應(yīng)中的關(guān)鍵性調(diào)節(jié)因子[19]。DREB/CBF類轉(zhuǎn)錄因子在識別冷誘導響應(yīng)元件，干旱以及植物抵抗非生物脅迫過程中具有非常重要的作用[20-21]。然而，對于DREB/CBF類轉(zhuǎn)錄因子能否通過熱處理誘導的冷信號途徑進一步提高植物的抗病害能力，目前還不太清楚。有研究表明，對于DREB/CBF類轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)基因大豆植物，在干旱和水分正常的條件下，對生長在土壤中的疫霉菌、鐮刀菌、木霉菌、自生固氮菌等土壤中的真菌菌落和菌落直徑并沒有顯著的影響[22]。在茄子抗青枯病研究中，通過研究DREB/CBF類轉(zhuǎn)錄因子表明，也沒有抗青枯病防御應(yīng)答反應(yīng)[23]。有關(guān)研究表明，熱處理可以激活香蕉果實中與抗逆性相關(guān)的酶活，誘導抗逆性相關(guān)基因的表達，進而提高采后香蕉果實的抗冷性[24-25]和抗病性[5]，本試驗的結(jié)果中熱水處理誘導能夠提高采后香蕉果實抗病能力與之相類似。

冷信號通路基因?qū)Σ『γ{迫時有部分基因產(chǎn)生了響應(yīng)。通過分析可知MaDREB1D、MaDREB1E、MaDREB1G基因?qū)Σ『γ{迫和熱處理后接種炭疽病菌有一定的響應(yīng)，基因表達量在3 h處有所提高，然而并不是所有冷信號通路的基因表達量都呈現(xiàn)上調(diào)趨勢。MaDREB1D基因在病害脅迫貯藏3 h時有一個瞬時響應(yīng)，之后的貯藏期間都基本上是高表達的狀態(tài)。同樣，MaDREB1E基因在接種炭疽病菌后的3 h、5 d時產(chǎn)生了瞬間高表達的響應(yīng)，之后的貯藏過程中卻并沒有高表達量的響應(yīng)，推測可能是病害雖然誘導了冷信號通路基因MaDREB1E的前期響應(yīng)，基因表達量有所提高，但并沒持續(xù)保持基因的高表達來響應(yīng)病害的誘導。對于MaDREB1G基因而言，接種炭疽病菌后，并沒及時地響應(yīng)病害脅迫的誘導，基因表達與對照差異不大，隨著后期貯藏時間的延長，到了12 d時，MaDREB1G基因有了持續(xù)比對照組較高的表達量。可以推測MaDREB1G基因前期不受病害脅迫的誘導，后期響應(yīng)了病害脅迫的誘導。到了貯藏后期，病害的暴發(fā)對采后香蕉果實的傷害起到了主要作用，此時熱處理誘導的MaDREB1G基因表達上調(diào)對病害暴發(fā)有一定的抑制作用。由此可知，病害脅迫和熱處理后接種炭疽病菌對冷信號通路基因的表達都有促進作用。

綜上所述，熱處理可以提高采后香蕉果實的抗病能力。病害脅迫對CBF冷信號通路基因MaDREB1D、MaDREB1E、MaDREB1G、MaCOR413的表達有一定的增強作用，推測CBF冷信號通路基因可能在一定程度上參與了熱處理誘導的抗病性提高。有關(guān)冷信號相關(guān)基因在熱處理提高采后香蕉果實抗病性中的作用還需要進一步研究探索。

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