劉梓欣,趙宏敬,王 雨,陶 金,邢明偉

(東北林業(yè)大學(xué)野生動(dòng)物資源學(xué)院,黑龍江 哈爾濱 150040)

干擾素是一種具有廣譜抗病毒、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)等功能的細(xì)胞因子,可以通過調(diào)節(jié)機(jī)體的某些細(xì)胞來間接發(fā)揮抗病毒生物學(xué)作用,抑制病毒生長,促進(jìn)免疫細(xì)胞活性。IFN-γ屬于Ⅱ型干擾素,主要是由活化的T細(xì)胞、NK細(xì)胞、NKT細(xì)胞產(chǎn)生的糖蛋白[1]。IFN-γ誘導(dǎo)基因轉(zhuǎn)錄主要通過干擾素信號肽轉(zhuǎn)導(dǎo)的經(jīng)典模式 JAK-STAT途徑[2-3]。IFN-γ對體液免疫和細(xì)胞介導(dǎo)的非特異免疫反應(yīng)具有重要調(diào)控作用。白羽鵪鶉的肉和蛋中含有豐富的蛋白質(zhì),具有較高的營養(yǎng)價(jià)值和藥用價(jià)值,在我國更是有“動(dòng)物人參”的美譽(yù)[4]。其中白羽鵪鶉是中國自主培育出的優(yōu)良品種,養(yǎng)殖戶也大規(guī)模的發(fā)展起來,飼養(yǎng)量已占全世界的1/5,已經(jīng)成為世界第一鵪鶉養(yǎng)殖大國[5]。隨著鵪鶉集約化養(yǎng)殖程度不斷提高,鵪鶉病毒性疾病的感染率也在逐年上升[6]。新城疫、支氣管炎、鵪鶉痘病是引起鵪鶉死亡的主要疾病[7]。對克隆到的白羽鵪鶉Ⅱ型IFN-γ基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析,旨在利用大腸桿菌建立高效表達(dá)白羽鵪鶉IFN-γ(coIFN-γ)的體外表達(dá)系統(tǒng),為進(jìn)一步研究鵪鶉IFN-γ干擾素蛋白在機(jī)體抗病毒分子機(jī)制的研究和抗病毒藥物的開發(fā)奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 白羽鵪鶉(體長約為15 cm,體重為300～350 g),由哈爾濱市郊區(qū)某鵪鶉養(yǎng)殖場提供?？寺≥d體 pMD19-T、表達(dá)載體 pET-32a(+)、DL-2 000 DNA Marker、DL-10 000 DNA Marker由 TaKa-Ra(大連)公司提供;PCR引物由博仕生物公司合成;DNA凝膠回收試劑盒、高純質(zhì)粒小量制備試劑盒,由Omega公司提供。

1.3 白羽鵪鶉IFN-γ基因的引物設(shè)計(jì)和PCR擴(kuò)增 參考 GenBank中火雞(AJ000725)、雉雞(AJ001289)、柳雷鳥(DQ473434)、原鴿(NM001282845)等已知的IFN-γ基因序列,在同源性較高的位置設(shè)計(jì)特異性引物:coIFN-1a P1:5′-ATGACTTGCCAGACTTACAACTTGT-3′;coIFN-2b P2:5′-TTAGCAACTGCATCTCCTCAGACAC-3′,以脾臟提取的cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR體系(10 μL)為:10× PCR Buffer 1 μL,dNTP(2.5 mmol/L)0.8 μL,cDNA 1 μL,引物 coIFN-1a 0.5 μL,引物 coIFN-2b 0.5 μL,rTaq 酶(5 U/μL)0.1 μL,補(bǔ)水至 10 μL。

采用熱啟動(dòng)方法進(jìn)行PCR,反應(yīng)條件設(shè)為94℃預(yù)變性5 min,94℃變性40 s,53℃退火30 s,72℃延伸45 s,30個(gè)循環(huán)后以72℃最終延伸10 min。擴(kuò)增結(jié)束,取擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳,按照多功能DNA純化回收試劑盒說明書回收擴(kuò)增后的目的片段。

1.4 陽性重組質(zhì)粒pMD19-T-coIFN-γ的鑒定 取膠回收產(chǎn)物4 μL、pMD19-T克隆載體1 μL和 Solution I 5 μL混勻,16℃連接 5 h;取感受態(tài)細(xì)胞DH5α,冰浴中融化;將 10 μL pMD19-T-coIFN-γ 的連接產(chǎn)物加入含有100 μL感受態(tài)細(xì)胞的EP管中,混勻;冰浴30 min,42℃水浴熱激90 s,快速冰浴3～5 min。將200 μL LB培養(yǎng)基(不加抗生素)加入到EP管中,37℃,180 r/min,溫育1 h。最后將EP管中的液體轉(zhuǎn)移到Amp/LB平板上,37℃培養(yǎng)12 h;挑取白色單克隆菌落于5 mL Amp/LB液體培養(yǎng)基中,180 r/min(37℃)震蕩培養(yǎng)過夜,對菌液進(jìn)行PCR鑒定。

選擇經(jīng)鑒定為陽性的菌液提取質(zhì)粒,取5 μL提取質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶EcoR I和Hind III各0.5 μL以及10×M Buffer 1 μL,ddH2O 補(bǔ)至10 μL于37℃水浴鍋中雙酶切2 h,然后取5 μL酶切產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳,選取結(jié)果為陽性的質(zhì)粒pMD19-T-coIFN-γ送至哈爾濱博仕生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測序。

1.5 白羽鵪鶉IFN-γ基因的序列分析 利用DNA Star-MegAlign對coIFN-γ基因的開放閱讀框序列進(jìn)行同源性分析。用Clustal X和MEGA 4.0軟件進(jìn)行進(jìn)化樹的構(gòu)建分析;利用DNAMAN對鵪鶉、原雞(FJ788637)、原鴿(NM001282845)、灰雁(AY524421)、紅腿叫鶴(XM009701660)等的IFN-γ氨基酸序列進(jìn)行相似性比對分析;利用在線軟件SWISS-MODEL對coIFN-γ進(jìn)行3D結(jié)構(gòu)模擬預(yù)測;利用在線軟件SignalP對coIFN-γ的氨基酸序列進(jìn)行信號肽預(yù)測;利用在線軟件NetO Glyc-3.1對coIFN-γ的氨基酸序列進(jìn)行糖基化位點(diǎn)分析。

1.6 白羽鵪鶉原核表達(dá)質(zhì)粒 pET32a(+)-IFN-γ的構(gòu)建根據(jù)測序結(jié)果設(shè)計(jì)引物P3:5′-CCGGAATTCCATACTGCAAGTAGTCTAAATC-3′(劃線部分酶切位點(diǎn)是EcoR I);P4:5′-CCGCTCGAGTTAGCAACTGCATCTCCT-3′(劃線部分酶切位點(diǎn)是Xhol I),在上、下游引物5′端分別引入EcoR I和Xhol I酶切位點(diǎn),以重組質(zhì)粒pMD19-T-coIFN-γ為模板,以P3、P4為引物擴(kuò)增白羽鵪鶉成熟肽基因。分別以EcoR I和Xhol I雙酶切含 coIFN-γ成熟肽基因的 T載體和 pET32a(+)原核表達(dá)載體,切膠回收目的片后,在T4DNA連接酶的作用下,22℃連接10 min,轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞。提取重組質(zhì)粒,EcoR I和Xhol I雙酶切鑒定后,送至哈爾濱博仕生物技術(shù)有限公司測序,測序正確的重組質(zhì)粒命名 pET32a(+)-coIFN-γ。

1.7 重組表達(dá)質(zhì)粒pET32a(+)-coIFN-γ的誘導(dǎo)表達(dá)和鑒定 將pET32a(+)-coIFN-γ轉(zhuǎn)化至表達(dá)宿主菌BL21感受態(tài)細(xì)胞中,于37℃,加入終濃度為1.0 mmol/L的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。分別于誘導(dǎo)前、誘導(dǎo)后4 h收集菌液。同時(shí)設(shè)含表達(dá)載體pET32a(+)誘導(dǎo)后的 BL21陰性對照。取菌液1 mL,于室溫5 000 r/min離心5 min,收集菌體,重懸于50 mmol/L PBS(pH值為7.4)中,冰浴中超聲破碎(200 W ×10次,每次 3 s,間歇 3 s),最后于4℃、12 000 r/min離心10 min,收集上清和沉淀,于100℃加熱變性10 min,進(jìn)行10%SDS-PAGE分析。

2 結(jié)果

2.1 白羽鵪鶉IFN-γ基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果 將得到的PCR的產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析后,出現(xiàn)一條約495 bp特異性條帶(圖1),與預(yù)期大小一致。

1.2.1 納入標(biāo)準(zhǔn) ⑴所有入選患者均經(jīng)MRI、X線檢查及術(shù)中關(guān)節(jié)鏡探查確診；⑵無其他軟組織損傷；③均伴有不同程度的膝后側(cè)酸脹、膝關(guān)節(jié)不適、行走或上下樓梯時(shí)膝關(guān)節(jié)局部交鎖、彈響等臨床表現(xiàn)。

圖1 PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果

2.2 測序結(jié)果與白羽鵪鶉IFN-γ基因的序列分析測序結(jié)果表明,coIFN-γ基因的核苷酸序列為495 bp。

利用DNAMAN軟件對鵪鶉的γ干擾素氨基酸序列進(jìn)行分析,成熟蛋白的理論分子量是18.90 kDa,等電點(diǎn)是9.17。經(jīng) http://www.cbs.dtu.dk/services/.網(wǎng)站提供的信號肽預(yù)測軟件分析,coIFN-γ氨基酸序列包含一個(gè)由24個(gè)氨基酸組成的信號肽序列和140個(gè)氨基酸組成的成熟肽序列,有2個(gè)糖基化位點(diǎn)(見封三彩版圖2,3)。

應(yīng)用MEGA4.1生物軟件,對 coIFN-γ基因的ORF序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中已有的其他禽類和一些常見水禽類動(dòng)物的IFN-γ基因核苷酸序列進(jìn)行同源性比較(見圖4)。分析結(jié)果顯示,coIFN-γ基因與日本鵪鶉同源性最高,能達(dá)到100%,與雞形目動(dòng)物差異不明顯,同源性能達(dá)到95.6%。在系統(tǒng)進(jìn)化樹中,白羽鵪鶉和日本鵪鶉在同一分支中,親緣關(guān)系較為接近,而與灰雁則較遠(yuǎn)(圖5)。

圖4 鵪鶉IFN-γ基因核苷酸同源性比較

圖5 鵪鶉IFN-γ基因核苷酸系統(tǒng)發(fā)育樹

2.3 白羽鵪鶉重組表達(dá)質(zhì)粒的鑒定 coIFN-γ成熟肽基因與pET32a(+)連接后,轉(zhuǎn)化至DH5α,挑取白色菌落提取重組質(zhì)粒,經(jīng) EcoR I和;Xhol I單、雙酶切和PCR鑒定。1%瓊脂糖凝膠電泳顯示,雙酶切和PCR檢測的插入片段長約500 bp(圖6),與預(yù)期結(jié)果相符。將鑒定為陽性的重組質(zhì)粒測序,測序結(jié)果與coIFN-γ成熟肽基因的編碼序列完全一致。證實(shí)成功地構(gòu)建了重組原核表達(dá)質(zhì)粒pET32a(+)-coIFN-γ。

圖6 鵪鶉IFN-γ重組表達(dá)載體的鑒定

2.4 重組白羽鵪鶉IFN-γ成熟肽基因的表達(dá)、鑒定在BL21中,重組表達(dá)質(zhì)粒pET32a(+)-IFN-γ在IPTG誘導(dǎo)表達(dá)下,在30～40 kDa處可見特異蛋白質(zhì)條帶,而以pET-32a(+)空載體對照,在相應(yīng)位置沒有產(chǎn)生特異性條帶(圖7)。

圖7 鵪鶉IFN-γ蛋白的SDS-PAGE

3 討論

白羽鵪鶉是我國重要的經(jīng)濟(jì)動(dòng)物,具有一定的營養(yǎng)價(jià)值,養(yǎng)殖規(guī)模大,經(jīng)濟(jì)價(jià)值高,隨著白羽鵪鶉規(guī)?；B(yǎng)殖的不斷發(fā)展,各種禽傳染性疾病的發(fā)生更為頻繁和嚴(yán)重,而且大量使用化學(xué)藥物會(huì)嚴(yán)重威脅禽肉等食品的安全,制約鵪鶉業(yè)的進(jìn)一步發(fā)展。為此試驗(yàn)開發(fā)新型抗病毒性生物制劑和免疫增強(qiáng)劑成為防治白羽鵪鶉重大疫病的重要途徑。IFN系統(tǒng)是機(jī)體對抗病毒感染的重要防疫系統(tǒng),一般情況下,動(dòng)物體內(nèi)相關(guān)細(xì)胞的IFN基因處于靜止?fàn)顟B(tài),只有在病毒等因素的誘導(dǎo)下才能微量表達(dá)。同時(shí),當(dāng)IFN系統(tǒng)被激活后,血清IFN可以很快的散布到身體各器官處,細(xì)胞在接觸IFN的短時(shí)間內(nèi),就會(huì)產(chǎn)生抗病毒狀態(tài),并且動(dòng)物在1～3周內(nèi)對病毒的重復(fù)感染都有抵抗作用。近年來,各國學(xué)者廣泛開展了禽類重組IFN抗病毒的研究。Plachy等[8]進(jìn)行了雞重組IFN防治勞斯肉瘤病毒(RSV)腫瘤的研究;王玉東等[9-10]分別用雞 IFN-γ蛋白去抑制水泡性口炎病毒、新城疫的復(fù)制,證明了雞IFN-γ的抗病毒作用。李志中、曾巖等人的研究也表明雞IFN-γ與新城疫、禽流感滅活疫苗聯(lián)合作用也可以顯著提升免疫保護(hù)作用[11-12]。由于不同物種的IFN具有種屬特異性,許多在研究中應(yīng)用的有效方法和成功經(jīng)驗(yàn)不能用于白羽鵪鶉IFN的研究[13]。

因?yàn)榍蓊惖腎FN-γ必須經(jīng)過誘導(dǎo)因子刺激才能產(chǎn)生,本試驗(yàn)從體外分離、經(jīng)過刀豆素蛋白A刺激的鵪鶉外周血淋巴細(xì)胞中,應(yīng)用TRIZol法提取鵪鶉總RNA,反轉(zhuǎn)錄得到鵪鶉的cDNA,用PCR擴(kuò)增獲取IFN-γ基因,對核苷酸序列同源性及IFN-γ蛋白的理化性質(zhì)、疏水性、保守區(qū)域結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析,并對信號肽、糖基化位點(diǎn)、蛋白3D結(jié)構(gòu)模擬預(yù)測。結(jié)果表明,coIFN-γ基因與日本鵪鶉同源性最高,能達(dá)到100%,與雞形目動(dòng)物差異不明顯,同源性能達(dá)到95.6%,而與水禽差異性較大,coIFN-γ的同源性與動(dòng)物分類地位是一致的,推測其IFN-γ生物學(xué)功能具有一定的種屬間特異性。對coIFN-γ的潛在糖基化位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測,可為進(jìn)一步研究coIFN-γ蛋白的真核表達(dá)載體選擇提供理論依據(jù)。構(gòu)建的成熟肽原核表達(dá)質(zhì)粒pET32a(+)-coIFN-γ在IPTG誘導(dǎo)表達(dá)下,成功在BL21細(xì)胞中表達(dá)了40 kDa左右的蛋白質(zhì),這為coIFN-γ走向臨床應(yīng)用創(chuàng)造了條件。

相比于其他經(jīng)濟(jì)動(dòng)物,目前對于白羽鵪鶉IFN的應(yīng)用研究報(bào)道還較少[14],本試驗(yàn)從分子水平上對鵪鶉IFN進(jìn)行研究,并建立IFN-γ成熟肽原核表達(dá)系統(tǒng),實(shí)現(xiàn)表達(dá),這為進(jìn)一步研究鵪鶉干擾素蛋白在抗病毒作用和調(diào)節(jié)免疫等方面的作用提供了堅(jiān)實(shí)的理論依據(jù),并且為雞形目的免疫進(jìn)化機(jī)制研究提供豐富資料。

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