于光輝,姜建陽,王西彤,張華杰,耿 梅,宋春陽

(1.青島農業(yè)大學動物科技學院,山東 青島 266109;2.威海市動物疾病控制預防中心,山東 威海 264200)

仔豬斷奶是其生長發(fā)育過程中的一個必經階段,母子分離、營養(yǎng)和環(huán)境改變而造成體內穩(wěn)態(tài)失調[1]。通過添加一些營養(yǎng)性飼料添加劑、藥物、植物提取物、微生態(tài)制劑等都能緩解斷奶應激,并且在生產上也取得了良好的效果,但是始終沒能全面、深入地揭示仔豬斷奶應激的分子機制。眾所周知,中國地方品種豬經過幾千年的遺傳進化,有著豐富的遺傳多樣性,它們更能適應當?shù)氐臍夂颦h(huán)境,并且比國外品種有獨特的抗逆性,斷奶應激反應相對較小。萊蕪豬是我國一個優(yōu)秀的地方品種,與國外品種相比具有抗病力強和肌內脂肪含量高等優(yōu)異的性狀[2];杜長大是養(yǎng)豬生產中常用的雜交組合,能夠表現(xiàn)出很好的生產成績。利用品種對比來研究仔豬斷奶應激,探索斷奶應激對腸道功能和組織變化是本研究的出發(fā)點,這將進一步揭示仔豬斷奶應激的差異,為以后抗斷奶應激豬的分子機制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗動物 試驗選擇同一日齡出生的健康杜長大仔豬和萊蕪豬各10頭(同一窩)作為試驗動物。

1.2 試驗設計 試驗進行42 d,兩品種均于28日齡斷奶。每個品種為1個處理,分別于仔豬斷奶前1 周(21 d)、斷奶當天(28 d)、斷奶后1 d(29 d)、斷奶后1周(35 d)及斷奶后2周(42 d)時每個品種每個階段選取2頭仔豬屠宰取樣,所有試驗豬進行相同的飼養(yǎng)和管理。

1.3 飼養(yǎng)管理 豬的飼養(yǎng)試驗在青島農業(yè)大學學生教學實習基地進行,仔豬出生第2天補鐵,第5天開始補飼,第28天時斷奶,將其轉入保育室飼喂全價料,自由采食和飲水。

1.4 樣品采集 于仔豬斷奶前1周、斷奶當天、斷奶后1 d、斷奶后1周及斷奶后2周時每個品種每個階段選取2頭體重相近的仔豬,于當日早晨9:00稱重后放血致死,打開腹腔立即結扎幽門瓣、回盲瓣、胰腺管,以防止消化道樣品的相互污染。迅速取出小腸置于預先冰冷的生理鹽水中,取出胰腺剝離脂肪組織和結締組織并稱重后,立即放入液氮速凍,然后移入-80℃冰箱中保存?zhèn)溆?。取十二指腸近端、空腸前段、空腸后段、回腸中段、盲端的食糜于離心管中,迅速放入液氮速凍,然后轉入-80℃冰箱中保存?zhèn)溆谩＜羧∈改c中段、空腸前段的腸道組織2 cm左右,浸入4%甲醛中進行固定。

1.5 測定指標與方法

1.5.1 消化酶活性 分別測定胰腺蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶、空腸前段的蔗糖酶和乳糖酶活性,并計算酶活性。胰腺上清液的制備:準確稱取一定量的胰腺組織,按重量體積比(w/v)加9倍體積的勻漿介質,在冰浴條件下2 500 r/min離心10 min,取上清液即得10%粗酶液,于-20℃冷凍保存待測。蔗糖酶、乳糖酶粗酶液的制備:準確稱取一定量的腸道食糜,按重量體積比(w/v)加9倍體積的勻漿介質,在冰浴條件下2 500 r/min離心10 min,取上清液即得10%粗酶液,于-20℃冷凍保存待測。各種酶活的測定都采用購自南京建成生物工程研究所的試劑盒,并用分光光度計進行測定。

1.5.2 組織切片觀察 甲醛固定好的腸道組織用石蠟包埋后做成石蠟切片,經高碘酸-雪夫染色反應后進行觀察。用帶有測微目鏡的顯微鏡(Olympus,BX51,Japan)計量小腸絨毛長度和隱窩深度,每個組織計量10次取平均值。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析 兩品種間和品種內不同時期的數(shù)據(jù)用SAS軟件GLM過程進行方差分析,數(shù)據(jù)表示為平均值±標準差。

2 結果與分析

2.1 消化酶活性 動物的消化酶活性是胃腸道功能的重要表現(xiàn)形式,兩品種仔豬斷奶前后消化酶活性見表1。

由表1可見,兩品種間的比較表明,兩品種仔豬的胰腺蛋白含量在斷奶前1周差異不顯著,但是在斷奶后1 d和1周萊蕪豬比杜長大分別高41.94%(P<0.01)和81.48%(P<0.01),到斷奶后2周又差異不顯著(P>0.05)。胰蛋白酶的活性萊蕪豬比杜長大在斷奶當天、斷奶后1 d、1周和2周分別高4.07%(P<0.05)、21.44%(P<0.01)、57.10%(P<0.01)和34.80%(P<0.01);但是萊蕪豬胰脂肪酶的活性只在斷奶前1周、斷奶當天和斷奶后1 d比杜長大差異顯著(P<0.05或者P<0.01);胰淀粉酶也呈相同的趨勢。萊蕪豬的乳糖酶在斷奶后1 d和1周比杜長大低37.12%(P<0.05)和22.93%(P<0.05),但是在斷奶后2周比杜長大高39.98%(P<0.01)。

從不同斷奶時期的比較來看,萊蕪豬的胰腺蛋白含量在斷奶當天比斷奶前1周增加了46.67%,但是斷奶后1 d、1周和2周比斷奶當天分別降低42.86%(P<0.01)、4.55%(P<0.05)和 8.44%(P>0.05);杜長大仔豬胰腺蛋白含量也呈相同的趨勢。胰蛋白酶、胰脂肪酶、胰淀粉酶、蔗糖酶、乳糖酶的活性在斷奶后都呈下降的趨勢,但是萊蕪豬的消化酶活性比杜長大下降幅度要小些,或者能夠在較短時間內很快上升。

2.2 腸絨毛長度和隱窩深度 兩品種仔豬斷奶前后十二指腸和空腸腸絨毛長度和隱窩深度變化情況見表2。

由表2可見,兩品種間比較結果表明,萊蕪豬十二指腸絨毛在斷奶前1周比杜長大高17.03%(P<0.05),斷奶后1 d差異不顯著,但是斷奶后1周又比杜長大高73.62%(P<0.01)。萊蕪豬的空腸絨毛在斷奶前1周、斷奶后1 d和斷奶后1周比杜長大分別高14.24%(P<0.01)、10.69%(P<0.01)和65.63%(P<0.01)。兩品種仔豬十二指腸的隱窩深度在斷奶前1周和斷奶后1 d差異不顯著,但是萊蕪豬在斷奶后1周比杜長大要淺6.14%(P<0.05)。萊蕪豬的隱窩深度斷奶后1 d比斷奶前1周增加9.59%(P>0.05),斷奶后1周比斷奶后1 d降低1.55%(P>0.05);而杜長大斷奶后1 d比斷奶前1周降低2.00%(P>0.05),斷奶后1周比斷奶后1 d增加13.93%(P<0.01)。萊蕪豬空腸的隱窩深度比杜長大在斷奶前1周、斷奶后1 d、斷奶后1周分別要深24.08%(P<0.01)、16.77%(P<0.01)、3.65%(P>0.05)。

表1 斷奶對不同品種仔豬胰臟蛋白含量及消化酶活性的影響

2.3 斷奶前后腸道組織結構 兩品種仔豬斷奶前后十二指腸和空腸腸道發(fā)育的變化見圖1。

由圖1可見,兩品種仔豬在斷奶前1周十二指腸和空腸的腸絨毛長度差異不明顯,都呈規(guī)則的手指狀,且腸絨毛排列緊密有序(A1和B1);斷奶當天變化不大(A2和B2);斷奶后1周萊蕪豬的十二指腸絨毛出現(xiàn)空泡化(A3),杜長大的十二指腸絨毛有部分斷裂或者脫落(B3);萊蕪豬的空腸絨毛變粗變短(A4),杜長大的空腸絨毛脫落嚴重,并且比萊蕪豬的更短(B4)。

3 討論

3.1 仔豬斷奶應激影響豬的生產性能 仔豬斷奶母子分離導致仔豬嚴重的應激反應,并且會挫傷腸道和免疫系統(tǒng)的功能,在斷奶后第一周尤為嚴重,影響仔豬的健康、生長、采食量等。生產中采取各種措施來應對仔豬的斷奶應激,如改善生活環(huán)境、提高營養(yǎng)水平、增強機體免疫、改變管理模式等,在一定程度上緩解了斷奶應激[3]。

3.2 仔豬斷奶應激降低消化酶活性 消化酶活性降低是引起斷奶仔豬腹瀉的主要原因,胰腺是最重要的消化器官之一,分泌多種消化酶,如胰蛋白酶、胰脂肪酶和胰淀粉酶等。仔豬斷奶應激降低胰腺的分泌能力和消化酶的活性[4]。胰脂肪酶活性在斷奶后逐漸降低,在斷奶后2周回復正常水平(表1)。仔豬斷奶后1 d小腸蔗糖酶活性迅速下降(大約下降85%),斷奶后2 d比斷奶后1 d下降30%左右[5]。

表2 斷奶前后不同品種豬腸道絨毛和隱窩變化

圖1 仔豬斷奶前后腸道組織變化圖

3.3 仔豬斷奶應激影響腸道組織結構 仔豬斷奶前,絨毛高度隨日齡增長逐漸變長,隱窩深度變淺。斷奶后,食物由液體母乳向固體飼料轉變,固體飼料中存在抗營養(yǎng)因子及抗原蛋白引發(fā)過敏反應,表現(xiàn)為絨毛高度降低,隱窩深度加深[6-7],絨毛高度/隱窩深度的比值顯著降低。小腸絨毛高度和隱窩深度的比值決定了仔豬腸道的消化吸收能力,比值越大,表明腸道吸收面積越大,消化吸收能力越高[8]。斷奶24 h后腸絨毛高度降低25%,5 d內絨毛高度繼續(xù)縮短,隱窩加深,到第5天時,降低為原來的50%,隨后開始逐漸恢復[9]。隱窩深度能夠反映細胞的形成能力,淺的隱窩深度加快了細胞的成熟,提高腸道的分泌能力[10]。本試驗結果表明,腸絨毛在斷奶后1周逐漸降低,腸絨毛的形態(tài)從手指狀變?yōu)楸馄綘?但是萊蕪豬的腸絨毛形態(tài)變化要小些(圖1)。兩品種仔豬斷奶后隱窩深度都增加,但是空腸的變化差異不顯著(P>0.05)(表2)。

本研究消化酶活性和腸道組織結構變化兩方面,對比研究了萊蕪豬和杜長大仔豬斷奶應激的差異。地方品種萊蕪豬在生產上表現(xiàn)為抗斷奶應激能力比較強,通過指標的測定發(fā)現(xiàn)萊蕪豬比杜長大有更高的消化酶活性,并且斷奶后腸道組織損傷較輕,能夠很快恢復,表明萊蕪豬比杜長大有更強的抗斷奶應激能力。

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