易凡利，王嘉福,2*，張福平，阮亦麒，唐靚婷，毛 寧，冉雪琴*

（1.貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，農(nóng)業(yè)生物工程研究院，貴州貴陽(yáng) 550025；2. 銅仁學(xué)院，貴州銅仁 554300）

繁殖性狀尤其是多產(chǎn)性狀是生豬養(yǎng)殖業(yè)中重要的經(jīng)濟(jì)性狀，近年來國(guó)內(nèi)外眾多學(xué)者在繁殖性狀的基礎(chǔ)研究和應(yīng)用方面開展了卓有成效的工作，為提高豬種的產(chǎn)仔數(shù)發(fā)揮了重要的作用。繁殖力是評(píng)估生豬養(yǎng)殖業(yè)生產(chǎn)效益的重要指標(biāo)，對(duì)豬產(chǎn)仔數(shù)性狀的選育和改良是豬育種工作的主要目標(biāo)之一[1-2]。根據(jù)遺傳育種學(xué)家Chris Haley的計(jì)算，如果母豬的產(chǎn)仔數(shù)每胎能提高1頭，英國(guó)就可以從生豬養(yǎng)殖業(yè)中每年增加7億英鎊的額外收入，而整個(gè)歐盟國(guó)家則可多獲利至少20億歐元[3]。

香豬是在一個(gè)獨(dú)特的自然生態(tài)條件和地理環(huán)境中，通過低水平的飼養(yǎng)管理方式以及長(zhǎng)期的人工和自然近交選育形成的優(yōu)良地方豬品種[4]。然而，香豬較低的繁殖率限制了這種小型豬產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，而且香豬繁殖力的調(diào)控機(jī)理尚未明確。

貴州香豬主產(chǎn)于貴州省從江縣的宰便、加鳩、加勉、加榜、光輝、剛邊、秀塘、東朗等8個(gè)鄉(xiāng)鎮(zhèn)，近年來對(duì)貴州從江香豬的研究主要集中在生長(zhǎng)性能、屠宰性能、繁殖性能等經(jīng)濟(jì)性狀，以及個(gè)別基因的多態(tài)性分析[5-6]。迄今為止，國(guó)內(nèi)外運(yùn)用大白豬、長(zhǎng)白豬、五指山豬、陸川豬、藏豬、太湖豬、榮昌豬等豬種進(jìn)行的關(guān)聯(lián)研究發(fā)現(xiàn)，豬繁殖性能的主效基因有ESR基因[7]、LHP基因[8]、MP7基因[9]等，而對(duì)于β-微精漿蛋白（MSMB）、前列腺素F2α受體（PTGFR）、分泌性白細(xì)胞蛋白酶抑制因子（SLPI）、抑制素A（INHA）、人纖溶酶原激活物抑制劑1（SERPINE1）基因與繁殖性狀的相關(guān)性研究尚少。前期研究中，本課題組從香豬卵巢轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果中篩選出5個(gè)候選基因，即MSMB、PTGFR、SLPI、INHA、SERPINE1，具有差異表達(dá)現(xiàn)象（待發(fā)表）。在此基礎(chǔ)上，本研究通過檢測(cè)5個(gè)基因在發(fā)情與未發(fā)情時(shí)期香豬卵巢和子宮組織中的表達(dá)變化，探討這些基因?qū)ο阖i卵巢和子宮是否具有調(diào)節(jié)作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及組織樣品采集 實(shí)驗(yàn)所用的香豬卵巢和子宮組織采自貴州大山地生態(tài)養(yǎng)殖有限責(zé)任公司。隨機(jī)選擇發(fā)情期與未發(fā)情期的6月齡母香豬各3頭，屠宰后，無菌采取卵巢和子宮，裝入冷凍管，投入液氮中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 組織樣品總RNA的提取及cDNA的合成 取-80℃凍結(jié)的50～100 mg組織樣品迅速轉(zhuǎn)移至用液氮預(yù)冷的研缽中，用研杵研磨組織直至成粉末，參照天根生化科技（北京）有限公司的RNAsimple總RNA提取試劑盒（DP419）提取總RNA。用NanoDrop2000（Thermo）對(duì)提取的RNA進(jìn)行質(zhì)檢，RNA純度通過計(jì)算OD260/280（介于1.90～2.10）進(jìn)行評(píng)估，RNA的完整性通過1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。反轉(zhuǎn)錄采用Promega生產(chǎn)的 -GoscriptTMReverse Transcription Mix，Oligo（dT）試劑盒，按照操作說明書完成cDNA的合成。

1.3 熒光定量PCR 利用在線Primer3.0設(shè)計(jì)引物，用Unafold（http://www.dtdna.com/UNAFOld）檢驗(yàn)發(fā)夾結(jié)構(gòu)，用Primer-BLAST（http://www.ncbi.n/m.nih.gov/tools/primer-blast）分析引物的特異性。由英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司合成引物（表1）。熒光定量PCR檢測(cè)用天根SYBR?Green試劑盒，反應(yīng)在CFX96 Connect TM（Bio-Rad）熒光定量PCR儀上進(jìn)行，根據(jù)試劑盒操作說明進(jìn)行擴(kuò)增。每個(gè)樣品做3個(gè)重復(fù)。表1中qPCR擴(kuò)增效率是用倍比稀釋的重組質(zhì)粒為模板，熒光定量PCR儀的分析軟件（Bio-Rad）繪制的曲線計(jì)算而來。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析 目標(biāo)基因在各組織中的表達(dá)水平采用2-△△Ct法進(jìn)行相對(duì)定量。以管家基因GAPDH為內(nèi)參。用SPSS軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)分析基因的差異表達(dá)。P＜0.01表示差異極顯著，P＜0.05表示差異顯著，P＞0.05表示差異不顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 香豬卵巢組織中基因的差異表達(dá) 由圖1可見，SLPI、INHA、SERPINE1、MSMB、PTGFR基因在香豬卵巢組織中發(fā)情與未發(fā)情時(shí)期均有表達(dá)。INHA基因發(fā)情時(shí)期的表達(dá)水平是未發(fā)情時(shí)期的12倍（P＜0.01）；SLPI基因發(fā)情時(shí)期的表達(dá)水平是未發(fā)情時(shí)期的5倍（P＜0.05）；MSMB在卵巢組織中發(fā)情時(shí)期的表達(dá)量顯著低于未發(fā)情期（P＜0.05）；SERPINE1基因、PTGFR基因在發(fā)情時(shí)期與未發(fā)情時(shí)期的表達(dá)水平差異不顯著（P＞0.05）。

圖1 5個(gè)基因在發(fā)情、未發(fā)情時(shí)期香豬卵巢組織中的差異表達(dá)

2.2 香豬子宮組織中基因的差異表達(dá) 相對(duì)于未發(fā)情時(shí)期（圖2），SLPI基因在發(fā)情期子宮組織中的表達(dá)量極顯著升高（P＜0.01）；INHA、MSMB、PTGFR基因在發(fā)情期子宮的表達(dá)量顯著下降（P＜0.05）；SERPINE1基因的表達(dá)水平變化不明顯（P＞0.05）。

表1 熒光定量PCR引物序列及相關(guān)信息

圖2 5個(gè)基因在發(fā)情和未發(fā)情期香豬子宮組織中的差異表達(dá)

3 討 論

在母畜中，INHA的主要來源是卵巢，由卵巢的顆粒細(xì)胞和睪丸間質(zhì)細(xì)胞分泌，在子宮中也有表達(dá)[10]。抑制素與性腺、子宮等組織的功能紊亂及妊娠的維持有密切關(guān)系[11]。豬卵泡中INHA在排卵前的表達(dá)量升高，中卵泡的表達(dá)水平低于大卵泡[12]。抑制素還有控制卵泡的發(fā)生、卵母細(xì)胞的成熟以及調(diào)節(jié)胚胎發(fā)育的作用[13]。本文檢測(cè)到INHA基因在發(fā)情期香豬卵巢中的表達(dá)水平極顯著高于未發(fā)情期；而在發(fā)情期子宮組織中的表達(dá)水平下降，說明該基因在香豬發(fā)情期的生理過程中，可能促進(jìn)卵巢的生理功能、抑制子宮的功能。

SERPINE1和SERPINE2同屬于絲氨酸蛋白酶抑制劑（SERPIN）超家族。研究表明[14]，SERPINE2是胎盤和子宮中主要的纖溶酶原激活劑（PA）的抑制劑。應(yīng)用HPRL和HPRL+Kp作用于小鼠卵泡[15]，SERPINE1的表達(dá)水平變化不大。高催乳素血癥可明顯促進(jìn)小鼠的排卵數(shù)，卻抑制女性卵泡的發(fā)育[16]。腎上腺素通過AngⅡ刺激SERPINE1基因的表達(dá)，從而影響子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞的蛻膜化[17]?？梢?，SERPINE1基因與PRLr、PA、AngⅡ之間可能存在著一定的聯(lián)系。本研究結(jié)果顯示，發(fā)情期SERPINE1基因的表達(dá)量在卵巢中升高、子宮中下降，但均未達(dá)顯著水平，說明該基因?qū)β殉病⒆訉m生理功能的影響可能不大。

PTGFR是PGF2α的一個(gè)特異性受體，PGF2α通過PTGFR發(fā)揮生物學(xué)作用，其受體廣泛存在于肝臟、卵巢、子宮等的細(xì)胞膜上[18]，參與卵巢排卵和子宮分娩活動(dòng)。在母豬懷孕期間以及子宮內(nèi)膜植入期間，PGF2α的旁分泌和自分泌作用受PTGFR的調(diào)控[19-20]，PTGFR在優(yōu)勢(shì)卵泡和從屬卵泡中的表達(dá)量無顯著差異[21]。豬胚胎植入期子宮內(nèi)膜中PTGFR的表達(dá)量高于植入前，且僅在子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞中高表達(dá)[20]。本文的研究證實(shí)，發(fā)情與未發(fā)情時(shí)期香豬卵巢中PTGFR基因的表達(dá)水平無顯著差異，發(fā)情時(shí)期子宮中該基因的表達(dá)水平上調(diào)。提示PTGFR基因可能主要調(diào)控香豬子宮的功能。

MSMB是一種富含二硫鍵的低分子量蛋白質(zhì)，是精液的主要成分，在生殖系統(tǒng)和黏膜中強(qiáng)烈表達(dá)，抑制精子的活力[22]。在高產(chǎn)、低產(chǎn)約克夏母豬中鑒定出SCARB1、MSMB等基因與繁殖力和產(chǎn)仔數(shù)相關(guān)[23]，MSMB可能是濾泡閉鎖的標(biāo)記[24]。本研究結(jié)果顯示，無論在香豬卵巢組織中還是在子宮組織中，MSMB在發(fā)情時(shí)期的表達(dá)水平均低于未發(fā)情時(shí)期。推測(cè)MSMB基因可能對(duì)香豬卵巢和子宮的功能有調(diào)節(jié)作用。

SLPI是一種由黏膜被覆上皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等分泌的上皮特異性絲氨酸蛋白酶抑制劑，存在于各種黏膜分泌液中，通過自分泌和旁分泌系統(tǒng)在細(xì)胞增殖和分化過程中起作用，且控制胚胎發(fā)育因子的表達(dá)[25]，SLPI在人子宮肌層中表達(dá)并在分娩后增加[26]。特別是在胚胎著床的動(dòng)態(tài)重塑期間，SLPI與P4存在相互作用[27]。從本研究結(jié)果來看，發(fā)情時(shí)期香豬卵巢、子宮組織中的表達(dá)水平均顯著高于未發(fā)情時(shí)期，推測(cè)該基因可能影響香豬卵巢和子宮的生理功能。

本研究結(jié)果提示，INHA、SLPI、MSMB基因在香豬卵巢、子宮中均起到調(diào)節(jié)作用，而PTGFR僅在子宮中起調(diào)控作用，相關(guān)機(jī)理有待深入研究。

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