王光函，孫小玲，鄒桂欣，尤獻(xiàn)民，辛旭陽(yáng)，劉 晶，李國(guó)信＊＊

（1.遼寧省中醫(yī)藥研究院 沈陽(yáng) 110034；2.遼寧省藥品檢驗(yàn)檢測(cè)院 沈陽(yáng) 110023）

射干，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》[1]，其味苦、辛，性寒，微毒，歸肺、肝經(jīng)。具有祛痰利咽、消癖散結(jié)、清熱解毒、消腫止痛的功效，臨床常用于治療感受風(fēng)熱或痰熱壅盛引起的咽喉腫痛、痰涎壅盛，及咳嗽氣喘等癥，是中醫(yī)治療喉痹咽痛之要藥。綜合分析古典醫(yī)籍及現(xiàn)代文獻(xiàn)[2-6]，確定射干臨床上用于治療發(fā)熱、惡寒、咳嗽、咯痰、口渴、胸痛或悶、氣短等癥狀，癥常見于急性氣管-支氣管炎、感染后咳嗽（PIC）、慢性阻塞性肺疾病急性加重、支氣管哮喘合并感染等氣道感染性疾病。

呼吸道合胞病毒（RSV）屬副粘液病毒科，肺炎病毒屬，是PIC發(fā)病及感染的重要感染病原之一，也是醫(yī)院交叉感染的主要病原?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)[7]認(rèn)為病毒感染導(dǎo)致了氣道變應(yīng)性炎癥、氣道上皮損傷、氣道高反應(yīng)等。本研究基于射干臨床病種篩選試驗(yàn)結(jié)果，確定了感染后咳嗽為射干臨床治療病種后，擬采用RSV感染豚鼠咳嗽模型[8]，通過對(duì)感染后豚鼠肺組織形態(tài)學(xué)影響，肺泡灌洗液中白細(xì)胞總數(shù)及分類計(jì)數(shù)變化，細(xì)胞因子白介素-4（IL-4）、干擾素-γ（IFN-γ）、白三烯-4（LTC4）表達(dá)影響，來(lái)研究射干提取物對(duì)RSV感染后咳嗽模型抗炎作用。

1 材料

1.1 動(dòng)物與細(xì)胞

雄性純白SPF級(jí)豚鼠30只，250-300 g(北京實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)；呼吸道合胞病毒（武漢病毒研究所贈(zèng)予）；Hep-2細(xì)胞（江蘇齊氏生物科技有限公司）。

1.2 藥物與儀器

射干提取物（實(shí)驗(yàn)室自制）；DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清（CORNING）；胰酶(碧云天生物技術(shù)有限公司)；枸櫞酸（沈陽(yáng)市試劑一廠）；IFN-γ、IL-4、LTC4 ELISA試劑盒（南京建成生物工程研究所有限公司）；ELX800型酶標(biāo)儀（BioTek，美國(guó)）；石蠟切片機(jī)（萊卡）；BX53顯微鏡（奧林巴斯）。

2 方法

2.1 射干提取物的制備

射干藥材1 kg，加70%乙醇提取2次，合并提取液，濃縮至無(wú)醇味，用乙醇調(diào)整至含醇量為30%，上于D101大孔吸附柱上，用3倍量30%乙醇除雜，繼用80%乙醇洗脫，收集洗脫液，干燥至干，即得（每1 g提取物含20.7 g射干藥材）。

2.2 Hep-2細(xì)胞培養(yǎng)、RSV擴(kuò)增及組織培養(yǎng)半數(shù)感染量（TCID50）的測(cè)定

Hep-2細(xì)胞使用DMEM培養(yǎng)液（含有10%胎牛血清，100 U·mL-1青霉素，100 g·L-1鏈霉素），37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞每2-3天傳代。

Hep-2細(xì)胞在培養(yǎng)瓶中長(zhǎng)至70-80%融合，吸出培養(yǎng)液，PBS洗2次，加入1 mL無(wú)血清培養(yǎng)液，取病毒懸液100μL接種于細(xì)胞上，每15 min搖動(dòng)1次，吸附2 h后倒出病毒液，加入含5%胎牛血清培養(yǎng)液，于第2-3天開始出現(xiàn)細(xì)胞病變（CPE），待病變達(dá)60-70%時(shí)收獲病毒，將細(xì)胞反復(fù)凍融2-3次后，1 000 r·min-1，離心5 min，去除細(xì)胞碎片，收集上清分裝后，-80℃保存。

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期Hep-2細(xì)胞接種96孔板（1×104cells/well），5%CO2、37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，細(xì)胞貼壁并形成均勻單層時(shí)吸棄培養(yǎng)液。梯度稀釋病毒至10-3-10-（8病毒液用維持液10倍系列稀釋）6個(gè)梯度，每孔加100 μL，每列一個(gè)稀釋度，共6列。其余6列加入培養(yǎng)液，作空白對(duì)照。37℃、5%CO2吸附2 h，吸棄病毒液，每孔加維持液100 μL，置培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，逐日觀察病變程度并記錄。以最高稀釋度不再出現(xiàn)新病變時(shí)為終點(diǎn)，結(jié)果只記錄最后一天病變情況即可。用Reed-Muench公式計(jì)算病毒半數(shù)細(xì)胞感染量(TCID50)。本次實(shí)驗(yàn)病毒半數(shù)細(xì)胞感染量(TCID50）為7×105TCID50。

2.3 RSV感染豚鼠模型的制備及分組

健康豚鼠，常規(guī)飼養(yǎng)，一周后開始正式試驗(yàn)。試驗(yàn)分空白組，RSV感染模型組、射干提取物給藥組（600 mg·kg-1·日-1），每組10只。

RSV感染模型制備：除空白組外，將其余各組豚鼠放入自制450 mm×450 mm×900 mm熏籠中，每5只一籠，以鋸末50 g+10支香煙點(diǎn)燃煙熏，每次30 min，每日1次，連續(xù)10天，自由進(jìn)食吸水，從第5天開始將豚鼠乙醚淺麻后鼻腔滴注100TCID50的RSV懸液100μL（每天滴鼻2次，早晚各1次，空白組給予相同劑量的5%DMEM培養(yǎng)液），連續(xù)給藥1周。滴入量以體重1μL·g-1計(jì)算。給藥組自第5天開始給藥。

2.4 射干提取物對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物鎮(zhèn)咳作用的觀察

于末次給藥45 min時(shí)，將動(dòng)物置于5 L大燒杯中，底部加少量墊料，燒杯口用保鮮膜封，以4.5 mol·L-1枸櫞酸溶液霧化吸入激發(fā)，每次30 s，觀察5 min內(nèi)豚鼠咳嗽次數(shù)。

2.5 肺泡灌洗收集

將豚鼠用2%戊巴比妥（25 mg·kg-1）麻醉后仰臥固定于操作臺(tái)，打開胸腔，暴露氣管和雙肺，結(jié)扎右主支氣管，在隆突上用套管針穿刺至左肺，氣管上段剪開插入灌流管，將預(yù)溫至37℃的生理鹽水經(jīng)氣管插管注入肺內(nèi)，每次灌入2-3 mL，停留30 s，回吸液體，反復(fù)3次，灌洗液回收率為70-85%。2 000 r·min-1，4℃離心10 min，上清液分裝保存于-20℃冰箱，備用。細(xì)胞沉淀用磷酸鹽緩沖液（PBS）溶解，在全自動(dòng)模塊式血液體液分析儀上測(cè)定白細(xì)胞總數(shù)、淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)、單核細(xì)胞計(jì)數(shù)及中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)。

2.6 ELISA法測(cè)定肺泡灌洗液中IL-4、IFN-γ、LTC4的含量

按照試劑盒要求測(cè)定各組豚鼠支氣管肺泡灌洗液中IL-4、IFN-γ、LTC4的含量。

2.7 對(duì)肺組織形態(tài)學(xué)影響

結(jié)扎右主支氣管，采用4%多聚甲醛固定右肺中葉，常規(guī)蘇木素-伊紅(HE)染色，光鏡觀察肺組織形態(tài)結(jié)構(gòu)。

2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)處理采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件，結(jié)果Xˉ±S表示，采用單因素方差分析，P＜0.05表示有顯著性差異，P＜0.01有極顯著差異。

3 結(jié)果

3.1 射干提取物對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物鎮(zhèn)咳作用的觀察

模型組5 min內(nèi)咳嗽次數(shù)顯著高于空白組，提示造模成功；而咳嗽潛伏期無(wú)顯著差異。給藥組中，射干提取物對(duì)模型動(dòng)物5 min內(nèi)咳嗽有顯著抑制作用。結(jié)果見表1。

表1 射干提取物對(duì)枸櫞酸引起咳嗽的影響結(jié)果(ˉ±S,n=10)

表1 射干提取物對(duì)枸櫞酸引起咳嗽的影響結(jié)果(ˉ±S,n=10)

注：與空白組比較，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05。

圖1 射干提取物對(duì)RSV感染豚鼠BALF中IL-4、IFN-γ表達(dá)的影響

圖2 射干提取物對(duì)RSV感染豚鼠肺泡灌洗液中LTC4表達(dá)的影響

3.2 射干提取物對(duì)RSV感染豚鼠BALF中細(xì)胞學(xué)的改變

模型BALF中白細(xì)胞總數(shù)、淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞和中性粒細(xì)胞明顯高于空白組(P＜0.05)，說明模型建立成功。給藥組與模型組相比，BALF中白細(xì)胞總數(shù)、淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞和中性粒細(xì)胞顯著降低(P＜0.05)。見表2。

3.3 射干提取物對(duì)RSV感染豚鼠BALF中IL-4、IFN-γ含量及比例的變化

RSV感染豚鼠后，模型組中IL-4水平明顯高于空白組（P＜0.05），而IFN-γ水平明顯低于空白組（P＜0.05）。給藥后，豚鼠BALF中IL-4水平明顯降低（P＜0.05），IFN-γ水平明顯增高（P＜0.05）結(jié)果見圖1、表3。

3.4 射干提取物對(duì)RSV感染豚鼠BALF中LTC4表達(dá)的影響

RSV感染豚鼠后，模型組中LTC4水平明顯高于空白組（P＜0.05），給藥后LTC4水平明顯低于模型組（P＜0.05）。結(jié)果見圖2、表3。

3.5 射干提取物對(duì)RSV感染豚鼠肺組織形態(tài)的影響

RSV感染豚鼠后，模型組與空白組相比，可見肺泡壁增厚，有炎性細(xì)胞出現(xiàn)，形態(tài)變形，并有充血。給藥組所有癥狀均有減輕。

4 討論

《普濟(jì)方》數(shù)據(jù)庫(kù)管理系統(tǒng)[9]可以對(duì)任何一味中藥進(jìn)行跨病種檢索，檢索結(jié)果可得此藥復(fù)方配伍用于所有病證的構(gòu)成、各病證配伍此藥頻數(shù)?；凇镀諠?jì)方》數(shù)據(jù)庫(kù)古方配伍應(yīng)用考證結(jié)果表明，含射干復(fù)方所治疾病以喉痹咽痛、咳嗽、咳喘、咽干、痰熱壅盛諸病與2015年版《藥典》[10]一部所記功能主治完全吻合?，F(xiàn)代文獻(xiàn)學(xué)研究表明，射干具有抗炎、抗病毒、抗菌、抗氧化等藥理作用。結(jié)合傳統(tǒng)中醫(yī)藥理論研究結(jié)果，考慮急性氣管-支氣管炎（風(fēng)邪犯肺證）及感染后咳嗽（余熱未清證）在炎性表現(xiàn)方面一急一慢，發(fā)病方面風(fēng)熱犯肺表現(xiàn)在前期，后期入里化熱、余熱未清，頗具代表性，故選擇此二證為射干臨床應(yīng)用試驗(yàn)病征。前期臨床研究結(jié)果表明：射干清咳片組與對(duì)照組（肺寧片組）治療后比較雖然沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但從日間、夜間咳嗽、咯痰、痰量評(píng)分?jǐn)?shù)值變化可看出，射干清咳片改善明顯，證明其治療感染后咳嗽及急性氣管-支氣管炎臨床療效確切。

表2 射干提取物對(duì)RSV感染豚鼠肺泡灌洗液中細(xì)胞學(xué)的影響

表3 射干提取物對(duì)RSV感染豚鼠BALF中LTC4、IL-4、IFN-γ表達(dá)的影響

圖3 射干提取物對(duì)RSV感染豚鼠肺組織病理切片圖

根據(jù)臨床兩個(gè)證型的試驗(yàn)結(jié)論，結(jié)合感染后咳嗽在患病人群中更為常見，患者量較大，患者長(zhǎng)期咳嗽不愈，易給患者造成很大心理負(fù)擔(dān)，精神上形成緊張，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量，反復(fù)檢查易造成醫(yī)療成本過大，且從疾病角度出發(fā)感染后咳嗽在臨床上沒有更為有效的治療手段，而急性氣管-支氣管炎目前臨床治療藥品頗為豐富如：抗感解毒沖劑、止咳平喘的川貝批把膏等，所以我們首先選擇了感染后咳嗽作為射干作用機(jī)制研究的動(dòng)物模型。

感冒后咳嗽絕大部分由呼吸道病毒感染后引起，又稱為感染后咳嗽，目前有關(guān)感染后咳嗽的機(jī)制知之甚少，缺乏滿意的治療[11]。感染后咳嗽雖然最終大多可以自愈，但過程中可能會(huì)嚴(yán)重影響患者的工作和生活，因此，進(jìn)行病毒感染引起的咳嗽，尤其是感染后咳嗽發(fā)病機(jī)制的探討將具有重要的意義。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為感冒后咳嗽的發(fā)病與病毒感染后所產(chǎn)生的變應(yīng)性炎癥、氣道上皮損傷、氣道神經(jīng)末梢暴露、神經(jīng)源性炎癥反應(yīng)及其導(dǎo)致的氣道高反應(yīng)有關(guān)[12,13]。

呼吸道變應(yīng)性炎癥產(chǎn)生與Th1/Th2類細(xì)胞因子失衡有關(guān)，Th1/Th2比例降低是呼吸道變應(yīng)性炎癥發(fā)生主要因素，且Th2類細(xì)胞因子優(yōu)勢(shì)表達(dá)是其形成及進(jìn)展的關(guān)鍵機(jī)制[14]。Th1細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子IFN-γ及Th2細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子IL-4與呼吸道變應(yīng)性炎性反應(yīng)關(guān)系密切，IFN-γ能促進(jìn)細(xì)胞表達(dá)MHC-Ⅰ類和MHC-Ⅱ類分子，并抑制Th2細(xì)胞的增殖；直接通過氣道給予IFN-γ，可抑制抗原激發(fā)小鼠特應(yīng)性氣道炎癥。白三烯(LTS)是花生四稀酸(Aracliidonic Acid，AA)經(jīng)5-脂氧酶途徑合成代謝產(chǎn)生并具有多種生物活性的脂肪酸,包括LTB4和LTC4等，LTS是引起和加重氣道炎癥的重要炎癥介質(zhì),從而導(dǎo)致氣道上皮損傷,使咳嗽感受器暴露過多,引起咳嗽敏感性增高[15]。因此對(duì)肺泡灌洗液中的IL-4、IFN-γ及LTC4進(jìn)行測(cè)定。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，采用RSV感染豚鼠模型，BALF細(xì)胞學(xué)及肺組織病理學(xué)檢查支持氣道炎癥改變，表明感染后咳嗽模型成功。射干提取物給藥組能減少豚鼠咳嗽次數(shù)，降低BALF中IL-4含量，升高IFN-γ含量，使IL-4/IFN-γ的比值降低，調(diào)節(jié)Th1/Th2免疫失衡；并且射干提取物能降低BALF中LTC4水平，顯著減少炎性細(xì)胞數(shù)量，抑制炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，說明射干提取物可能通過調(diào)節(jié)Th1/Th2平衡、抑制LTC4表達(dá)而抑制炎性介質(zhì)的釋放和聚集，從而減輕氣道炎癥。

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