任瑤瑤，張 良，謝博文，江南屏，劉睿穎，譚 睿

（西南交通大學生命科學與工程學院 成都 610031）

峨眉山位于四川盆地邊緣亞熱帶季風氣候區(qū)，峨眉山最高海拔為3 099 m，山頂山麓相對高差近2 600 m，氣候懸殊，山頂和山麓溫差大，氣溫垂直變化顯著，因而其植被分布具有明顯的垂直分布性，加之峨眉山區(qū)降雨量豐富，空氣相對濕度達80%以上，使得該區(qū)域植物資源極為豐富，多種自然要素的交匯，形成了峨眉山豐富的植物種類和復雜的區(qū)系成分[1，2]。

?？疲∕oraceae）植物約有53屬1 400種，多產(chǎn)于熱帶、亞熱帶，少數(shù)分布在溫帶地區(qū)。我國約有12屬153種和亞種，并有變種及變型59個[3]。?？浦参镏芯哂兴幱脙r值的桑科植物約55種，在我國國民經(jīng)濟中具有重大意義[4]。構屬（Broussonetia）藥用植物具有增強免疫[5]、消除自由基[6]、降血脂等作用[7]；桑屬（Morus）植物降血糖作用[8]、降壓降血脂作用、抗氧化作用[9]抗菌和抗病原微生物作用[10]；榕屬（Ficus Linn）植物有降血糖[11]、鎮(zhèn)痛抗炎[12]、抗菌[13,14]、增強免疫系統(tǒng)的作用。峨眉山有豐富的桑科藥用資源，桑科中許多的用植物具有藥食兩用價值，峨眉山常見的桑科藥用植物有桑（Morus alba）、地果（Ficus tikoua）、黃葛樹（Ficus virens）、冠毛榕（Ficus gasparriniana）、異葉榕（Ficus heteromorpha）、葎草（Humulus scandens）、小構樹（Broussonetia kazinoki）、構樹（Broussonetia papyrifera）等，且分布廣泛，資源較為豐富。

運用DNA條形碼技術對藥用植物進行鑒定是現(xiàn)在中藥鑒定研究的熱點[15]。陳士林等[16]首次提出將ITS2序列作為藥用植物鑒定的通用條形碼序列。本實驗采集了峨眉山區(qū)不同地區(qū)的桑科植物樣本，并從Genbank下載同科或同屬ITS2序列，以ITS2序列作為DNA條形碼，對所有序列進行遺傳距離、barcoding gap、Neighbor Joining（NJ）系統(tǒng)進化樹和ITS2序列二級結構分析，對?？扑幱弥参镞M行鑒定。通過DNA條形碼技術對桑科植物的分類進行研究，對具有藥用價值的桑科植物的研究提供基礎，同時也為進一步對峨眉山藥用植物資源的分布環(huán)境、種群量、種群動態(tài)等方面的調(diào)查分析奠定基礎。

表1 ?？浦参飿颖拘畔?/p>

1 材料

從四川省峨眉山區(qū)采集了25份桑科植物樣本，經(jīng)西南交通大學生命科學與工程學院宋良科副教授鑒定，其中桑樣品6份、地果樣品3份、冠毛榕樣品4份、異葉榕4份樣品、葎草樣品2份、小構樹樣品3份、構樹樣品3份樣品信息見表1。標本保存于西南交通大學標本室。同時在GenBank數(shù)據(jù)庫中下載?？浦参颕TS2序列23條，見表2。

2 方法

2.1 樣品DNA提取、PCR擴增及測序

參照任瑤瑤等[18]文章中樣品DNA提取、測序等方法，對所采集的樣本進行基因組DNA提取、ITS2片段PCR擴增及測序。

表2 GenBank下載?？浦参颕TS2序列

2.2 數(shù)據(jù)處理

圖1 ?？浦参飿颖痉N間和種內(nèi)距離

圖2 桑科藥用植物樣本ITS2序列種內(nèi)和種間變異分布

采用CodonCode Aligner 6.0.2軟件對所得序列峰圖進行校對拼接，去除引物區(qū)和低質(zhì)量的序列，由基于隱馬爾可夫模型（HMMer）的注釋方法切除ITS2兩端的5.8 S和28 S區(qū)域，獲得標準的ITS2間隔區(qū)序列[19]。所有ITS2序列用MEGA 6.0比對[20]進行種內(nèi)、種間的遺傳變異分析[21]、計算K2P（Kimura 2-parameter）遺傳距離、相鄰結合法（Neighbor Joining，NJ）構建系統(tǒng)進化樹[22]，利用Booststrap（1000重復）檢驗各分支的支持率。利用TAXON DNA 1.8和DNAMAN 8.0軟件對所有樣本種內(nèi)、種間遺傳距離進行分布頻度及樣本序列的變異程度進行分析，評價Barcoding gap。根據(jù)Koetschan等[23]建立的ITS2數(shù)據(jù)庫網(wǎng)站（http://its2.bioapps.biozentrum.uniwuerzburg.de）預測不同種屬樣本ITS2序列的二級結構。

3 結果

3.1 變異位點及種內(nèi)、種間K2P遺傳距離分析

所有ITS2序列長度為234-254 bp、GC含量58%-72%（見表1）。應用MEGA6.0軟件對所有樣品及下載序列進行多序列比對，全序列排序比對后序列長度為274 bp，種內(nèi)變異位點少，種間變異位點多，其中變異位點有185個，簡約性信息位點166個，分別占總序列長度的67.52%和60.58%。

物種間種內(nèi)距離越小、種間距離越大越適合條形碼鑒定[18]。參照陳士林等方法[16]，應用MEGA 6.0軟件基于K2P距離模型計算樣本種內(nèi)、種間變異距離值，結果見圖1。DNAMAN軟件對比序列發(fā)現(xiàn)：M.mongolica與M.alba種類序列相似度為100%，種間序列相似度為99.89%，兩者種間遺傳變異較??；而F.tikoua種內(nèi)序列相似度為99.50%，其種內(nèi)變異程度（K2P 0.012）大于M.mongolica與M.alba種間變異程度（K2P 0.005）。此外所有樣本種內(nèi)最大變異值為0.0049，所有樣本種間最小遺傳距離為0.041；由熱圖可見本實驗中?？茦悠贩N內(nèi)、屬內(nèi)顏色淺，其K2P遺傳距離較小；各屬之間遺傳距離較大，為圖中顏色較深區(qū)域；葎草屬與其他屬樣本種間遺傳變異值較大，在熱圖中所對應的區(qū)域顏色最深。分析統(tǒng)計樣本種內(nèi)和種間遺傳距離分布（圖2）發(fā)現(xiàn)：樣本間存在較為明顯的barcoding gap，說明ITS 2序列對?？茦颖驹诜N水平上鑒定能力較強；種間變異距離值主要集中在0.300-0.600區(qū)間，主要是構屬、葎草屬、榕屬之間的遺傳變異距離值組成。

3.2 NJ樹分析

利用MEGA 6.0軟件根據(jù)Kimura 2-parameter model對所有ITS2序列樣本構建Neighbor-joining（NJ）系統(tǒng)聚類樹（圖3），從NJ進化樹圖可以看出，各樣本屬內(nèi)各單據(jù)一支，分別為榕屬、桑屬、構屬、葎草屬，分支之間靴帶檢驗法（bootstrap）支持率在90%以上；各屬內(nèi)種內(nèi)之間又各聚為小枝，支持率在85%以上；由NJ進化樹可見，ITS2序列能將桑科樣本在種水平上很好地分開，鑒定成功率為100%。

3.3 ITS2二級結構的分析

?？浦参飿颖綢TS2序列的二級結構如圖4所示，從樣本的二級結構中可以看出，ITS2二級結構相互之間均有差異，其均為一個中心環(huán)及4個螺旋區(qū)（Helix）組成，中心環(huán)大小、形狀形成差異，在螺旋區(qū)莖環(huán)（Loop）數(shù)量、形狀及大小形成差異，四個螺旋區(qū)的夾角也有明顯差異。F.pumila、H.scandens、M.alba、B.papyrifera的中心環(huán)為異形，四者二級結構主要差異在于Ⅱ螺旋區(qū)莖環(huán)的大小數(shù)量差異。因此通過ITS2二級結構可將?？茦颖局懈鱾€種較為直觀地鑒別開來。

圖3 基于ITS序列構建的?？浦参飿颖镜腘J樹

4 結論

DNA條形碼技術旨在建立一種準確、方便、快捷且對技術要求不高的一種生物分類鑒定方法，ITS2序列對植物具有良好的擴增成功率和物種水平的鑒定成功率[24,25]，以ITS2序列作為DNA條形碼對?？浦参锏蔫b定進行研究可以達到即快速又準確。本研究將峨眉山區(qū)不同地方的25份?？浦参飿颖镜腎TS2序列分析，桑科樣本ITS2序列變異位點和簡約性信息位點在全序列中占比67.52%和60.58%，說明ITS2序列中存在大量的物種分類及進化信息，在對K2P遺傳距離分析通過桑科植物樣本種間和種內(nèi)距離的熱圖可以看出種內(nèi)顏色較淺、屬內(nèi)顏色次之，種內(nèi)和種間變異分布有明顯的barcoding gap，NJ樹可以看出桑科不同屬親緣關系較遠各聚一大支，而同屬之間親緣關系比較近，但是不同種也很明顯的各聚一小支。綜合所有樣本ITS2序列種內(nèi)、種間的變異距離值、barcoding gap分析、NJ樹構建及二級結構預測等多種方法從不同方面對考察了ITS2條形碼序列對?？浦参镨b定能力，結果均表明，以ITS2序列為DNA條形碼對?？扑幱弥参锓N水平上的鑒定能力強。

圖4 ?？艻TS2序列的二級結構

峨眉山資源植物品類齊全，尤其是在藥用、食用等方面的植物資源最為豐富多樣，是我國資源植物的重要野外基因庫，為當?shù)氐纳鐣c經(jīng)濟發(fā)展提供了獨特的、重要的支撐[26]。利用DNA條形碼技術，對資源植物進行快速、準確的鑒定，對峨眉山地區(qū)藥用植物資源進行廣泛地調(diào)查和分析，并對其進行認識、保護和合理開發(fā)利用。藥用植物資源的鑒定工作固然重要，但資源管理也相當重要，將二維DNA條形碼應用于中藥材鑒定，對中藥材流通的數(shù)字化監(jiān)管[27]的思路可借鑒到對藥用資源的調(diào)查中，結合分布環(huán)境，弄清種群量和種群動態(tài)等問題，正確的評價資源植物當前的狀況，在此基礎上制訂出切合實際的保護及合理開發(fā)利用的措施。

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