汪 靜

(武漢市艾格眼科醫(yī)院，湖北 武漢 430000)

隨著我國人口老齡化加劇，年齡相關性白內障發(fā)病率明顯提升〔1〕，但其發(fā)病機制仍未明確。目前研究認為，晶狀體上皮細胞凋亡是白內障發(fā)病的始動環(huán)節(jié)和病理生理改變基礎〔2〕。miRNA是一類內源性具有調控作用的非編碼RNA，可通過介導靶基因表達來發(fā)揮作用。相關研究已發(fā)現(xiàn)多種miRNA通過對人晶狀體上皮細胞凋亡發(fā)揮調控作用，影響白內障進程〔3〕。動物實驗表明，miR-126參與調控大鼠繼發(fā)性白內障的發(fā)病過程〔4〕，但對人白內障形成的影響和作用機制仍未明確。鋅指蛋白kruppel樣因子(KLF)6基因可參與哺乳動物體內細胞凋亡、衰老等生理過程的調節(jié)，緩解多種年齡相關性疾病進展〔5〕。相關研究顯示，在人晶狀體上皮細胞氧化損傷狀態(tài)下，上調KLF6表達水平可有效抑制細胞凋亡〔6〕，可見KLF6能夠抑制白內障病情發(fā)展。本次研究使用miR-126模擬物、抑制物轉染人晶狀體上皮細胞系HLEB3，分析miR-126對HLEB3凋亡的影響并探討其作用機制。

1 材料與方法

1.1材料與試劑 人晶狀體上皮細胞系HLEB3購于上海晶都生物技術有限公司；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清購于北京雅安達生物技術有限公司；脂質體2000購于上海依赫生物科技有限公司；Trizol試劑盒、SYBR?Green Kit試劑盒購于寶日醫(yī)生物技術有限公司；兔抗人KLF6多克隆抗體、小鼠免疫球蛋白(Ig)G二抗購于北京安必奇生物科技有限公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng)與轉染 HLEB3培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基中，放入37℃ 5%CO2孵箱中培養(yǎng)，取對數生長期的HLEB3接種到6孔板，調整細胞濃度至40%～60%并進行轉染。使用脂質體2000分別將100 nmol/L的miR-126 mimic(模擬物組)、miR-126 mimic Control(模擬物陰性對照組)、miR-126 inhibitor(抑制物組)、miR-126 inhibitor Control(抑制物陰性對照組)轉染到HLEB3中，向每個培養(yǎng)孔中加入不含胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基至終濃度體積為2 ml，轉染48 h后收集各組細胞。

1.2.2氧化凋亡模型構建 向不含胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中加入3%H2O2配制成終濃度為0.3 mmol/L的H2O2DMEM培養(yǎng)基，分別加入到轉染后的各組HLEB3中，同時設置凋亡模型組(使用未轉染的HLEB3構建凋亡模型)和正常HLEB3組(用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基正常培養(yǎng))，各組均放入37℃ 5%CO2孵箱中培養(yǎng)12 h，收集細胞。透射電解下觀察凋亡模型組和正常HLEB3組的細胞形態(tài)，驗證凋亡模型是否成功建立。

1.2.3qRT-PCR檢測 Trizol試劑盒收集各組細胞，按說明書要求提取總RNA，逆轉錄得到cDNA，使用SYBR?Green Kit試劑盒，RNU6B為內參照檢測miR-126的相對表達量，β-actin為內參檢測KLF6 mRNA的相對表達量。miR-126、RNU6B、KLF6、β-actin的特異性上、下游引物由金斯瑞生物科技有限公司合成。反應條件：95℃ 40 s，95℃ 10 s，55℃ 35 s，共40個循環(huán)，2-△△Ct法計算miR-126、KLF6 mRNA的相對表達量。

1.2.4Western印跡檢測 取各轉染組HLEB3，加入RIPA細胞裂解液靜置40 min，4℃下12 000 r/min恒溫離心30 min、取上清；行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，轉移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，加入兔抗人KLF6多克隆抗體(1∶200)，4℃緩慢搖動孵育過夜，加入HRP標記的小鼠IgG二抗(1∶1 000)，室溫孵育2 h，以GADPH為內參，采用Image J計算目標各帶灰度值。

1.2.5細胞凋亡檢測 胰蛋白酶消化各轉染組細胞，磷酸緩沖液洗滌、2 000 r/min離心10 min、棄上清。使用結合緩沖液將細胞濃度調整至1×105/ml，滴加5 μl Annexin V-FITC/PI雙染試劑，常溫下避光靜置20 min，將細胞轉移至冰上，分別加入500 μl 的結合緩沖液，混合均勻后放入流式細胞儀中檢測各轉染組HLEB3凋亡率。

2 結 果

2.1HLEB3凋亡模型形態(tài)學觀察及miR-126表達情況 電鏡下細胞形態(tài)學觀察顯示，正常HLEB3組形態(tài)規(guī)則，呈橢圓形，細胞膜結構完整，表面可見較多絨毛突起，細胞核清晰，染色體分布均勻，胞質中內質網和線粒體豐富，無凋亡改變，見圖1A、圖1B；凋亡模型組表面微絨毛明顯減少，細胞核體積減小且形狀不規(guī)則，核內染色質匯集，存在凋亡特異性標志物-凋亡小體，見圖1C、圖1D。凋亡模型組中miR-126相對表達量為3.39±0.61，明顯高于正常HLEB3組(1.20±0.42，P<0.01)。

圖1 正常HLEB3和凋亡模型透射電鏡下形態(tài)表現(xiàn)(×6 300)

2.2HLEB3轉染效率評定 轉染48 h后收集細胞，qRT-PCR檢測各組miR-126表達情況。結果顯示，模擬物組miR-126相對表達量(89.61±12.95)明顯高于模擬物陰性對照組(3.75±0.82，P<0.01)；抑制物組miR-126相對表達量(0.52±0.15)明顯低于抑制物陰性對照組(3.16±1.24，P<0.01)。

2.3miR-126對HLEB3凋亡的影響 流式細胞術檢測顯示，模擬物組HLEB3凋亡率〔(0.62±0.11)%〕低于模擬物陰性對照組〔(1.45±0.17)%,P<0.05〕；抑制物組HLEB3凋亡率〔(2.48±0.45)%〕高于抑制物陰性對照組〔(1.52±0.13)%,P<0.05〕。

2.4miR-126靶基因預測 使用目前引用次數最高的miRNA靶基因預測軟件(miRanda、miRecords、miRWalk)對 miR-126 靶基因進行預測，KLF6基因與miR-126存在潛在結合位點，可能通過靶向調控KLF6來影響HLEB3凋亡。

2.5miR-126對HLEB3中KLF6 mRNA和蛋白表達的影響 模擬物組HLEB3中KLF6 mRNA相對表達量(0.72±0.17)明顯低于模擬物陰性對照組(1.03±0.05)；抑制物組KLF6 mRNA相對表達量(1.95±0.20)，明顯高于抑制物陰性對照組(1.10±0.09，均P<0.05)。模擬物組HLEB3中KLF6 蛋白相對表達量(1.95±0.58)明顯低于模擬物陰性對照組(3.16±0.75)；抑制物組KLF6 蛋白相對表達量(4.82±0.37)明顯高于抑制物陰性對照組(3.20±0.59，均P<0.05)。見圖2。

1為模擬物組，2為模擬物陰性對照組，3為抑制物陰性對照組，4為抑制物組圖2 各組KLF6蛋白表達的Western印跡電泳圖

3 討 論

隨著我國人口老齡化加劇，白內障發(fā)病率和總患者數逐年提升，探尋白內障發(fā)病機制，對病情防治具有重要意義〔7〕。miRNA在哺乳動物中具有高度同源性，能夠與其靶基因配對結合并抑制翻譯過程、下調靶基因表達水平，導致基因沉默。最新研究發(fā)現(xiàn)miR-126不僅存于肺癌、肝細胞癌、卵巢癌等多種癌組織中，還分布于哺乳動物眼部，在晶狀體、角膜上皮細胞中〔8〕。動物實驗發(fā)現(xiàn)，白內障大鼠的晶狀體中miR-126是表達上調最明顯的miRNA之一〔9〕，提示其參與白內障進程的可能性較大，但具體機制仍未明確。

本研究顯示，在HLEB3凋亡模型中，miR-126表達水平明顯高于正常HLEB3；進一步在HLEB3凋亡模型中調節(jié)miR-126的表達水平，發(fā)現(xiàn)上調miR-126表達會明顯促進HLEB3凋亡，下調miR-126表達則明顯降低HLEB3凋亡。筆者通過靶基因預測軟件得到KLF6基因為miR-126的潛在結合位點，KLF6是一種多功能轉錄調節(jié)因子，在組織抗氧化損傷、維持細胞結構完整和穩(wěn)定性方面發(fā)揮重要作用。相關研究發(fā)現(xiàn)，KLF6基因在成年大鼠和人晶狀體上皮細胞中均存在高表達〔10〕。本次研究對miR-126可能通過潛在靶基因KLF6調控HLEB3凋亡過程的研究發(fā)現(xiàn)，上調miR-126表達會明顯降低KLF6基因表達水平，而下調miR-126表達會提升KLF6基因表達水平，提示KLF6基因表達與miR-126呈負相關，miR-126可通過靶向作用于KLF6基因來調控HLEB3凋亡，進而在白內障發(fā)病機制中發(fā)揮作用，可成為白內障治療的潛在新靶點。

1孟艷菊，尹則琳.天津市60歲及以上人群盲和低視力患病率及致盲原因〔J〕.中國老年學雜志，2016；36(1)：176-8.

2劉珍珍.Fas與H2O2誘發(fā)白內障中晶狀體上皮細胞凋亡的關系〔D〕.重慶：重慶醫(yī)科大學，2011.

3陳曉凱.慢性中心性漿液性脈絡膜視網膜病變患者雙眼脈絡膜厚度頻域光相干斷層掃描檢查價值評價〔J〕.中國衛(wèi)生工程學，2017；16(2)：213-4.

4高寧寧，宋凡倩，葛紅巖.miR-126與眼科疾病的研究進展〔J/OL〕.國際眼科雜志，2017；17(6)：1066-8.

5周 玉，東莉潔，張 紅，等.Krüppel樣因子6抑制人晶狀體上皮細胞增生的研究〔J〕.中華實驗眼科雜志，2014；32(4)：325-30.

6郭長艷.線粒體靶向性肽SS-31在H2O2誘導的人晶狀體上皮細胞凋亡中的保護作用〔D〕.濟南：山東大學，2014.

7李 卉，田 蕊，吳 怡，等.老年白內障患者晶狀體中20s Proteasome的表達〔J〕.中國老年學雜志，2016；36(20)：5125-7.

8李 琳.兩種不同超聲乳化白內障手術切口位置對白內障患者術后角膜散光的影響〔J〕.中國衛(wèi)生工程學，2017；16(2)：242-4.

9劉祥龍，賈秋菊，盧國強.零球差與負球差的非球面人工晶體植入術后視覺質量臨床研究〔J〕.北華大學學報(自然科學版)，2016；17(1)：92-4.

10陳再洪.Acrysof Toric人工晶體治療合并角膜散光老年性白內障的療效觀察〔J〕.北華大學學報(自然科學版)，2015；16(5)：635-7.