陳波，羅慶華，譚雅芹，閆慧清

（貴州師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，貴州貴陽 550001）

柑橘（Citrus reticulataBlanco）的栽培面積和果實(shí)產(chǎn)量均居各類水果首位。柑橘果實(shí)中富含維生素C、類胡蘿卜素、類黃酮、橙皮柑和膳食纖維等多種次生代謝產(chǎn)物，具有抗氧化活性、抗癌、預(yù)防心腦血管疾病以及抗菌作用等[1,2]。但在生活中有仍有部分人群食用后會(huì)有發(fā)癢、腫脹、哮喘及過敏性休克等過敏反應(yīng)[3]。柑橘過敏反應(yīng)主要是由IgE介導(dǎo)的I型變態(tài)反應(yīng)，其反應(yīng)包括呼吸系統(tǒng)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)和皮膚等不同形式的臨床癥狀[4]。過敏原分布在少數(shù)限定功能蛋白家族中[5]，包括有運(yùn)輸?shù)鞍?、病程相關(guān)蛋白、結(jié)構(gòu)蛋白、蛋白酶及蛋白酶抑制劑，如多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白 PGIP (Polygalacturonase inhibiting protein，PGIP)[6]。由于這些過敏原蛋白在不同物種之間的序列具有保守性，因此三維空間結(jié)構(gòu)很相似，易具有相似的抗原表位，因而易引起不同物種間的交叉過敏反應(yīng)[7]，它包括同一科（屬）水果和不同科（屬）內(nèi)的水果[8]，水果過敏原是導(dǎo)致水果過敏復(fù)雜性的關(guān)鍵物質(zhì)基礎(chǔ)之一，而不同植物過敏原分子結(jié)構(gòu)上共同的表位是免疫交叉反應(yīng)的基礎(chǔ)。

本文利用BLAST將柑橘中PGIP蛋白序列同其他物種進(jìn)行同源性對比，根據(jù)相似程度，利用其它植物在過敏原蛋白方面的研究與成果將有助于研究柑橘的過敏原蛋白，而這些過敏原表位往往位于細(xì)胞表面易于檢測與鑒定，所以本文對柑橘的柑橘多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白（PGIP）的B細(xì)胞抗原表位結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析，為尋找柑橘多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白（PGIP）B細(xì)胞抗原表位的最佳優(yōu)勢提供支持。同時(shí)本文構(gòu)建PET-28a-PGIP載體，對目的基因誘導(dǎo)進(jìn)行原核表達(dá)，為純化后進(jìn)行免疫學(xué)的深入研究提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 柑橘中PGIP氨基酸序列及同源比對

通過 NCBI（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）中檢索到PGIP的蛋白序列及其登錄號，得到PGIP多肽鏈中氨基酸的排列順序?yàn)橐患壗Y(jié)構(gòu)，并利用生物軟件BioEdit對不同中間的一級結(jié)構(gòu)進(jìn)行同源比對。

1.2 PGIP的二級結(jié)構(gòu)及蛋白特性分析

將在 NCBI上檢索到的氨基酸序列，利用DNAStar生物軟件中的Gamier-Robson方法對蛋白質(zhì)α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲的氨基酸區(qū)域進(jìn)行分析。再利用 DNAStar生物分析軟件中的protean程序，采用 Jameson-Wolf法[9]、Kyte-Doolittle法[10]、Emini法[11]和 Karplus-Schulz法[12]對柑橘過敏原蛋白PGIP的抗原指數(shù)、親水性、蛋白表面可及性及柔韌性進(jìn)行分析。將柑橘過敏原蛋白PGIP的二級結(jié)構(gòu)分析結(jié)果與抗原指數(shù)、親水性、蛋白表面可及性及柔韌性分析結(jié)果相結(jié)合，進(jìn)行綜合分析得出B細(xì)胞抗原表位。

1.3 原核表達(dá)載體PET-28a-PGIP的構(gòu)建

利用Trizol試劑盒（Invitrogen，貨號：15596026）提取成熟溫州蜜柑的果實(shí)總RNA，經(jīng)cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Thermo，K1622）后生成 cDNA，并設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增 PGIP基因的特異引物 F1：GGAATTCCATATGATGAGCAACACGTCACTG；R1：CCCCCCCGCTCGAGTCACTTGCAGCTTTCGA GGGGCGC。

PCR產(chǎn)物電泳檢測回收，連接入PMD18-T載體轉(zhuǎn)化測序。準(zhǔn)備經(jīng)測序可用的菌斑質(zhì)粒和 pET28a(+)載體質(zhì)粒，用BamHI和HindIII分別酶切、回收后進(jìn)行過夜連接，獲得重組質(zhì)粒 pET-28a-PGIP，經(jīng) PCR驗(yàn)證、酶切驗(yàn)證和測序證明后將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)移到大腸桿菌(Escherichia coli)中，對目的基因誘導(dǎo)進(jìn)行原核表達(dá)。

1.4 PET-28a-PGIP表達(dá)產(chǎn)物SDS-PAGE檢測

挑取陽性克隆，接種于 LB液體培養(yǎng)基（含Km=100 μg/mL）振蕩培養(yǎng)過夜，振蕩培養(yǎng)至 OD600約為0.6～1.0時(shí)，加IPTG至1.0 mM誘導(dǎo)0、1、2、5和7 h，收集菌液12000 r/min離心1 min，沉淀用SDS凝膠加樣緩沖液（Tris-HCl 50 mmol/L，pH 6.8；SDS 2%；二硫蘇糖醇100 mmol/L；溴酚藍(lán)0.1%；甘油10%）100 μL重懸。按比例配置5%濃縮膠溶液和10%分離膠溶液。在兩玻璃板的間隙中灌注分離膠，留出濃縮膠所需體積，用少量水封蓋。待分離膠聚合后(30 min)，傾出水；在已聚合的分離膠上直接灌注濃縮膠，并插入干凈的梳子。濃縮膠聚合完全后(30 min)，小心移出梳子，每個(gè)樣品 20 μL，接上電源。所選用的蛋白Marker是 140-15 ku(NexusView?20 ku Dual Color,Bionexus, USA)。電泳完成后經(jīng)考馬斯亮藍(lán)R250染色后，更換脫色液四、五次。脫色后可將凝膠浸于水中以便觀察。

2 結(jié)果與分析

2.1 PGIP蛋白質(zhì)序列的同源比對

通過 NCBI（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）中檢索柑橘中PGIP的蛋白質(zhì)序列，其登陸號為BAA31841.1。PGIP一共編碼327個(gè)氨基酸，所對應(yīng)序列為：

MSNTSLLSLFFFLCLCISPSLSDLCNPNDKKVL LKFKKSLNNPYVLASWNPKTDCCDWYCVTCDLT TNRINSLTIFAGDLPGQIPPEVGDLPYLETLMFHKL PSLTGPIQPAIAKLKNLKTLRISWTNISGPVPDFISQL TNLTFLELSFNNLSGTIPGSLSKLQKLGALHLDRN KLTGSIPESFGTFTGSIPDLYLSHNQLSGKIPASLGS MDFNTIDLSRNKLEGDASFLFGLNKTTQRIDVSRN LLEFNLSKVEFPQSLTNLDLNHNKIFGSIPAQITSLE NLGFLNVSYNRLCGPIPVGGKLQSFGYTEYFHNR CLCGAPLER。

圖1 柑橘中PGIP與其他物種的同源比較Fig.1 Amino acid sequence alignments of PGIP in citrus with other plants

PGIP的結(jié)構(gòu)域包含有LRR_2、LRR_1和Internal repeat 1，分別位于柑橘氨基酸序列的26-64、142-164和189-310。利用BLAST對柑橘中PGIP蛋白的蛋白質(zhì)序列與其他物種，如蘋果(Malus pumila)、梨(Pyrus)、中國李(Prunus salicina)和葡萄(Vitis vinifera)進(jìn)行同源性比對搜索后的結(jié)果如下圖 1，且氨基酸序列的相似度分別為74%、75%、73%和73%，表明其在氨基酸序列上有較高的相似性，說明這些物種之間可能存在著交叉過敏的現(xiàn)象。

2.2 柑橘PGIP的B細(xì)胞抗原表位分析

2.2.1 柑橘中PGIP蛋白二級結(jié)構(gòu)分析結(jié)果

利用DNAStar生物軟件中Gamier-Robson方法對柑橘中PGIP蛋白的α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲的氨基酸區(qū)域進(jìn)行分析，得到的結(jié)果如圖2所示。

圖2 柑橘多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白的α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲相對應(yīng)的氨基酸序列Fig.2 The corresponding α-helix, β-helix, β-turn and coil amino acid sequences of citrus PGIP

將PGIP的二級結(jié)構(gòu)和其所對應(yīng)的氨基酸序列分別列出，得到柑橘中過敏原 PGIP蛋白的序列如表 1所示。

表1 分析柑橘多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白的二級結(jié)構(gòu)氨基酸序列Table 1 Prediction secondary amino acid sequences of citrus PGIP

2.2.2 Profilin蛋白與PGIP蛋白抗原指數(shù)、柔韌性、親水性及蛋白表面可及性分析

圖3 柑橘中PGIP蛋白的抗原指數(shù)、柔韌性、親水性及蛋白表面相對應(yīng)的氨基酸序列Fig.3 The hydrophilicity, flexible regions, antigenic index and surface probability amino acid sequences of citrus PGIP

利用DNAStar生物軟件中Jameson-Wolf方法分析得到柑橘過敏原蛋白PGIP的抗原指數(shù)、Karplus-Schulz得到柔韌性，Kyte-Doolittle法和Emini法分別獲得親水性和表面可及性的氨基酸序列，其具體的序列分布如圖3所示。

當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)的親水性＞0、柔韌性＞0蛋白表面可及性＞1和抗原指數(shù)＞0時(shí)，形成與抗原結(jié)合表位的可能性增大，因此根據(jù)上圖 3中顯示的區(qū)域結(jié)合 Profilin在親水性＞0、柔韌性＞0蛋白表面可及性＞1和抗原指數(shù)＞0時(shí)所對應(yīng)的氨基酸序列進(jìn)行列表，結(jié)果如表2所示。

表2 柑橘中PGIP蛋白抗原指數(shù)、柔韌性、親水性及蛋白表面可及性的氨基酸序列Table 2 Prediction of citrus PGIP antigenic index, flexible Regions, hydrophilicity and surface Probability

柔韌性＞0 5、19～22、26～30、36～42、50～53、66～70、78～90、102～110、116～120、128～134、139～131、153～165、173～194、200～206、220～229、235～243、244～245、254、257～263、281～284、299～306抗原指數(shù)＞0 1～3、18～44、48～58、64、66～72、79～92、102～105、114～122、128～133、149～155、157、159～160、162～166、171～184、188～194、199～207、212、214～217、219～229、235～249、252～263、265～273、283～284、292`296、302～307、310、315～321、324～327蛋白表面可及性＞1 1～20、27～30、35～41、49～52、66、68～69、83～84、87、92、116～120、160、163～165、172～177、198、200、202、221～226、236～240、243、247、252、254、256～257、259、261、268、292、309～315、325～327

2.2.3 PGIP的B細(xì)胞抗原表位分析蛋白質(zhì)的表面可及性、親水性和柔韌性等在抗原的形成方面發(fā)揮著重要作用，當(dāng)親水性＞0、柔韌性＞0、抗原指數(shù)＞0、表面可及性＞1時(shí)，形成抗原表位的可能性大[9]，PGIP二級結(jié)構(gòu)中的α-螺旋和β-折疊因氫鍵存在使得結(jié)構(gòu)較穩(wěn)定，因此不易與B細(xì)胞等其他物質(zhì)發(fā)生作用，而PGIP的β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲的氨基酸區(qū)域多位于蛋白質(zhì)表面，較易與抗體結(jié)合，形成B細(xì)胞抗原表位的可能性也越大。因此綜合以上所有參數(shù)，將滿足要求的氨基酸序列進(jìn)行綜合，得到柑橘中PGIP的抗原結(jié)合區(qū)氨基酸的序列分別為 19～22、37～41、49～52、68～69、117～120、163～164、173～177、221～226、236～240。

2.3 柑橘PET-28a-PGIP的載體構(gòu)建及表達(dá)產(chǎn)物檢測

圖4 PET-28a-PGIP載體構(gòu)建圖Fig.4 The construction of PET-28a-PGIP

從溫州蜜柑的果實(shí)中擴(kuò)增得到PGIP的cDNA片段大約在1 kb(圖4a)。用BamH Ⅰ和Hind Ⅲ分別酶切PGIP和PET-28a(圖4b)后，并連接轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中，得到的陽性克隆經(jīng)菌液PCR(圖4c)和酶切驗(yàn)證后(圖4d)表示載體構(gòu)建PET-28a-PGIP成功。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)移到大腸桿菌(Escherichia coli)進(jìn)行增值。經(jīng)IPTG誘導(dǎo)原核細(xì)胞表達(dá)和SDS-PAGE電泳后，得到的結(jié)果如圖5所示，可以發(fā)現(xiàn)在36 ku和50 ku之間有大量的蛋白質(zhì)被誘導(dǎo)產(chǎn)生，而PGIP蛋白的大小36.69 ku，說明將重組載體轉(zhuǎn)入到大腸桿菌中得到大量的PGIP蛋白。

圖5 不同時(shí)間誘導(dǎo)下PGIP的SDS-PAGE電泳檢測圖（CK為空載，M為marker）Fig.5 The SDS-PAGE detection of PGIP expressed at different time (CK was used as control, M is abbreviation of marker)

3 討論

抗原表位是抗原分子中能激發(fā)B細(xì)胞產(chǎn)生抗體并與抗體分子結(jié)合的一段序列，是抗原分子啟動(dòng)機(jī)體免疫反應(yīng)最基本的結(jié)構(gòu)單位[13]。引發(fā)柑橘過敏反應(yīng)的免疫學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)就是過敏原 PGIP的結(jié)構(gòu)表位[14,15]。對柑橘過敏原PGIP進(jìn)行B細(xì)胞表位的分析，可為開展低過敏性或無過敏性的柑橘制品加工以及過敏原的檢測等研究工作提供理論和技術(shù)依據(jù)。

PGIP的結(jié)構(gòu)域包括LRRNT_2（富含亮氨酸重復(fù)N端結(jié)構(gòu)域）和LRR_1（富亮氨酸重復(fù)）。多序列比對表明，PGIP與其他物種的PGIP蛋白在氨基酸序列上有較高的相似性，都參與至于的抗病免疫系統(tǒng)。豐富的亮氨酸重復(fù)結(jié)構(gòu)域是參與形成蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)相互作用[16]。

富含亮氨酸的結(jié)構(gòu)域較小，是經(jīng)典的免疫球蛋白域的特征。LRR是豐富重復(fù)的亮氨酸在其他植物生長發(fā)育和抗病反應(yīng)等方面發(fā)揮著重要作用[17]，同時(shí)也會(huì)影響植物病原體和綜合防御反應(yīng)的感染[18]。很多數(shù)據(jù)表明動(dòng)物組織和植物之間在非自我識別系統(tǒng)和抗菌防御之間有著驚人的相似之處[19]。

4 結(jié)論

通過對PGIP的B細(xì)胞抗原表位的分析，可利用該片段進(jìn)行基因功能改造，為后續(xù)研究培育低過敏的柑橘品種提供了一定的理論依據(jù)。本文中對于抗原性的分析均為二級結(jié)構(gòu)，對一些表位特別是通過三維結(jié)構(gòu)表現(xiàn)其抗原性的構(gòu)象依賴型抗原表位具有一定的局限性，研究結(jié)果可以作為確定柑橘PGIP蛋白潛在表位的參考。實(shí)驗(yàn)通過構(gòu)建PET-28a-PGIP原核表達(dá)得到大量誘導(dǎo)產(chǎn)生的 PGIP蛋白，可以將誘導(dǎo)產(chǎn)生的蛋白質(zhì)與病原菌進(jìn)行免疫雜交反應(yīng)和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)鑒定，進(jìn)一步驗(yàn)證其生物學(xué)功能。

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