周 娜，劉偉江，李 蘋，3，孟祥宇，王 洋，王 鵬，樊 月，劉元林，李 雪，鄭榮秀，張 毅

（1.天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院兒科，天津 300052；2.軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院輻射醫(yī)學(xué)研究所，北京 100850；3.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京兒童醫(yī)院，北京 100045）

隨著現(xiàn)代生活水平的不斷提高，1型糖尿?。╰ype 1 diabetes mellitus，T1DM）患者呈不斷上升趨勢，已成為威脅青少年和兒童健康的主要代謝疾病之一。T1DM是一種自身免疫性疾病，多由T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)，造成胰島β細(xì)胞破壞，使其喪失合成和分泌胰島素的功能，進(jìn)而引起糖代謝紊亂［1]。目前，T1DM仍以胰島素治療為主，如果治療不及時則可能出現(xiàn)嚴(yán)重并發(fā)癥，影響患者的生活質(zhì)量并危及生命［2]。因此，尋找最佳的治療方法是當(dāng)今研究的熱點。近年來，間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSC）治療T1DM受到廣泛關(guān)注［3-4]。MSC是一種來源于中胚層的具有自我更新和多向分化潛能的成體干細(xì)胞［5-6]，具有低免疫原性和免疫調(diào)節(jié)等生物學(xué)功能［7-8]，可作用于多種免疫細(xì)胞，如T和B淋巴細(xì)胞為主的適應(yīng)性免疫細(xì)胞及巨噬細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞等固有免疫細(xì)胞［9-10]。目前已有研究表明，MSC通過改善T1DM的免疫紊亂狀態(tài)及保護(hù)殘存的β細(xì)胞，進(jìn)而有效改善血糖狀態(tài)［11]。但具體機(jī)制仍不清楚。

巨噬細(xì)胞作為人體天然免疫的主要成員之一，可參與多種炎癥性疾病的發(fā)生發(fā)展［12]。在不同微環(huán)境下，可分化為作用相反的2個亞群，即經(jīng)典活化M 1型和選擇性活化M 2型。M 1型巨噬細(xì)胞激活后可分泌促炎癥反應(yīng)因子，如誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS），腫瘤壞死因子αα（tumor necrosis factor-α，TNF-α），白細(xì)胞介素1β（interleukin-1β，I L-1 β）和I L-1 2等；M 2型巨噬細(xì)胞活化后可促進(jìn)抗炎因子I L-1 0和I L-4及轉(zhuǎn)化生長因子 β（transforming growth factor β，TGF-β）分泌而抑制炎癥發(fā)生，精氨酸酶1（arginase-1，A r g-1）是其表達(dá)的主要分子之一［13-14]?，F(xiàn)有研究已表明，M S C可調(diào)控巨噬細(xì)胞表型，促進(jìn)其由促炎M 1型向抗炎M 2型極化，從而抑制炎癥反應(yīng)，維持微環(huán)境的穩(wěn)態(tài)［15-16]；且移植M S C可通過募集M 2型巨噬細(xì)胞使胰島β細(xì)胞增殖和再生，進(jìn)而影響T1DM的病理生理過程［17-18]。但M S C是否通過調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞極化，從而減輕T1DM模型小鼠的炎癥反應(yīng)仍不清楚。為此，本研究通過對T1DM模型小鼠進(jìn)行M S C治療，進(jìn)一步探討M S C調(diào)控巨噬細(xì)胞極化、減輕T1DM小鼠炎癥反應(yīng)的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

30只6周齡雄性C 5 7 B L/6 J小鼠，體質(zhì)量為1 8～2 1 g，購自北京維通利華實驗動物有限公司，動物合格證號：SCXK-（京）2016-0006。在1 2 h晝夜交替下，飼養(yǎng)于軍事醫(yī)學(xué)研究院實驗動物中心；環(huán)境溫度保持在2 2～2 5℃，相對濕度為3 5%～5 0%。另5只1周齡雄性C57BL/6J小鼠（購自北京維通利華）用于M S C的分離培養(yǎng)。所有的動物實驗過程經(jīng)院實驗動物倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 試劑和主要儀器

鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）、Trizol、油紅O、地塞米松、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤（3-isobutyl-1-methylxanthine，IBMX）、胰島素、β-磷酸甘油、維生素C磷酸鹽、丙酮酸和堿性磷酸酶購自美國Sigma公司；檸檬酸、檸檬酸鈉和1 0%中性甲醛購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；牛血清白蛋白購自北京Solarbio科技有限公司；兔抗小鼠胰島素抗體（一抗）購自美國A b c a m公司；HRP-山羊抗兔I g G抗體（通用型，二抗）及D A B顯色劑購自丹麥DAKO公司；α-M E M、0.2 5%胰酶、PBS及胎牛血清購自美國Gibco公司；流式抗體（抗小鼠Ia，CD11b，Sca-1，CD105，CD34，CD45，CD31和C D 2 9抗體）購自美國ThermoFisher公司，APC-F4/80，PE-CD16/32和FITC-CD206抗體購自美國eBioscience公司；RTase M-MLV、RNA酶抑制劑及5×RTase M-MLV緩沖液購自日本TaKaRa公司；DTT、dNTP、無RNA酶水和2×Μltra Master Mix購自中國康為世紀(jì)有限公司；所用引物由安徽通用生物系統(tǒng)有限公司合成，引物序列見表1。

Tab.1 PCR primer sequence

穩(wěn)擇易型血糖試紙和血糖儀購自美國強(qiáng)生公司；Qubit?2.0熒光定量儀、臺式低溫冷凍離心機(jī)、7500 Real Time System、常溫臺式離心機(jī)及細(xì)胞培養(yǎng)箱購自美國Thermo Fisher公司；流式細(xì)胞儀Facscalibur購自美國BD公司；光學(xué)顯微鏡購自日本Olympus公司。

1.3 骨實質(zhì)來源MSC的分離培養(yǎng)和鑒定

在無菌條件下分離7日齡小鼠股骨及脛骨，用眼科鑷將骨碎片轉(zhuǎn)移至盛有1 mLⅡ型膠原酶的EP管中，37℃恒溫消化45 min后，將骨碎片轉(zhuǎn)移至含10%胎牛血清的α-MEM完全培養(yǎng)基中，采用骨片貼壁法培養(yǎng)小鼠骨片來源的MSC。傳至第3代（P3），采用流式細(xì)胞術(shù)、體外成脂及成骨誘導(dǎo)分化等方法鑒定分離培養(yǎng)MSC［8]。流式細(xì)胞儀檢測所用抗體為FITC-抗小鼠Ia，F(xiàn)ITC-抗小鼠CD11b，F(xiàn)ITC-抗小鼠 Sca-1，PE-抗小鼠CD105，F(xiàn)ITC-抗小鼠CD34，F(xiàn)ITC-抗小鼠CD45，PE-抗小鼠CD31及PE-抗小鼠CD29。同時將細(xì)胞接種6孔板，用含10%胎牛血清的α-MEM培養(yǎng)基進(jìn)行成脂（地塞米松1 μmol·L-1，胰島素10 μg·L-1，IBMX 0.5 mmol·L-1和吲哚美辛 0.5 mmol·L-1）及成骨（地塞米松0.1 μmol·L-1，維生素C磷酸鹽50 μmol·L-1和β-磷酸甘油10 mmol·L-1）誘導(dǎo)分化，分別培養(yǎng)8和10 d，用油紅O染料工作液染色及實時熒光定量PCR（RT-PCR）檢測成脂分化關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子CCAAT增強(qiáng)子結(jié)合蛋白α（CCAAT enhancer binding protein alpha，CEBPα）和過氧化物酶體增殖物激活受體（peroxisome proliferator activated receptor gamma，PPARγ）mRNA表達(dá)。用堿性磷酸酶染料工作液染色及RT-PCR檢測成骨分化關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子骨鈣素（osteocalcin）和Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2（Runt related transcription factor 2，Runx2）mRNA表達(dá)。

1.4 1型糖尿病小鼠模型制備和MSC治療

所有小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)2 d后隨機(jī)分為2組：正常對照組（n=10）和T1DM組（n=20）。正常對照組不做任何處理；T1DM組小鼠禁食12 h、禁水8～10 h后，ip給予含STZ 50 mg·kg-1檸檬酸鈉緩沖液，每日1次，連續(xù)5 d。第1次注射后，即刻恢復(fù)自由飲食；給藥第12天，連續(xù)3 d通過尾靜脈取血測隨機(jī)血糖，血糖平均值≥16.7 mmol·L-1即為建模成功。將建模成功的小鼠隨機(jī)分為T1DM模型組（n=10）和MSC治療組（n=10）。成模后第1和第15天，MSC治療組由尾靜脈注射MSC 5×105，正常對照組和T1DM模型組注射PBS；每周檢測小鼠隨機(jī)血糖和體質(zhì)量。28 d后處死小鼠，用PBS反復(fù)灌洗腹腔，將灌洗液6000×g離心3 min，獲腹腔巨噬細(xì)胞；隨后取胰腺等組織待測。

1.5 胰腺組織HE染色和免疫組化檢測

胰腺組織取出后，立即置10%中性甲醛溶液中固定，采用H E染色檢測胰腺中胰島組織形態(tài)是否飽滿及胰島細(xì)胞分布是否均勻，以判斷病變程度［19]；采用免疫組化法檢測胰島素分泌水平及巨噬細(xì)胞（F 4/8 0）數(shù)量［18]。

1.6 實時熒光定量PCR法檢測腹腔巨噬細(xì)胞標(biāo)志分子和炎癥因子mRNA表達(dá)

Trizol法提取腹腔巨噬細(xì)胞總RNA，取1μg RNA逆轉(zhuǎn)錄為c D N A；R T-P C R法檢測腹腔巨噬細(xì)胞標(biāo)志分子（iNOS和A r g-1）及炎癥因子（I L-1 β，I L-4，I L-6，I L-1 0，I L-1 2，I F N-γ，T N F-α和T G F-β）m RNA表達(dá)。反應(yīng)體系為cDNA1 μ L，P C R上下游引物（1 0 μ m o l·L-1）1 μL，q-P CRMaster Mix 1 0 μ L 和無RNA酶水8 μ L；反應(yīng)條件為9 5℃ 10 min，（9 5℃ 15 s，60℃ 1 min）40個循環(huán)，95℃15s，60℃1min，95℃15s。GAPDH為內(nèi)參基因，采用 2-△△Ct表示待測基因mRNA表達(dá)水平。

1.7 流式細(xì)胞術(shù)檢測腹腔巨噬細(xì)胞M1和M2表型

取腹腔巨噬細(xì)胞，加入流式抗體A P C-抗小鼠F 4/8 0，P E-抗小鼠C D 1 6/3 2及F I T C-抗小鼠C D 2 0 6抗體，避光孵育3 0 min；加入P B S 1 m L洗滌，4 5 0×g，離心5 min，棄上清，加入4%多聚甲醛2 0 0 μ L固定，上機(jī)檢測。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 骨實質(zhì)來源MSC的鑒定

分離培養(yǎng)的MSC呈均一的纖維樣長梭形、旋渦狀貼壁生長（圖1A）。流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果表明，細(xì)胞高表達(dá)Sca-1，CD29和CD105；不表達(dá)或低表達(dá)CD31，CD34，CD45，Ia和CD11b（圖1B）。油紅O染色結(jié)果顯示，分離培養(yǎng)的MSC成脂誘導(dǎo)后出現(xiàn)大量紅色脂滴（圖1C），且成脂關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子CEBPα和PPARγ表達(dá)顯著增加（P＜0.01，圖1D）。成骨誘導(dǎo)后，堿性磷酸酶活性增加（圖1E），成骨關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子骨鈣素和Runx2表達(dá)亦顯著增加（P＜0.01，圖1F）。上述結(jié)果提示，成功分離培養(yǎng)小鼠骨實質(zhì)來源的MSC。

2.2 MSC治療對T1DM模型小鼠隨機(jī)血糖和體質(zhì)量的影響

Fig.1 Pluripotency characteristics of mesenchymal stem cells（MSCs）derived from mouse compact bone. A：MSCs derived from murine compact bone were digested by collagenase and amplified to the passage 3（P3）in vitro. Cell morphologywas shown；B：expression status of surface molecules on MSCs was analyzed by flow cytometry；C：oil red O staining of adipocytesdifferentiated from MSCs；D：RT-PCR analyses of adipogenic markers in MSCs after adipogenic induction；E：alkaline phosphatasestaining of osteoblasts differentiated from MSCs；F：RT-PCR analyses of osteogenic markers in MSCs after osteogenic induction.n=3，＊＊P＜0.0 1，compared with corresponding control group.

與正常對照組比較，T1DM模型組小鼠隨機(jī)血糖顯著升高（P＜0.0 5）；與T1DM模型組相比，MSC治療組小鼠隨機(jī)血糖在治療7 d后逐漸下降，治療2 1 d后顯著降低（P＜0.0 5），2 8 d后降低（2 5.0±0.1）%（P＜0.0 5），但未降至正常對照組水平（P＜0.0 5）。與正常對照組相比，T1DM模型組小鼠體質(zhì)量明顯降低（P＜0.0 5），M S C治療組體質(zhì)量在治療后7 d內(nèi)即開始增長，2 8 d后增加（1 2.0±0.4）（P＜0.0 5）（圖2）。

2.3 MSC治療對T1DM模型小鼠胰島素分泌和巨噬細(xì)胞數(shù)的影響

Fig.2 MSCs ameliorated non-fasting blood glucosed（A）and body mass（B）of streptozotocin（STZ）-induced type 1 diabetes mellitus（T1DM）model mice.T1DM was induced in male C57BL/6 mice using STZ 50 mg·kg-1intraperitoneal injection，5×105MSCs were injected into mice via tail vein injection route on the 1stday and the 15thday after incidence of diabetes.Blood glucose concentration exceeding 16.7 mmol·L-1in three consecutive daily measurements was considered diabetes.s，n=10.＊P＜0.05，compared with normal control group；#P＜0.05，compared with T1DM model group.

HE染色結(jié)果顯示，T1DM模型組小鼠胰腺組織形態(tài)已完全被破壞，炎癥細(xì)胞浸潤明顯較多；MSC治療組胰腺組織形態(tài)較模型組改善，細(xì)胞分布大體均勻一致，炎癥細(xì)胞浸潤較少（圖3A）。免疫組化結(jié)果表明，T1DM模型組小鼠與正常對照組相比胰島素分泌顯著減少；與模型組相比，MSC治療組胰島素分泌增多（圖3B）；胰腺組織中F4/80陽性細(xì)胞數(shù)即巨噬細(xì)胞數(shù)量明顯增加（圖3C）。

2.4 MSC治療對T1DM模型小鼠腹腔巨噬細(xì)胞炎癥因子mRNA表達(dá)的影響

與正常對照組比較，T1DM模型組小鼠腹腔巨噬細(xì)胞促進(jìn)炎癥因子 IL-1β，TNF-α，IL-6和 IL-12 mRNA表達(dá)顯著增加（P＜0.05），IFN-γ無明顯變化；抑制炎癥因子IL-4，IL-10和TGF-β表達(dá)則顯著降低（P＜0.05）。與模型組相比，MSC治療組炎癥因子IL-1β，TNF-α，IL-6和IL-12 mRNA表達(dá)顯著下降（P＜0.05，P＜0.01），抑制炎癥反應(yīng)IL-4，IL-10和TGF-β mRNA表達(dá)顯著增加（P＜0.05）（圖4）。

2.5 MSC治療促進(jìn)T1DM模型小鼠M2型巨噬細(xì)胞極化

由圖5所示，與正常對照組比較，T1DM模型組M1型巨噬細(xì)胞百分比升高到至（50.1±1.2）%（P＜0.05），其標(biāo)志分子iNOS mRNA表達(dá)升高（P＜0.01）；M2型巨噬細(xì)胞百分比下降到（22.5±4.0）%，其標(biāo)志分子Arg-1 mRNA表達(dá)下降（P＜0.05）；M2/M1比值降低（P＜0.05）。與T1DM模型組比較，MSC治療組M1型巨噬細(xì)胞百分比降低至（15.6±1.2）%，iNOS mRNA表達(dá)降低（P＜0.01）；M2型巨噬細(xì)胞百分比升高至（72.5±3.4）%，Arg-1 mRNA表達(dá)升高（P＜0.01）；M2/M1比值升高（P＜0.05）。

Fig.3 MSC treatment for 28 d decreased severity of insulitis and macrophage count in STZ-induced T1DM model mice.See Fig.2 for the mouse treatment.A：HE staining，the arrows show islet tissue；B：immunohistochemistry examination，the arrows show insulin secretion；C：immunohistochemistry examination，the arrows show the positive of F4/80.

Fig.4 MSC treatment up-regulated anti-inflammatory factors and down-regulated proinflammatory factors expression on peritoneal macrophages in STZ-induced T1DM model mice detected by RT-PCR.See Fig.2 for the mouse treatment.A：proinflammatory factors；B：anti-inflammatory factors，n=10.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with normal control group；#P＜0.05，##P＜0.01，compared with T1DM model group.

Fig.5 MSC treatment for 28 d promotes M2 macro?phage polarization in STZ-induced T1DM model mice.See Fig.2 for the mouse treatment.A：population of M1 cells；B：population of M2 cells；C：ratios of M2/M1；D：mRNA expression of iNOS on M1 cells；E：mRNA expression of Arg-1 on M2 cells.，n=10. ＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with normal control group；#P＜0.05，##P＜0.01，compared with T1DM model group.

3 討論

T1DM是青少年和兒童中常見的一種自身免疫性疾病，目前依舊是以胰島素治療為主，盡管隨著胰島素給藥方式的改進(jìn)，已能改善患者的生活質(zhì)量和身心健康［19]，但尚不能有效的降低其并發(fā)癥的發(fā)生率。目前研究發(fā)現(xiàn)，T1DM發(fā)病原因有很多，但主要病因是由于胰島β細(xì)胞進(jìn)行性破壞，進(jìn)而導(dǎo)致胰島素分泌不足和調(diào)節(jié)障礙。具體發(fā)病機(jī)制尚不清楚。但現(xiàn)有研究已證實，T1DM的發(fā)病機(jī)制涉及T細(xì)胞及多種固有免疫細(xì)胞如巨噬細(xì)胞等之間的相互調(diào)控，而這些免疫細(xì)胞數(shù)量的改變可造成胰島β細(xì)胞的損傷或減少［19-20]。因此，機(jī)體免疫紊亂狀態(tài)的糾正有望為T1DM的治療提供新的思路和靶點［22]。

MSC作為一種多能的成體干細(xì)胞，具有多向分化潛能、低免疫原性和免疫調(diào)節(jié)能力［23]，可作用于多種免疫細(xì)胞，如T及B淋巴細(xì)胞為主的適應(yīng)性免疫細(xì)胞及巨噬細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞及樹突狀細(xì)胞等固有免疫細(xì)胞［9-10]?，F(xiàn)有實驗研究已證實，MSC治療可改善T1DM的免疫紊亂狀態(tài)，但具體機(jī)制尚不清楚［24]。本研究發(fā)現(xiàn)，MSC治療組小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的炎癥因子IL-1β，IL-6，IL-12和TNF-α mRNA表達(dá)下降，其中早期炎癥因子IFN-γ mRNA表達(dá)無明顯差異，而抑制炎癥反應(yīng)的IL-10，IL-4及TGF-β mRNA表達(dá)顯著增加，提示MSC可通過巨噬細(xì)胞調(diào)節(jié)免疫，從而減輕糖尿病的炎癥反應(yīng)。IFN-γ表達(dá)無明顯差異可能與檢測時間等相關(guān)，需進(jìn)一步研究。

巨噬細(xì)胞作為人體一種重要的固有免疫細(xì)胞，在抗擊病原微生物及損傷修復(fù)等方面有重要作用，并能隨微環(huán)境的變化而向不同亞群（M1和M2）進(jìn)行分化。其中M1型巨噬細(xì)胞有助于宿主防御外來微生物的侵襲，但持續(xù)活化可造成機(jī)體慢性炎癥的發(fā)生，此時若M2型巨噬細(xì)胞發(fā)生極化，可發(fā)揮抗炎的作用。但體內(nèi)外實驗表明，機(jī)體M1型巨噬細(xì)胞不易向M2型巨噬細(xì)胞進(jìn)行極化。目前已有研究發(fā)現(xiàn)，MSC移植能調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞的表型，促進(jìn)其從促炎的M1型向抗炎的M2型極化，從而發(fā)揮抑制炎癥反應(yīng)、維持微環(huán)境穩(wěn)態(tài)的作用［15，26]。此外，也有動物實驗結(jié)果表明，給T1DM小鼠移植MSC，可募集M2巨噬細(xì)胞，促使胰島β細(xì)胞再生，以減輕糖尿病反應(yīng)［27]。而巨噬細(xì)胞極化是否參與T1DM小鼠的炎癥反應(yīng)過程仍不清楚。為此本研究制備了T1DM模型小鼠，用MSC移植治療，檢測體內(nèi)腹腔巨噬細(xì)胞的M2/M1比值，RT-PCR檢測腹腔巨噬細(xì)胞相關(guān)炎癥因子mRNA表達(dá)。結(jié)果顯示，MSC治療組小鼠的血糖、體質(zhì)量等生理指標(biāo)均優(yōu)于T1DM模型組。HE染色和免疫組化結(jié)果也顯示，MSC治療組胰島損傷程度均優(yōu)于模型組，說明MSC可治療小鼠的T1DM。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果表明，MSC組M2/M1型巨噬細(xì)胞的比值顯著高于T1DM模型組；RT-PCR比較分析兩組小鼠腹腔巨噬細(xì)胞中M1和M2型巨噬細(xì)胞相關(guān)基因的表達(dá)水平。結(jié)果表明，相較于T1DM模型組，MSC治療組M2型巨噬細(xì)胞相關(guān)基因Arg-1表達(dá)水平顯著上升，M1型巨噬細(xì)胞相關(guān)基因iNOS表達(dá)水平顯著下降。據(jù)報道，MSC免疫調(diào)節(jié)具有可塑性，其在T1DM模型小鼠中如何促進(jìn)M2型巨噬細(xì)胞極化，以及糖尿病炎癥微環(huán)境如何誘發(fā)MSC調(diào)節(jié)固有免疫細(xì)胞的炎癥反應(yīng)，仍需進(jìn)一步探究。IL-1β作為固有免疫反應(yīng)的重要因子，不僅可介導(dǎo)炎癥反應(yīng)，也可參與細(xì)胞凋亡過程；MSC治療T1DM后IL-β分泌減少，同時可能抑制了其誘發(fā)凋亡反應(yīng)，仍需深入研究，這也對MSC治療T1DM疾病提供了新的研究方向。

綜上所述，MSC移植可減輕T1DM模型小鼠的炎癥反應(yīng)，其機(jī)制可能與調(diào)控MI和M2巨噬細(xì)胞極化有關(guān)，MSC促進(jìn)M2型巨噬細(xì)胞增多，抑制M1型巨噬細(xì)胞在小鼠T1DM模型中產(chǎn)生的炎癥反應(yīng)，從而減輕T1DM的發(fā)展。本研究為MSC治療T1DM提供了新的理論依據(jù)，為深入了解MSC治療T1DM的機(jī)制及臨床應(yīng)用提供有益參考。