任欣怡，朱 晰，張代超，陳 探，程遠國，趙小平，車津晶

（1.上海益諾思生物技術(shù)股份有限公司，上海 201203；2.軍事科學院軍事醫(yī)學研究院毒物藥物研究所，抗毒藥物與毒理學國家重點實驗室，北京 100850）

生物技術(shù)藥物具有結(jié)構(gòu)復雜、分子量大及異源性等特點，與小分子類藥物不同的是其擁有較強的免疫原性。免疫原性的產(chǎn)生往往伴隨藥物濃度的降低，藥物療效的減弱或是不良反應的產(chǎn)生。因此，對生物技術(shù)藥物免疫原性進行檢測具有重要的意義［1-4]。目前，國內(nèi)免疫原性的檢測尚缺乏相關(guān)的技術(shù)指導原則，而美國食品藥品監(jiān)督管理局和歐洲藥物管理局的相關(guān)指導原則側(cè)重于臨床免疫原性的評價［5-7]。

免疫原性分析檢測的抗藥抗體在體內(nèi)多以混合物形式存在，無法獲得代表待測物的標準品，因此免疫原性的檢測和評價具有半定量的特點。這個特點是其在檢測以及方法建立的過程中與其他常見的生物分析方法的不同之處。免疫原性分析常用的檢測方法和技術(shù)有夾心酶聯(lián)免疫吸附法（>enzyme>linked immunosorbent assay，ELISA ）、橋連ELISA、表面等離子共振技術(shù)、電化學發(fā)光技術(shù)和配體結(jié)合液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)等［8-9]。由于無法獲得待測基質(zhì)中真實抗受試物抗體的標準品，因此在方法建立過程中要通過在基質(zhì)中外加陽性對照抗體來進行待測樣品的模擬，還需結(jié)合統(tǒng)計學原理，通過合適的自然樣本群基質(zhì)建立待測樣本的基底信號值［10-13]。

本文旨在對相關(guān)文獻及美國、歐盟的免疫原性評價指導原則分析的基礎(chǔ)上對非臨床免疫原性分析方法的開發(fā)和驗證進行探討。

1 檢測步驟

由于無法獲得待測物的標準品，免疫原性檢測無法進行準確的檢測，只能通過概率的方法盡可能獲得準確結(jié)果。免疫原性分析往往采用“多步法”進行：①通過一個具有一定假陽性的方法進行樣本的快速篩選，排除大量陰性結(jié)果；②通過一個更為準確的方法對篩選出的“疑似陽性樣本”進行確證檢測，進一步排除陰性結(jié)果；③對得到的陽性樣本進行進一步檢測和分析，如滴度檢測和中和抗體檢測［14]。方法的建立和驗證要根據(jù)檢測的步驟來進行選擇和調(diào)整。樣本檢測如僅需進行篩選和確證，則僅需考慮與篩選和確證相關(guān)的指標。如需要進一步檢測滴度甚至中和抗體，則方法中要添加與之相關(guān)的指標［15]。

2 自然樣本群的選擇

應盡可能選擇與待測樣本相同或相近的自然樣本群，如待檢測樣本來自老年或患類風濕性疾病的個體，則用于方法建立的自然樣本群應選擇與以上狀態(tài)相一致的個體［16]。用于方法學建立的自然樣本群對于待檢樣本應具有代表性，代表待檢樣本在自然狀態(tài)下的一般情況。

3 對照樣本的選擇

對照樣本是用來考察方法有效性的參照樣本。對照樣本分為陽性對照樣本和陰性對照樣本。陽性對照樣本往往通過在基質(zhì)中外加陽性對照抗體來進行模擬。陰性對照樣本則通過混合的自然樣本群樣本來獲得［17]。

3.1 陽性對照樣本的選擇

由于一般無法準確獲得待測藥物在機體內(nèi)的真實抗體，因此要通過陽性對照抗體來作為藥物在體內(nèi)免疫原性情況的陽性對照。陽性對照抗體一般要求為多克隆抗體，以此更好反映機體內(nèi)的真實情況。一般情況下，生物技術(shù)藥物臨床前藥物代謝及安全性評價在靈長類動物體內(nèi)進行，由于制備猴源的陽性對照多抗成本較高，因此廣泛應用的陽性對照抗體是兔源或羊源多抗。在多抗制備和純化過程中，為了得到更具代表性和特異性的陽性對照抗體，多抗血清要經(jīng)過抗原吸附過程，以去除大部分非相關(guān)抗體。為了在長期試驗中得到性質(zhì)穩(wěn)定且可重復的陽性對照抗體，亦可采用≥2株親和力不同的單克隆抗體進行混合。

3.2 陰性對照樣本的選擇

陰性對照是為了提供自然樣本群的本底值。由于個體樣本間或多或少會存在個體差異，因此陰性對照應以混合自然個體制得，以消除個體間差異，使本底值更加穩(wěn)定并具有代表性。陰性對照在免疫原性分析時作為臨界值計算的依據(jù)。

4 臨界值的計算

臨界值為通過考察一個小規(guī)模自然樣本群個體的信號值波動情況，結(jié)合統(tǒng)計學原理計算得到的在一定百分位數(shù)內(nèi)可代表自然樣本群分布情況的信號值。通常采用＞9 5%的百分位數(shù)來計算臨界值。綜合考慮小規(guī)模自然樣本群中離群個體情況和不同分析批中離群個體情況來排除離群個體因為樣本自身原因造成的固定的離群稱為生物離群值（如含天然抗體的個體），此值反映了小規(guī)模樣本群中個體信號的波動。因為分析批分析原因而造成的隨機離群稱為分析離群值，此值反映了不同分析批中個體信號的波動。離群值的判斷推薦使。用統(tǒng)計方法進行客觀判斷。臨界值在計算過程中要先排除各個分析批中分析離群值，再排除樣本群中生物離群值，然后通過計算樣本群個體的均值及標準偏差來獲得。為消除不同批次間標準偏差之間的變異，樣本群個體的標準偏差通過各批個體的標準偏差的幾何平均值來計算［18-21]。

4.1 篩選臨界值的確定

通過統(tǒng)計分析自然樣本群個體檢測值的變化規(guī)律，得到符合該法的篩選臨界值類型。篩選臨界值分為固定篩選臨界值，浮動篩選臨界值以及動態(tài)篩選臨界值等。其中較為常見的為前兩者。固定篩選臨界值是指相同的自然樣本群在多個分析批中經(jīng)統(tǒng)計得到批間方差齊性，且均值無顯著差異情況下采用的臨界值。待測樣本檢測時的篩選臨界值即為通過方法學確定的臨界值。在待測樣本檢測階段此數(shù)值為固定數(shù)值。高于此數(shù)值的待測樣本為疑似陽性。浮動篩選臨界值是指，相同的自然樣本群在多個分析批中經(jīng)統(tǒng)計得到批間方差齊性，但均值有顯著差異的情況下采用的臨界值。由于不同分析批間檢測數(shù)值均值存在差異，因此在待測樣本檢測時無法采用固定數(shù)值作為臨界值，需結(jié)合陰性對照進行各分析批臨界值的校正，得到隨各分析批數(shù)值上下浮動的臨界值。即便在方法學中證明了自然樣本群個體批間均值無顯著差異，亦推薦采用浮動篩選臨界值以消除不同分析批中潛在的不穩(wěn)定風險，以獲得更為準確的數(shù)值。

結(jié)合文獻［21]及筆者在實際操作中的經(jīng)驗，在篩選臨界值確定時首先排除不同批次的離群值。然后檢測不同批次個體數(shù)據(jù)的分布，來確定數(shù)據(jù)是否滿足計算的需求。以偏度系數(shù)及Shapiro-Wilk檢驗中P值來評估數(shù)據(jù)的分布。當數(shù)據(jù)分布滿足偏度系數(shù)位于［-1，1]或P＞0.05其中任一個條件時，可進行下一步計算；當偏度系數(shù)位于［-1，1]之外且P≤0.05時，該數(shù)據(jù)不可采用，需分析原因后重新進行實驗。簡要流程見圖1。

4.2 確證臨界值的確定

圖1 篩選臨界值計算中數(shù)據(jù)處理和判斷流程圖

待測樣本經(jīng)過篩選實驗后得到的疑似陽性樣本要經(jīng)過再次確證方可得到可信的結(jié)果。由于抗藥抗體的特異性，因此通過在疑似陽性樣本中加入過量藥物分子的方式來進行待測樣本的確定。疑似陽性樣本中若含抗藥抗體，加入過量藥物分子后，其中游離的藥物分子將與檢測試劑即標記了的藥物分子競爭結(jié)合抗藥抗體，從而造成檢測出的抗藥抗體信號值下降。通過分析自然樣本群個體中加入同樣濃度的過量藥物分子后信號下降的情況可得到自然樣本加入過量藥物分子后非特異的信號下降比例。結(jié)合統(tǒng)計學原理，在一定百分位數(shù)的置信區(qū)間內(nèi)得到一個比例數(shù)值，此比例數(shù)值即為待測樣本確證實驗時的臨界值，即確證臨界值，通常采用＞99%的百分位數(shù)進行計算［3]。由于此置信區(qū)間較篩選臨界值置信區(qū)間更為寬泛，可有效涵蓋分析批的數(shù)值波動，且篩選實驗已去除了大多數(shù)陰性結(jié)果，因此在實際操作中往往無需再考慮分析批間的波動，僅需采用一個固定的確證臨界值。

5 其他

5.1 精密度檢測

方法學驗證階段應充分考慮待測樣本檢測時的實際情況，即要分別考量篩選、確證或滴度實驗中的數(shù)據(jù)可靠性。通過對照樣本的檢測來進行方法可靠性的考察。至少需要考察陰性對照，低濃度陽性對照及高濃度陽性對照樣本的檢測可靠性。由于免疫原性檢測半定量的特點，無法對其計算回歸濃度，因此檢測數(shù)據(jù)的穩(wěn)定性用檢測數(shù)值間的精密度來表示。要同時考察批內(nèi)和批間（日間）精密度。

5.2 特異性和選擇性檢測

方法的特異性和選擇性對于免疫原性分析結(jié)果的解讀非常重要。特異性指的是該法可檢出針對受試物抗體的能力。其檢測出的結(jié)果是只與受試物相關(guān)，而不與試劑相關(guān)。選擇性指的是方法在基質(zhì)中檢出抗受試物抗體的能力?；|(zhì)中可能存在潛在的干擾檢測的物質(zhì)。方法特異性和選擇性不好會導致檢測結(jié)果中假陽性的產(chǎn)生。方法特異性的考察往往通過外加受試物是否可抑制檢測信號值來予以證明。選擇性的考察往往通過比較外加在個體基質(zhì)，混合基質(zhì)及稀釋液中的特定濃度的陽性對照的信號值之間的差異來進行證明。特異性和選擇性的證明往往會決定免疫原性分析時所用到的最小稀釋度。通過樣品的稀釋，可降低基質(zhì)中非相關(guān)物質(zhì)信號的干擾。但過度的稀釋會降低樣品檢測的靈敏度，因此在免疫原性分析中樣品的稀釋多半介于1∶5～1∶100之間。

5.3 靈敏度檢測

免疫原性分析方法中靈敏度是通過基質(zhì)中檢測靈敏度和藥物耐受來體現(xiàn)的。檢測靈敏度通過類似生物分析靈敏度的方法來獲得。簡要說來，通過建立陽性對照抗體的滴度曲線來進行靈敏度的評價。將對應分析批的臨界值回代回滴度曲線以求得該分析批所對應的臨界值。由于免疫原性分析檢測方法固有的特點，各分析批間會存在信號的變異，導致各分析批所得的靈敏度數(shù)值也非一成不變，因此最終檢測靈敏度會用一個范圍來表示。藥物耐受是指在某一特定濃度陽性對照抗體存在情況下可被持續(xù)檢測為陽性時最高的受試物濃度。往往不同濃度陽性對照抗體所能耐受的受試物濃度也不同，需至少檢測和評價低和高濃度陽性對照抗體存在情況下的藥物耐受情況。最終檢測靈敏度和藥物耐受均需換算為基質(zhì)中所對應的陽性對照抗體或受試物的質(zhì)量濃度，以換算后的質(zhì)量濃度表述方法的靈敏度［22]。

5.4 生物類似藥免疫原性對比

在進行非臨床生物類似藥免疫原性對比時，方法的建立要同時考察并兼顧原研藥和生物類似藥（受試物）。兩者免疫原性的對比必須是在同一試驗體系內(nèi)進行。不同試驗間的對比并無意義，有時甚至是錯誤的。在檢測方法中，可采取2種檢測策略：分別建立針對原研藥和受試物的檢測方法并進行驗證；僅建立針對受試物的檢測方法。建立2種檢測方法需要在方法學驗證中比較各個方法指標間原研藥和受試物之間的一致性，且在樣本檢測時需要進行交叉檢測，工作量大，且無法排除方法間誤差帶來的變異，對于最終數(shù)據(jù)的解釋帶來了較大的挑戰(zhàn)。因此，目前更推薦的用于生物類似藥評價的方法為僅建立針對受試物的檢測方法。通過在靈敏度考察時對比方法對于原研藥和受試物的藥物耐受來考察原研藥和受試物之間的一致性，在樣本檢測時用該法進行檢測，最終數(shù)據(jù)便于比較和解釋，但此法也存在著一些局限，即僅能檢出針對受試物的抗體，而不能檢出原研藥特有的受試物不具備的抗體［10-12]。

6 總結(jié)與展望

在非臨床藥物評價試驗中，免疫原性扮演著解釋藥代，毒代和藥效數(shù)據(jù)的作用。在生物類似藥的評價中免疫原性在判斷一致性時起到重要的作用，但生物類似藥的一致性的最終判斷要結(jié)合藥代數(shù)據(jù)，毒理數(shù)據(jù)及藥效數(shù)據(jù)綜合判斷。通過將免疫原性的數(shù)據(jù)和藥代、毒代數(shù)據(jù)的綜合，可有效地解釋藥物在體內(nèi)的去向，并對藥物暴露量的異常變化提供解釋的依據(jù)。通過將免疫原性的數(shù)據(jù)與藥效數(shù)據(jù)的綜合，可通過中和抗體的數(shù)據(jù)解釋藥效中的異常降低。目前，國內(nèi)大部分企業(yè)在進行免疫原性評價時，由于考慮到試驗周期及申報時限的要求，往往會同步開展藥物濃度分析及免疫原性評價試驗。對于免疫原性試驗數(shù)據(jù)的解釋和應用還存在諸多的不足，更多地停留在按指導原則執(zhí)行的層面上，而缺少對數(shù)據(jù)解讀的能力。無法將免疫原性數(shù)據(jù)與藥代，毒理及藥效數(shù)據(jù)進行綜合分析。從而損失了很多數(shù)據(jù)的價值。但通過國內(nèi)同行的不斷努力及國內(nèi)醫(yī)藥企業(yè)的發(fā)展，相信國內(nèi)的藥物評價水平在不遠的將來會有長足的進步。