張美玉，焦 玥，劉 洋，李玉娟，趙小亮，李 濤

（中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，北京市中醫(yī)藥防治重大疾病基礎(chǔ)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100700）

神經(jīng)病理性疼痛（neuropathic pain，NPP）為臨床上多見(jiàn)的慢性頑固性疼痛，是以自發(fā)性疼痛、痛覺(jué)過(guò)敏及痛覺(jué)超敏為主要癥狀的綜合征。引起神經(jīng)痛的因素很多，如外傷、壓迫、炎癥、代謝障礙及基因表達(dá)異常等［1］。在一般人群中NPP患病率高達(dá)6%～8%，而在糖尿病患者中高達(dá)20%～24%，在年齡≥50歲的帶狀皰疹患者中，25%～50%患者在皰疹愈合3個(gè)月后會(huì)發(fā)展為帶狀皰疹后神經(jīng)痛［2-3］。NPP病程較長(zhǎng)，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量、情緒和社會(huì)功能，一直是基礎(chǔ)和臨床醫(yī)學(xué)研究的焦點(diǎn)［4］。

NPP發(fā)病機(jī)制包括外周和中樞2部分。外周機(jī)制包括外周游離神經(jīng)末梢的微環(huán)境改變、外周神經(jīng)受損區(qū)或背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元異位放電、腎上腺素能α受體表達(dá)增多和交感神經(jīng)發(fā)芽等［5］。中樞機(jī)制包括脊髓背角痛覺(jué)神經(jīng)元敏化、膠質(zhì)細(xì)胞激活、突觸傳遞效率長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)、腦部高位中樞敏化（central sensitization）和中樞下行易化系統(tǒng)的激活等［6-7］。越來(lái)越多的學(xué)者認(rèn)為，中樞敏化較之外周敏化對(duì)NPP的產(chǎn)生和維持具有更重要的作用。

氨基酸類遞質(zhì)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)（central nervous system，CNS）中與疼痛密切相關(guān)的一類神經(jīng)遞質(zhì)。大量研究表明，外周神經(jīng)損傷后，傷害性刺激通過(guò)A纖維和C纖維到達(dá)脊髓背角，該部位的神經(jīng)突觸及膠質(zhì)細(xì)胞釋放大量的興奮性氨基酸，包括谷氨酸（glutamate，Glu）和天冬氨酸（aspartic acid，Asp），而抑制性氨基酸如甘氨酸（glycine，Gly）和γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）釋放減少［8-9］。Glu在大腦皮質(zhì)、海馬和脊髓灰質(zhì)中含量較高，根據(jù)電生理和藥理學(xué)研究，Glu受體分為離子型和代謝型2類，離子型Glu受體分為N-甲基-D-天冬氨酸受體（N-methyl-D-aspartic acid receptor，NMDAR）、α-氨基-3-羥基-5-甲基-4-異噁唑丙酸受體（α-amino-3-hydroxy-5-methyl-isopropanoic acid receptor，AMPAR）和海人藻酸受體［10］；而代謝型Glu受體（metabotropic glutamate receptor，mGluR）分 為mGluR 1/5，mGluR 2/3和mGluR 4/6/7/8 3類［11-12］。Glu激活其受體產(chǎn)生的興奮毒性和抑制細(xì)胞膜上Glu/胱氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體所產(chǎn)生的氧化毒性，在疼痛發(fā)病過(guò)程中發(fā)揮重要作用［10，13］。研究發(fā)現(xiàn)，前扣帶回皮質(zhì)區(qū)對(duì)動(dòng)物神經(jīng)損傷產(chǎn)生的厭惡和恐懼行為有正向作用，電刺激該區(qū)導(dǎo)致動(dòng)物自殘行為加劇，這可能是刺激該區(qū)產(chǎn)生了對(duì)疼痛的記憶反應(yīng)［14］。另外，杏仁核在NPP的感覺(jué)尤其是情感痛苦方面發(fā)揮著重要作用［15］。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)NPP發(fā)病機(jī)制的研究多集中在脊髓水平，而少見(jiàn)腦水平的研究報(bào)道。因此，本研究以脊髓上疼痛信號(hào)傳導(dǎo)和體驗(yàn)的關(guān)鍵區(qū)域——杏仁核和前額葉皮質(zhì)（medial prefrontal cortex，mPFC）作為研究位點(diǎn)，考察NPP模型大鼠該腦區(qū)內(nèi)氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)的動(dòng)態(tài)變化。

近年來(lái)，針對(duì)NPP發(fā)病機(jī)制進(jìn)行中藥單體或復(fù)方的研究較多。臨床常用中藥川芎（Ligusticum chuanxiong Hort.）具有活血行氣、祛風(fēng)止痛之功。川芎嗪（ligustrazine）是川芎的主要活性成分之一，易溶于石油醚、氯仿和稀鹽酸等。目前，其在臨床主要用于治療心腦血管疾病，而在其他方面的研究和應(yīng)用報(bào)道較少。文獻(xiàn)報(bào)道，川芎石油醚提取部位具有較強(qiáng)的鎮(zhèn)痛作用［16］，提示川芎中具有鎮(zhèn)痛效應(yīng)的活性成分可能是川芎嗪。本研究基于前期工作基礎(chǔ)［17-19］，擬采用更符合NPP病理機(jī)制且穩(wěn)定的大鼠坐骨神經(jīng)部分損傷（spared sciatic nerve injury SSNI）模型，通過(guò)行為學(xué)方法觀察川芎嗪對(duì)NPP的干預(yù)作用；應(yīng)用顱內(nèi)雙位點(diǎn)微透析（intracranial dualprobe microdialysis）技術(shù)，結(jié)合高效液相-熒光檢測(cè)法，觀察川芎嗪對(duì)mPFC和杏仁核中央核（central，nucleus of the amygdaloid，CeA）細(xì)胞外液中Glu，Asp，Gly和GABA含量的影響，探討川芎嗪的鎮(zhèn)痛機(jī)制，為擴(kuò)大川芎嗪臨床適應(yīng)證提供新的科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

雄性SD大鼠，體質(zhì)量180～200 g，購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院，合格證號(hào)為SCXK（京）2014-0013。大鼠飼養(yǎng)于中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心。室溫20～24℃，相對(duì)濕度40%～55%，光照12 h∶12 h，定時(shí)喂養(yǎng)，自由飲水。

1.2 藥品、試劑和儀器

鹽酸川芎嗪（批號(hào)：A0189，四川成都曼思特生物科技有限公司）。51000-20C纖維絲痛覺(jué)測(cè)試包（von Frey hair，美國(guó)Danmic公司）；冷敷噴霧劑（美國(guó)Cramer公司）；特美?。ㄅ?hào)：60230es07，上海前塵生物科技公司）；Glu（批號(hào)：G1251）、GABA（批號(hào)：A2129）、Asp（批號(hào)：A8949）、Gly（批號(hào)：94119）、辛烷磺酸鈉和乙酸鈉（美國(guó)Sigma公司）；硼酸（美國(guó)ACKOS Organics公司）；β-巰基乙醇（美國(guó)Amresco公司）；鄰苯二甲醛（o-phthalaldehyde，OPA，美國(guó)Aldrich公司）；四氫呋喃（美國(guó)Mallinckrodt Baker公司）；磷酸、乙酸和甲醇（色譜級(jí)，迪馬科技公司）EDTA和KH2PO4（北京化工廠）。

液相檢測(cè)系統(tǒng)：高效液相色譜（德國(guó)SykamGmbH 公司）、Clarity Lite 色譜工作站（荷蘭Antecleyden公司）、RF-10AXL 熒光檢測(cè)器（日本島津公司）和Eclipse AAA 熒光檢測(cè)色譜柱（4.6 mm ×150 mm，5 μm，美國(guó)Agilent 公司）。SHB-ⅢA 循環(huán)水式多用真空泵（鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司）；KQ-1000 超聲波清洗器（昆山超聲波儀器有限公司）；arium 61316 反滲透純水系統(tǒng)和PB-21 pH 計(jì)（德國(guó)Sartorius 公司）；水相和有機(jī)相微孔濾膜（天津津騰公司）；STRONG8003 立體定位儀、69001動(dòng)物體溫維持儀和90-102 手持式顱鉆（深圳瑞沃德公司）；玻璃離子體水門(mén)?。ㄉ虾ａt(yī)療器械股份有限公司）。微透析系統(tǒng)：CMA/11 探針（膜長(zhǎng)：1 mm，膜直徑：0.5 mm，截留量：20 ku）、CMA/12 探針（膜長(zhǎng)：2 mm，膜直徑：0.5 mm，截留量：60 ku）及套管、CMA/402 微量注射泵和CMA/470 低溫樣品自動(dòng)收集器（瑞典CMA Microd AB 公司）；五通轉(zhuǎn)環(huán)清醒活動(dòng)裝置（美國(guó)Instech 公司）。

1.3 動(dòng)物分組、給藥和行為學(xué)檢測(cè)

1.3.1 大鼠坐骨神經(jīng)部分損傷模型的制備和篩選

大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d后，連續(xù)3 d每天1次采用纖維絲機(jī)械刺激法［20］和冷噴法［21］觀察大鼠機(jī)械縮足反射和冷痛敏反應(yīng)，其中機(jī)械縮足痛閾值＞26 g和冷痛敏評(píng)分為0者視為痛覺(jué)正常大鼠，將其隨機(jī)分為SSNI手術(shù)組和假手術(shù)對(duì)照組。依據(jù)Decosterd等［22］報(bào)道的方法，大鼠吸入異氟烷（2.0%，流量0.5L·min-1）麻醉。將SSNI組大鼠左后肢的股骨大轉(zhuǎn)子與膝關(guān)節(jié)之間沿著臀大肌纖維方向做1 cm皮膚切口，梨狀肌下暴露坐骨神經(jīng)，用玻璃分針鈍性分離坐骨神經(jīng)分支中的脛神經(jīng)和腓總神經(jīng)，用棉線緊緊結(jié)扎，在遠(yuǎn)心端剪斷，保留腓腸神經(jīng)，分層縫合肌肉和皮膚。假手術(shù)組不做神經(jīng)的結(jié)扎和剪斷。大鼠造模后第7～9天，連續(xù)3 d測(cè)試機(jī)械痛縮足反射和冷痛敏反應(yīng)，篩選出機(jī)械痛閾＜4 g和冷痛敏評(píng)分＞2的大鼠，即SSNI模型大鼠。

1.3.2 NPP行為學(xué)檢測(cè)

機(jī)械痛敏采用纖維絲機(jī)械刺激評(píng)價(jià)法（同1.3.1），以不同克數(shù)的纖維絲刺激大鼠左后足足底外側(cè)，觀察是否出現(xiàn)縮足反應(yīng)。以刺激5次中大鼠縮足達(dá)3次時(shí)的纖維絲最小克數(shù)值認(rèn)定為機(jī)械痛閾響應(yīng)值。機(jī)械痛閾采用鎮(zhèn)痛活性作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，鎮(zhèn)痛活性（%）=〔（給藥后不同時(shí)間點(diǎn)機(jī)械痛閾響應(yīng)值-給藥前基礎(chǔ)值）/（手術(shù)前基礎(chǔ)值-給藥前基礎(chǔ)值）〕×100%。冷痛敏測(cè)試采用冷噴法，即用冷敷噴霧劑快速（1 s）準(zhǔn)確定位噴涂在左后足足底外側(cè)表面，根據(jù)冷刺激后的縮足反應(yīng)進(jìn)行評(píng)分。痛敏異常的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)為：無(wú)異常反應(yīng)為0分；大鼠驚嚇?lè)磻?yīng)輕微，或輕微抬起受刺激的后肢（3 s內(nèi)落下）為1分；腳掌迅速抬起＞3 s，搔搖受刺激的后爪為2分；持續(xù)或反復(fù)抬起受刺激的后肢并舔爪、搖爪或大叫，并表現(xiàn)出厭惡、煩躁的反應(yīng)為3分。

1.3.3 SSNI模型大鼠的分組和藥物處理

SSNI模型大鼠隨機(jī)分為模型組和川芎嗪組，川芎嗪組大鼠于術(shù)后第10天分別采用鞘內(nèi)（intrathecal，it，25 μmol·kg-1）、丘腦腹后外側(cè)核（ventral posterior lateral nucleus of thalamus，VPLNT，2.5 μmol·kg-1）和靜脈（intravenous，iv，20 mg·kg-1）注射3種不同的方式給藥。其中it注射位點(diǎn)為大鼠雙側(cè)髂前上棘連線中點(diǎn)旁開(kāi)5 mm處，沿45℃傾斜刺入脊髓腔，注射體積為60 μL·kg-1；iv注射采用尾靜脈注射，注射體積為2 mL·kg-1；VPLNT給藥組則需要在術(shù)后第8天進(jìn)行大鼠VPLNT（前鹵后2.6 mm，中縫旁開(kāi)3.0 mm，垂直進(jìn)針5.0 mm）埋入套管（該手術(shù)與雙位點(diǎn)套管植入術(shù)同步進(jìn)行），以此作為注射給藥位點(diǎn)，注射體積為2 μL·kg-1。各組分別在注射給藥前（0 min）、及給藥后30，60，90，120，180和240 min觀測(cè)大鼠的機(jī)械痛閾和冷痛敏行為的變化。

1.4 高效液相-熒光色譜法檢測(cè)大鼠腦mPFC和CeA內(nèi)氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)含量

1.4.1 大鼠顱內(nèi)雙位點(diǎn)微透析同步采樣

大鼠SSNI造模、篩選和分組給藥同1.3，每組8只。造模手術(shù)后第8天，大鼠吸入2.0%異氟烷（流量0.5 L·min-1）麻醉，在立體定位儀導(dǎo)引下，分別于大鼠mPFC（前鹵前2.7 mm，中縫旁開(kāi)1.8 mm，進(jìn)針2.5 mm，右外側(cè)傾斜20℃）和CeA（前鹵后2.3 mm，中縫旁開(kāi)4.0 mm，進(jìn)針7.4 mm）內(nèi)埋入探針套管，用牙科水泥固定。術(shù)后第9天21∶00～24∶00，大鼠在吸入異氟烷的麻醉狀態(tài)下插入2個(gè)探針，并用膠布固定。其中膜長(zhǎng)1 mm的探針插入CeA的套管中，膜長(zhǎng)2 mm的探針插入mPFC的套管中（圖1）。將大鼠放在可自由活動(dòng)的裝置（33 cm×40 cm×36 cm）內(nèi)，用改良的Ringer溶液灌流2條探針通路過(guò)夜，流速為0.3 μL·min-1。次日6∶30，將流速調(diào)為1.3 μL·min-1，平衡1.5 h后開(kāi)始收集透析液。每20 min收集1管，收集體積為26 μL，共收集80 min，作為給藥前基礎(chǔ)水平。而后分別采用VPLNT，it和iv注射給予川芎嗪，并以同樣的收集體積和頻率連續(xù)收集透析液至220 min。以觀察藥物對(duì)透析液中神經(jīng)遞質(zhì)的影響。

Fig.1 Illustration of dual-probe microdialysis targets in medial prefrontal cortex（mPFC）and central nucleus of the amygdaloid（CeA）of rat brain.Probes（the grey area indicates probe membrane，the black area indicates probes shaft）in mPFC occupied prelimbic and cingulate cortex.

1.4.2 體外回收率測(cè)定

不同膜長(zhǎng)探針在使用前分別放置于含有Glu，Asp，Gly和GABA的混合標(biāo)準(zhǔn)液中，在室溫條件下，用改良的Ringer溶液以1.3 μL·min-1的流速灌流，平衡30 min后開(kāi)始收集透析液，每管收集20 min，共收集4管。以不同氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)的探針體外回收率來(lái)折算其在腦微透析液中的濃度。探針體外回收率（%）=透析液中某遞質(zhì)濃度均值/混合標(biāo)準(zhǔn)液中該遞質(zhì)濃度均值×100%。

1.4.3 高效液相-熒光色譜法檢測(cè)大鼠腦透析液中Glu，Asp，Gly和GABA含量

色譜分析條件：將OPA 5 mg溶于甲醇120 μL中，加入β-巰基乙醇10 μL和硼酸緩沖液（0.2 mol·L-1pH 9.2）1 mL，混勻，配制成衍生液存放于暗處備用。A液：緩沖液（20mmol·L-1乙酸鈉溶液，pH7.2）∶甲醇∶四氫呋喃（V∶V∶V）=400∶95∶5；B液：緩沖液∶甲醇（V∶V）=120∶380。流速：0.8mL·min-1；光電倍增管：12；柱溫：40℃。梯度洗脫：0～10 min為0%～63%B液；10～12 min為63%B液；12～17 min為100%B液；17～18 min為100%～0%B液；18～21 min為0%B液。OPA柱前自動(dòng)衍生，分離后的氨基酸衍生化合物用熒光檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)，激發(fā)波長(zhǎng)為340 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為455 nm。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 川芎嗪對(duì)SSNI大鼠痛敏行為的影響

2.1.1 SSNI大鼠造模前后機(jī)械痛閾和冷痛敏的變化

SSNI模型組大鼠手術(shù)后機(jī)械痛閾顯著降低（P＜0.01，圖2A），冷痛敏評(píng)分顯著升高（P＜0.01，圖2B）。假手術(shù)組手術(shù)前后2項(xiàng)指標(biāo)均無(wú)明顯差異。提示SSNI大鼠模型復(fù)制成功。

Fig.2 Evaluation of mechanical withdraw threshold（A）and cold spray scores（B）before and after spared sciatic nerve injury（SSNI）in rats.Rats were tested at pre-surgery and the 7th-9thday post-SSNI.，n=7.＊＊P＜0.01，compared with pre-surgery.

2.1.2 川芎嗪it注射對(duì)SSNI大鼠機(jī)械痛閾和冷痛敏的影響

與SSNI模型組相比，it注射川芎嗪25 μmol·kg-1對(duì)SSNI大鼠機(jī)械痛鎮(zhèn)痛活性和冷痛敏評(píng)分無(wú)明顯緩解作用（圖3）。

2.1.3 川芎嗪VPLNT注射對(duì)SSNI大鼠機(jī)械痛閾和冷痛敏的影響

與SSNI模型組相比，VPLNT注射川芎嗪2.5 μmol·kg-1后30～90 min可明顯降低冷痛敏評(píng)分（P＜0.05，圖4B），在其他檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)對(duì)冷痛敏評(píng)分的影響無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；而給藥后各時(shí)間點(diǎn)對(duì)機(jī)械痛鎮(zhèn)痛活性均無(wú)明顯緩解作用（圖4A）。

2.1.4 川芎嗪iv注射對(duì)SSNI大鼠機(jī)械痛閾和冷痛敏的影響

與SSNI模型組比較，iv注射川芎嗪20 mg·kg-1后60 min可明顯升高SSNI大鼠機(jī)械痛鎮(zhèn)痛活性（P＜0.05，圖5A），而在注射后60～120 min SSNI大鼠冷痛敏評(píng)分明顯降低（P＜0.05，圖5B）。

2.2 川芎嗪對(duì)SSNI大鼠mPFC和CeA細(xì)胞外液中氨基酸遞質(zhì)含量的影響

2.2.1 川芎嗪對(duì)Glu含量的影響

如圖6A1所示，與假手術(shù)組相比，SSNI模型組大鼠mPFC細(xì)胞外液中Glu含量顯著升高（P＜0.05，P＜0.01）；與模型組相比，VPLNT注射川芎嗪2.5μmol·kg-1后20～180min、it注射川芎嗪25μmol·kg-1后20～100 min及iv注射川芎嗪20 mg·kg-1后20～140 min均顯著降低mPFC細(xì)胞外液中Glu的含量（P＜0.05，P＜0.01）。

Fig.3 Analgesic effects of ligustrazine（Lig，25 μmol·kg-1）intrathecal（it）injection in SSNI rats by mechanical withdraw threshold test（A）and cold spray test（B）.On the 10thday after the SSNI operation，rats were individually injected saline or Lig.The mechanical withdraw threshold and cold spray scores were observed before（0 min）or after 30，60，90，120，180 and 240 min of Lig it administration，respectively.The mechanical withdraw threshold was evaluated by analgesic activity.Analgesic activity（%）=［（mechanical withdraw threshold value at different points after Lig injection-mechanical withdraw threshold value before Lig injection）/（mechanical withdraw threshold value of pre-surgery-mechanical withdraw threshold value before Lig injection）］×100%.Cold pain sensitivity was tested by cold spray，and cold spray scores were evaluated with 0，1，2 and 3 degree according to the retraction reaction level of rats after cold stimulation.x±s，n=7.

如圖6A2所示，SSNI模型大鼠CeA細(xì)胞外液中Glu含量比假手術(shù)組升高，給藥前及給藥后60～100 min升高具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與模型組相比，iv給予川芎嗪20 mg·kg-1后60～140 min顯著降低大鼠CeA細(xì)胞外液中Glu的含量（P＜0.05，P＜0.01），而VPLNT和it注射后均未見(jiàn)明顯差異。

2.2.2 川芎嗪對(duì)Asp含量的影響

如圖6B所示，與假手術(shù)組相比，SSNI模型大鼠mPFC和CeA細(xì)胞外液中Asp含量有升高趨勢(shì)，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。與模型組相比，VPLNT注射川芎嗪2.5 μmol·kg-1后60～100 min和180 min及it注射川芎嗪25 μmol·kg-1后100～180 min均明顯降低mPFC細(xì)胞外液Asp的含量（P＜0.05，P＜0.01）。而iv注射川芎嗪20 mg·kg-1后60 min明顯降低CeA細(xì)胞外液Asp的含量（P＜0.05），而it和VPLNT注射川芎嗪后均未降低CeA細(xì)胞外液中Asp的含量。

Fig.4 Analgesic effects of ligustrazine（2.5 μmol·kg-1）ventral posterior lateral nucleus of thalamus（VPLNT）injection in SSNI rats by mechanical withdraw threshold test（A）and cold spray test（B）.See Fig.3 for the rat treatment.，n=6.＊P＜0.05，compared with model group.

Fig.5 Analgesic effects of ligustrazine（20 mg·kg-1）intravenous（iv）injection in SSNI rats by mechanical withdraw threshold test（A）and cold spray test（B）.See Fig.3 for the rat treatment.x±s，n=8.＊P＜0.05，compared with model group.

2.2.3 川芎嗪對(duì)Gly含量的影響

如圖6C所示，與假手術(shù)組相比，SSNI模型組大鼠mPFC和CeA細(xì)胞外液中Gly含量顯著升高（P＜0.05，P＜0.01）。與模型組相比，3種途徑注射給予川芎嗪后0～220 min均明顯降低mPFC和CeA細(xì)胞外液中Gly的含量（P＜0.05，P＜0.01）。

2.2.4 川芎嗪對(duì)GABA含量的影響

各組大鼠mPFC和CeA細(xì)胞外液GABA含量均未見(jiàn)明顯差異（圖6D）。

3 討論

中樞敏化是指脊髓及脊髓上痛覺(jué)相關(guān)神經(jīng)元的興奮性異常升高或突觸傳遞增強(qiáng)。外周神經(jīng)損傷后，傷害性刺激通過(guò)A纖維和C纖維到達(dá)脊髓背角，該部位神經(jīng)突觸釋放大量的Glu。Glu是CNS最重要的興奮性氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)，大部分位于胞內(nèi)，跨膜濃度梯度大約幾千倍。由于CNS中不存在特異性Glu代謝酶，神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)外Glu平衡主要依賴神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞膜上高親和力的Glu轉(zhuǎn)運(yùn)體的重?cái)z取來(lái)維持。一旦攝取受到抑制，幾秒鐘內(nèi)就會(huì)引起胞外和突觸間隙Glu大量蓄積，突觸后膜上特異性結(jié)合受體NMDAR和AMPAR被高度激活，引起大量Ca2+內(nèi)流。細(xì)胞間隙Glu如果長(zhǎng)期處于高濃度狀態(tài)，致使胞內(nèi)Ca2+離子超載最終將導(dǎo)致神經(jīng)元壞死［23-24］。長(zhǎng)期持續(xù)地興奮脊髓及其上位中樞（皮質(zhì)和丘腦），可使CNS發(fā)生可塑性變化。這一過(guò)程即經(jīng)典的NMDAR介導(dǎo)興奮性毒性效應(yīng)引發(fā)中樞敏化現(xiàn)象。

Fig.6 Effect of ligustrazine on extracellular contents of glutamate（Glu，A），aspartic acid（Asp，B），glycine（Gly，C）and γ-aminobutyric acid（GABA，D）in medial prefrontal cortex（mPFC）and central nucleus of amygdaloid（CeA）in SSNI rats by high performance liquid chromatography-fluorescence detector.After 80 min of basic perfusion，rats of each group were perfused with the Ringer′s solution for 220 min.The rats of Lig groups were administered with 2.5 μmol·kg-1 through VPLNT，25 μmol·kg-1through it，and 20 mg·kg-1through iv injections.Dialysate samples were taken continuously 220 min after ligustrazine administration.x±s，n=8.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with sham group；#P＜0.05，##P＜0.01，compared with model group.

由NMDAR觸發(fā)的Glu神經(jīng)傳遞的突觸后活動(dòng)需要3個(gè)條件同時(shí)存在，分別為①Glu占據(jù)了NMDAR結(jié)合位點(diǎn)；②Gly或內(nèi)源性配體D-絲氨酸與NMDAR上的結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合；③神經(jīng)元發(fā)生去極化，去除鎂離子的阻塞作用，開(kāi)放離子通道以允許Ca2+進(jìn)入神經(jīng)元。當(dāng)NMDA-Ca2+通道開(kāi)放時(shí)，由NMDAR介導(dǎo)的一些重要信號(hào)包括長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)效應(yīng)、突觸可塑性和中樞興奮性毒性信號(hào)系統(tǒng)被激活［25］。

杏仁核和mPFC區(qū)作為脊髓上疼痛信號(hào)傳導(dǎo)和體驗(yàn)的關(guān)鍵區(qū)域，與疼痛相關(guān)的認(rèn)知、情緒的產(chǎn)生和調(diào)控密切相關(guān)。本研究采用動(dòng)物行為學(xué)和顱內(nèi)雙位點(diǎn)微透析結(jié)合高效液相-熒光色譜法動(dòng)態(tài)觀察NPP模型大鼠兩腦區(qū)（mPFC和CeA）細(xì)胞外液中興奮性和抑制性氨基酸神經(jīng)遞質(zhì)含量的變化。結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比，SSNI模型組大鼠機(jī)械痛閾值顯著降低，而冷痛敏評(píng)分顯著升高；mPFC和CeA細(xì)胞外液中Glu和Gly含量均顯著升高；而mPFC和CeA細(xì)胞外液中GABA/Glu比值有降低趨勢(shì)。本研究結(jié)果表明，SSNI大鼠造模前后疼痛關(guān)聯(lián)的行為發(fā)生顯著變化，其敏化中樞腦區(qū)Glu和Gly水平也發(fā)生了顯著改變，提示大鼠SSNI模型可作為研究神經(jīng)痛較理想的動(dòng)物模型。另外，在Glu系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)其生理功能和病理基礎(chǔ)的過(guò)程中，Asp伴隨Glu升高也有同步增加的趨勢(shì)，而抑制性神經(jīng)遞質(zhì)Gly和GABA并未顯著降低，而是明顯升高或有升高趨勢(shì)。這可能是機(jī)體為了維持興奮性和抑制性遞質(zhì)之間動(dòng)態(tài)平衡而做出的應(yīng)激調(diào)控反應(yīng)。

本課題組根據(jù)NPP病理機(jī)制特征、辨證選藥及臨床療效的篩查，發(fā)現(xiàn)臨床常用藥川芎嗪在治療NPP方面可能具有應(yīng)用價(jià)值。川芎嗪在川芎藥材中的含量11～49 μg·g-1不等，差異很大，是川芎的主要有效活性成分之一，現(xiàn)可人工合成［26］。為了進(jìn)一步研討川芎嗪的鎮(zhèn)痛活性，本課題組采用3種給藥方式，對(duì)川芎嗪藥效學(xué)和初步作用機(jī)制進(jìn)行研究。結(jié)果顯示，川芎嗪iv注射后能明顯降低SSNI大鼠的機(jī)械痛閾，改善冷痛敏評(píng)分；而VPLNT和it注射后具有緩解機(jī)械痛閾和冷痛敏作用的趨勢(shì)，這可能與川芎嗪用藥劑量偏低有關(guān)。而微透析實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，川芎嗪通過(guò)VPLNT，it和iv注射均能顯著抑制SSNI大鼠mPFC細(xì)胞外液Glu，Asp和Gly的水平，降低CeA細(xì)胞外液Glu和Gly的水平。在川芎嗪3種給藥方式中，以iv注射鎮(zhèn)痛作用最明顯。

川芎嗪鎮(zhèn)痛作用可能通過(guò)抑制大鼠mPFC和CeA腦區(qū)興奮性氨基酸遞質(zhì)釋放，調(diào)控興奮性和抑制性氨基酸遞質(zhì)的動(dòng)態(tài)平衡，對(duì)興奮性毒性效應(yīng)造成的神經(jīng)元損傷發(fā)揮一定的保護(hù)作用。因此，深入研究川芎嗪對(duì)NPP大鼠的治療作用及其機(jī)制具有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值，將為川芎嗪“老藥新用”提供新的科學(xué)依據(jù)。