陽小飛，榮伊，周仲燕

(中南民族大學(xué) 生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)院，腦認(rèn)知國家民委重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，醫(yī)學(xué)信息分析及腫瘤診療湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，膜離子通道與藥物研發(fā)實(shí)驗(yàn)室，武漢430074 )

在神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)中，神經(jīng)元細(xì)胞間的信號(hào)傳遞需要囊泡釋放包裹的神經(jīng)遞質(zhì)，單個(gè)囊泡釋放出的神經(jīng)遞質(zhì)與突觸后膜上的受體結(jié)合，引起電流的變化，即微小型興奮性突觸后電流(mEPSC)或微小型抑制性突觸后電流(mIPSC)[1,2].神經(jīng)元細(xì)胞中可釋放囊泡庫(RRP)[3]的大小影響囊泡的自發(fā)性釋放.Ca2+在囊泡釋放中發(fā)揮重要作用.當(dāng)囊泡靠近突觸前膜時(shí)，隨著Ca2+的通透性增加，細(xì)胞外的Ca2+內(nèi)流，推動(dòng)囊泡與突觸前膜的融合、釋放，引起突觸后的電位變化[4-6].在正常情況下，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度過高時(shí)，激活某些蛋白酶、磷脂酶及內(nèi)源性核酸酶等，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[7]；但當(dāng)神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度過低甚至無Ca2+存在時(shí)，對(duì)細(xì)胞會(huì)造成什么樣的影響，目前尚無定論.

BAPTA-AM是一種乙酰甲酯衍生物，細(xì)胞膜對(duì)其通透性較強(qiáng)，當(dāng)它進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，在酯酶的作用下分解出BAPTA，后者是一種高效Ca2+絡(luò)合劑，它親和力強(qiáng)，能快速與細(xì)胞內(nèi)游離的Ca2+結(jié)合，在細(xì)胞內(nèi)營造出無Ca2+的狀態(tài)[8,9].運(yùn)用此方法，可有效地去除細(xì)胞內(nèi)Ca2+.本文通過全細(xì)胞膜片鉗記錄的方法，探討去除細(xì)胞外Ca2+及同時(shí)去除細(xì)胞內(nèi)外Ca2+，對(duì)大腦皮層神經(jīng)元自發(fā)性囊泡釋放的影響及原理，為研究中樞神經(jīng)系統(tǒng)的囊泡分泌提供參考.

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

胎牛血清、MEM培養(yǎng)基、0.25%胰蛋白酶、轉(zhuǎn)鐵蛋白、B-27 supplement(Gibco)；BAPTA-AM、胰島素、葡萄糖、HEPES 、阿糖胞苷、EGTA、多聚賴氨酸(Sigma)；二甲苯、丙酮、無水乙醇等(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑)；印防己毒素,Tocris 1128,1 g；河豚毒素,Affix Scientific 4368-28-9,1 mg；CNQX,Tocris 1045,10 mg.

倒置顯微鏡(Olympus)；全套自動(dòng)膜片鉗放大器(HEKA)；P-97微電極拉制儀(普升科技)；CO2恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱(Thermo)；超凈工作臺(tái)產(chǎn)(蘇州Air Tech)；高壓滅菌鍋(上海博訊).

1.2 實(shí)驗(yàn)溶液配制

按照文獻(xiàn)[10,11]，配制神經(jīng)元解剖液、神經(jīng)元培養(yǎng)基、電生理正常細(xì)胞外液、0 Ca細(xì)胞外液、電生理細(xì)胞內(nèi)液、10 mmol/L BAPTA-AM 母液(溶于DMSO).

1.3 原代鼠腦皮層神經(jīng)細(xì)胞的獲取

取出生<24 h的新生KM小鼠，無菌環(huán)境下斷頭取腦，分離出大腦皮層，用0.25%的胰蛋白酶在37 ℃恒溫環(huán)境中消化12 min，用神經(jīng)元培養(yǎng)基離散細(xì)胞后，滴種在用多聚賴氨酸處理過的玻片上，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱，分別在第1,4,9 d換液.

1.4 電生理記錄

將獲取的大腦皮層神經(jīng)細(xì)胞體外培養(yǎng)13,14 d后，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行電生理記錄.采用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)，在-70 mV的鉗制電壓下記錄電流.記錄mEPSC時(shí)，在細(xì)胞外液中加入100 μmol/L的GABA受體阻斷劑PTX 和1 μmol/L的Na通道阻斷劑TTX；記錄mIPSC時(shí)，在細(xì)胞外液中加入10 μmol/L的AMPA受體阻斷劑CNQX和1 μmol/L的Na通道阻斷劑TTX[12,13].

1.5 數(shù)據(jù)處理

用Pclamp 10記錄并導(dǎo)出數(shù)據(jù)后，再用Igor Pro Folder,GraphPad Prism進(jìn)行處理分析.3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)之后進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，用t檢驗(yàn)進(jìn)行差異分析，*表示顯著性差異.

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞外Ca2+和細(xì)胞內(nèi)Ca2+對(duì)大腦皮層神經(jīng)細(xì)胞囊泡釋放的影響

為研究神經(jīng)元細(xì)胞外Ca2+和細(xì)胞內(nèi)Ca2+對(duì)神經(jīng)遞質(zhì)釋放的影響，對(duì)體外培養(yǎng)成熟的神經(jīng)元細(xì)胞進(jìn)行電生理記錄.實(shí)驗(yàn)分為3組，取大腦皮層細(xì)胞在正常外液、0 Ca外液、加入10 μmol/L BAPTA-AM的0 Ca外液中孵育30 min后，分別在上述3種外液中記錄mEPSC,結(jié)果見圖1.

A)在正常外液、0 Ca外液、加入10 μmol/L BAPTA-AM的0 Ca外液中孵育30 min后分別在正常外液、0 Ca外液、0 Ca外液中記錄mEPSC；B)在正常外液、0 Ca外液、加入10 μmol/L BAPTA-AM的0 Ca外液中孵育30 min后分別在正常外液、0 Ca外液、0 Ca外液中記錄mIPSC.**P<0.01 vs.

當(dāng)外液中無Ca2+時(shí)，mEPSC頻率降低；當(dāng)外液中的Ca2+和細(xì)胞內(nèi)的Ca2+同時(shí)不存在時(shí)，mEPSC頻率進(jìn)一步降低(見圖1A)；同樣的方法記錄mIPSC時(shí)，發(fā)現(xiàn)在0 Ca外液中mIPSC的頻率降低，進(jìn)一步絡(luò)合細(xì)胞內(nèi)Ca2+后，mEPSC的頻率稍微降低(見圖1B).結(jié)果表明：去除細(xì)胞外Ca2+對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的囊泡釋放有抑制作用(P<0.01)，同時(shí)去除細(xì)胞外Ca2+和細(xì)胞內(nèi)Ca2+，對(duì)囊泡釋放也有抑制作用.

2.2 細(xì)胞外Ca2+對(duì)大腦皮層神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)可釋放囊泡庫的影響

取體外培養(yǎng)13 d的大腦皮層神經(jīng)元細(xì)胞分別在加入TTX和PTX的正常外液和0 Ca外液中記錄興奮性突觸可釋放囊泡庫大小，即在記錄過程中給予所記錄細(xì)胞30 s的0.5 mol/L 蔗糖溶液的刺激，在高滲溶液下，通過物理刺激將細(xì)胞中的囊泡都釋放出來，引起電流變化，記錄細(xì)胞的可釋放囊泡庫[14]，結(jié)果見圖2.

A)正常外液、0 Ca外液中興奮性突觸可釋放囊泡庫大小；B)正常外液、0 Ca外液中抑制性突觸可釋放囊泡庫大小.

在正常外液中和0 Ca外液中的可釋放囊泡庫無顯著性差異(見圖2A)；同等條件下，在加入TTX和CNQX的正常外液中和0 Ca外液中記錄抑制性突觸可釋放囊泡庫大小，同樣無顯著性差異(見圖2B).因此，認(rèn)為細(xì)胞外Ca2+對(duì)大腦皮層神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)可釋放囊泡庫無影響.

2.3 細(xì)胞內(nèi)Ca2+對(duì)大腦皮層神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)可釋放囊泡庫的影響

正常外液中加入DMSO，在0 Ca外液中加入10 μmol/L的BAPTA-AM，將體外培養(yǎng)成熟的大腦皮層神經(jīng)元分別置于兩組外液中孵育30 min，再分別在加入TTX和PTX的正常外液和0 Ca外液中記錄細(xì)胞的興奮性突觸可釋放囊泡庫大小，結(jié)果見圖3.加入BAPTA-AM絡(luò)合細(xì)胞內(nèi)Ca2+后，細(xì)胞內(nèi)可釋放囊泡庫顯著降低(P<0.01，見圖3A)；相同條件下，改變兩組外液中的阻斷劑，加入TTX和CNQX，記錄抑制性突觸可釋放囊泡庫大小，發(fā)現(xiàn)在去除細(xì)胞內(nèi)Ca2+之后的神經(jīng)元內(nèi)，可釋放囊泡庫較正常神經(jīng)元的可釋放囊泡庫顯著減小(P<0.001，見圖3B).

A)分別在正常外液、加入10 μmol/L BAPTA-AM的0 Ca外液中孵育30 min后，在正常外液、0 Ca外液中記錄興奮性突觸可釋放囊泡庫大小；B)分別在正常外液、加入10 μmol/L BAPTA-AM的0 Ca外液中孵育30 min后，在正常外液、0 Ca外液中記錄抑制性突觸可釋放囊泡庫大小.**P<0.01 vs.control ,***P<0.001 vs

因此，無論興奮性還是抑制性突觸，去除細(xì)胞內(nèi)Ca2+，均能引起細(xì)胞內(nèi)可釋放囊泡庫的減小，引起自發(fā)性囊泡釋放的減少，即mEPSC和mIPSC頻率的降低.故認(rèn)為當(dāng)同時(shí)去除細(xì)胞外Ca2+和細(xì)胞內(nèi)Ca2+后，抑制自發(fā)性囊泡釋放的原因是缺乏Ca2+引起囊泡膜與細(xì)胞膜融合和可釋放囊泡庫減小的綜合結(jié)果.

3 討論

在神經(jīng)元囊泡釋放的過程中，突觸前膜對(duì)Ca2+的通透性增強(qiáng)，Ca2+內(nèi)流，細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度越高，對(duì)囊泡與突觸前膜的融合作用越強(qiáng)，因此囊泡釋放的頻率越高.本實(shí)驗(yàn)中，當(dāng)細(xì)胞外Ca2+濃度為0時(shí)，其囊泡釋放的頻率較正常細(xì)胞外Ca2+濃度下顯著降低，而兩種狀況下的細(xì)胞內(nèi)可釋放囊泡庫無顯著變化.說明細(xì)胞外Ca2+僅僅參與囊泡釋放的過程，對(duì)于囊泡釋放前的反應(yīng)并無太大的影響，頻率降低的原因是當(dāng)細(xì)胞外液無Ca2+時(shí)，細(xì)胞本身的游離內(nèi)Ca2+濃度達(dá)不到促進(jìn)囊泡釋放的濃度，導(dǎo)致囊泡釋放頻率降低.

去除細(xì)胞外Ca2+并同時(shí)用BAPTA-AM絡(luò)合細(xì)胞內(nèi)Ca2+時(shí)，囊泡釋放的頻率較僅去除細(xì)胞外Ca2+時(shí)的頻率進(jìn)一步降低，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：去除細(xì)胞內(nèi)Ca2+后，細(xì)胞內(nèi)可釋放囊泡庫顯著減小，因此囊泡釋放頻率的降低，除了無細(xì)胞Ca2+促進(jìn)囊泡釋放這一過程外，也受到可釋放囊泡庫減小這一因素的影響.

囊泡在成熟之前要經(jīng)過不同的階段，在神經(jīng)元細(xì)胞里存在著發(fā)育到不同階段的囊泡，而可釋放囊泡庫是由感應(yīng)到細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度變高時(shí)，就能迅速與突觸前膜融合并釋放出神經(jīng)遞質(zhì)的囊泡組成.

當(dāng)去除細(xì)胞內(nèi)Ca2+，引起細(xì)胞內(nèi)可釋放囊泡庫的減小，原因是細(xì)胞內(nèi)Ca2+在囊泡產(chǎn)生及發(fā)育的過程中起重要作用，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)Ca2+為0時(shí)，囊泡形成的某一階段受影響，導(dǎo)致生成的囊泡數(shù)量減少.此外，還可能是細(xì)胞內(nèi)Ca2+不會(huì)影響囊泡的形成，但在維持可釋放囊泡庫的過程中起至關(guān)重要的作用[15-17]，因此，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)Ca2+為0時(shí)，可釋放囊泡庫里的囊泡不能正常儲(chǔ)存，造成囊泡的流失，使可釋放囊泡庫減??；但細(xì)胞內(nèi)Ca2+對(duì)神經(jīng)元細(xì)胞的可釋放囊泡庫的減小的具體影響有待深入研究.