尚柯，張彪，段慶梓，張玉，王巍，梁恒興

(成都食品藥品檢驗研究院，四川 成都，610045)

過敏原(allergen)，又稱為變應(yīng)原、過敏物、致敏原、致敏物。GB/T 23779—2009規(guī)定，能夠誘發(fā)機體發(fā)生過敏反應(yīng)的抗原物質(zhì)，被稱過敏原。食品過敏源是指普通食品中正常存在的天然或人工添加物質(zhì)，被過敏體質(zhì)人群消耗后能夠誘發(fā)過敏反應(yīng)。食物過敏原一般為相對分子質(zhì)量10～70kDa的蛋白質(zhì)或糖蛋白，可分為主要過敏原與次要過敏原，大多數(shù)過敏患者對主要過敏原敏感[1]。目前大約有160多種食品含有可以導(dǎo)致過敏反應(yīng)的食品過敏原[2]，常見的食品有：奶類(牛奶、羊奶等)，堅果(杏仁、巴旦木、山核桃、榛子等)，菜籽(葵花籽、芝麻等)，豆類(花生、大豆、豌豆、蠶豆等)，蛋類，巧克力，水果，海產(chǎn)品(蝦、蟹類)等。

據(jù)統(tǒng)計，2%的成人和5%～8%的兒童存在不同程度的食品過敏。僅僅在美國，每年就有3 000人因食物過敏緊急住院，150～200人死亡[3]。據(jù)世界衛(wèi)生組織的數(shù)據(jù)表明, 目前全球有 22%～25%的人患有過敏性疾病, 并以每10年23倍的速度增加，在我國就有兩億多人患有過敏性疾病，由食品過敏引發(fā)的過敏疾病已占過敏總數(shù)的 90%左右。

過敏原已成為重要的食品安全問題，因此評價和檢測食品過敏原生物活性日益受到重視。同時，由于發(fā)達(dá)國家已對進(jìn)出口食品過敏原標(biāo)識進(jìn)行了嚴(yán)格要求，食物過敏原甚至成為進(jìn)出口貿(mào)易的壁壘。因此，如何快速準(zhǔn)確地檢測出食物中的過敏原成為當(dāng)前亟需解決的問題。

目前常用的過敏原檢測方法有免疫學(xué)檢測、DNA檢測、質(zhì)譜及SPR等技術(shù)。張世偉等[4]通過運用雙抗夾心ELISA法檢測食品中的雞蛋過敏原，得出 IC50為 260 ng/mL，檢出限為10 ng/mL，樣品的添加回收率為84.2%～89.8%，可以快速檢測雞蛋過敏原。BATISTA等[5]利用對大豆過敏病人血清，通過雙向電泳技術(shù)結(jié)合 Western blotting檢測方法，從非轉(zhuǎn)基因大豆中檢測出了43種致敏蛋白。PUERTA等[6]采用免疫層析技術(shù)在痕量水平上定位β-乳球蛋白，得出實際檢測限為20.7 pmol/L，靈敏度為1.05×109AUmol-1L。

LU等[7]通過SPR技術(shù)對沙丁魚肌肉中的過敏原蛋白小清蛋白進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示靈敏度高達(dá) 0.11 mg/kg。CHASSAIGNE等[8]就采用四極桿―飛行時間質(zhì)譜儀檢測出了花生中的主要過敏原蛋白Ara h1、Ara h2、Ara h3/4。VANDEKERCKHOVE等[9]利用LC-MS技術(shù)檢測辣椒中的痕量花生過敏原成分，檢出限可達(dá)24 mg/kg。

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)起始于20世紀(jì)90年代中期，目前在過敏原檢測中已有應(yīng)用。關(guān)瀟等[10]通過PCR方法檢測10種不同食品的牛奶過敏原，利用牛奶過敏原蛋白α-乳白蛋白基因序列設(shè)計引物的檢測靈敏度可達(dá)0.04 ng DNA，這一結(jié)果表明該法對牛奶過敏原的檢測具有較高的準(zhǔn)確性和可靠性。CRUZ等[11]通過實時熒光 PCR 方法檢測巴西堅果中的過敏原成分，利用其中的2S白蛋白基因作為引物，得到檢測限為2.5 mg/kg。周新虹[12]采用Trizol法反轉(zhuǎn)錄RNA，克隆Ara h7 cDNA序列，并分析了表達(dá)蛋白的特征。SANTACLARA等[13]利用實時熒光PCR方法，檢測食品中的蝦、蟹等甲殼動物的過敏原成分，可在40 min內(nèi)完成檢測工作。ESPIEIRA等[14]通過建立一種食品中檢測大豆過敏原成分的PCR方法，為保護(hù)消費者提供了一種思路。GARCA等[15]利用Taqman探針法檢測食品中的堅果過敏原成分，檢出限達(dá)到0.1 mg/kg。WU等[16]采用多重實時熒光PCR技術(shù)，分析柑橘的過敏原，并促進(jìn)育種“allergy-friendly”水果。LINACERO等[17]采用實時熒光PCR技術(shù)檢測核桃的主要過敏原Jugr1、Jugr3、Jugr4，檢出限可達(dá)0.01%。

PCR法在復(fù)雜食品中過敏原的定量分析及物種鑒定方面，具有快速、高效、準(zhǔn)確、適用性廣、成本低廉、操作簡便等優(yōu)點，這使PCR方法在食物過敏原檢測方面，存在極大的優(yōu)勢，適合國際法規(guī)所要求的食品中過敏原成分的檢測原則。

目前，過敏原成分的PCR方法檢測已有較多方法及標(biāo)準(zhǔn)，但這些方法和標(biāo)準(zhǔn)均存在一定的問題，如SN/T 1961.13—2013檢測小麥時，發(fā)現(xiàn)有些品系的小麥無法檢測，檢測部分產(chǎn)地的小麥粉無法獲得陽性結(jié)果；SN/T 1961.8—2013針對榛子的結(jié)構(gòu)基因進(jìn)行設(shè)計，并非過敏原基因，這可能導(dǎo)致某些脫敏食品仍然被檢測為含過敏原成分。同時，標(biāo)準(zhǔn)的檢出限可達(dá)0.01%，考慮到食品行業(yè)生產(chǎn)的特殊性，同一條生產(chǎn)線常常用來生產(chǎn)多類產(chǎn)品，很多無意添加將會被檢出，這將導(dǎo)致假陽性現(xiàn)象頻發(fā)，給實驗檢測帶來較高的風(fēng)險。本課題通過在國際免疫學(xué)會官方查詢易過敏食品的主要過敏原成分，確定小麥、榛子的主要過敏原基因，建立一套完整的、標(biāo)準(zhǔn)化的、準(zhǔn)確率高的、系統(tǒng)的過敏原檢測技術(shù)，以解決現(xiàn)有方法及標(biāo)準(zhǔn)所存在的問題。

1 材料與方法

1.1 試劑與耗材

熒光定量擴增試劑盒(Bio-rad、Transgen公司)，引物及熒光探針(Invitrogen公司)，自動化儀器96深孔板磁力架AUTO-96-1(Borhee公司)，NUNC 96孔U型深孔板(Borhee公司)，磁珠法植物DNA提取試劑盒(Magen公司)。

1.2 儀器與設(shè)備

Bio-rad Cfx 96 Touch實時熒光PCR儀，Eppendorf Mini Spin 離心機，Eppendorf Centrifuge 5427 R高速冷凍離心機，IKA渦懸振蕩器，Implen P330核酸蛋白定量儀，Retsch MM400行星球磨儀，Thermo-Shaker BG-100干式恒溫器，Milli-Q Academic實驗室超純水儀，蘇州凈化SW-CJ-FD型單人單面凈化工作臺。

1.3 樣品信息

本實驗建立了小麥、榛子過敏原檢測的的實時熒光PCR方法，建立方法所用樣品見表1，檢出限驗證所用樣品見表2，適用性驗證樣品見表3。

表1 方法建立所用樣品Table 1 Samples used in method establishment

表2 檢出限驗證所用樣品Table 2 Samples used in LOD

注：均為質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

表3 適用性驗證所用樣品Table 3 Samples used in applicability verification

續(xù)表3

注：無小麥麩質(zhì)樣品包括蕎麥類、玉米、燕麥等預(yù)包裝食品；無榛子油質(zhì)蛋白樣品包括花生、瓜子、腰果等預(yù)包裝食品。

1.4 PCR引物

具體引物探針序列見表4。熒光基團為FAM熒光，猝滅基團為BHQ。

表4 過敏原實驗所用引物探針序列Table 4 Primer & probe sequence used in allergen experiment

1.5 方法

1.5.1 樣品基因組的提取

對小麥、榛子樣品及60批預(yù)包裝產(chǎn)品進(jìn)行樣品前處理，用球磨儀研磨成粉，取約30 mg樣品，按照Magen的磁珠法植物DNA提取試劑盒說明書提取及基因組，放于-20 ℃保存。

1.5.2 實時熒光PCR試驗

首先用核酸蛋白定量儀確定DNA提取的效率與純度，進(jìn)行OD260/OD280值測定，測得值均在1.7～1.9之間，表明可用于PCR實驗；然后將提取成功的基因組樣品進(jìn)行PCR擴增，其反應(yīng)體系見表5。

表5 實時熒光PCR反應(yīng)體系Table 5 Reaction system of Real-time fluorescent PCR

配制完畢后充分混勻進(jìn)行PCR反應(yīng)，其反應(yīng)條件見表6。

表6 實時熒光PCR反應(yīng)條件Table 6 Reaction conditions of real-time fluorescence PCR

2 結(jié)果與分析

2.1 方法設(shè)計與質(zhì)控體系建立

根據(jù)國際免疫學(xué)會官方提交的物種主要過敏原信息，確定所選取的過敏原基因，參照GenBank中已提交的2個物種的主要過敏原序列，確定小麥(triticum aestivum)的過敏原特異性基因CM16、榛子(corylus avellana)的過敏原特異性基因Cora1，并與常見偽品序列進(jìn)行比對分析，保證引物探針的特異性。運用DNA序列分析網(wǎng)站http://sg.idtdna.com/calc/analyzer對檢測各物種的熒光定量PCR引物和TaqMan探針進(jìn)行序列高級結(jié)構(gòu)分析比對，以確保其高度的特異性，防止出現(xiàn)二聚體、莖環(huán)及發(fā)卡等影響檢測效率的結(jié)構(gòu)。

依據(jù)此引物探針進(jìn)行PCR反應(yīng)，對每個品種各5種正品、8～10種偽品進(jìn)行實時熒光PCR鑒定，保證能夠特異性區(qū)分正品與偽品。根據(jù)實時熒光PCR反應(yīng)原理及相關(guān)食品檢測標(biāo)準(zhǔn)，考慮到食品行業(yè)檢測樣本的復(fù)雜性，根據(jù)檢出限設(shè)定本方法的判定原則為：

(1)陰性對照、空白對照不得有CT值；

(2)當(dāng)樣品CT值≤35，有典型擴增曲線時，判定為檢出；

(3)當(dāng)樣品CT值>35，無典型擴增曲線時，判定為未檢出；

(4)當(dāng)樣品無CT值，判定為未檢出。

2.2 內(nèi)參實驗驗證

DNA提取成功后檢測DNA濃度及純度，顯示濃度均在10 ng/μL以上，A260/280均在1.7～1.9之間，證明DNA提取效果良好，可用于實時熒光PCR實驗。

為了進(jìn)一步確認(rèn)DNA的提取效率，我們建立了內(nèi)參驗證實驗，進(jìn)行18Sr RNA驗證，以保證DNA可用于實時熒光PCR檢測，驗證結(jié)果見圖1。

圖1 內(nèi)參實時熒光PCR結(jié)果
Fig.1 Reference real-time PCR results of internal-reference

內(nèi)參實驗驗證成功，CT值均在15～30之間，證明DNA提取效果理想，可用于過敏原特異性檢測。

2.3 實時熒光PCR方法特異性驗證

引物與探針的特異性需要驗證其種內(nèi)適用性與種間特異性，以確定該引物與是否能滿足檢測的需要。

進(jìn)行小麥正品與偽品的實時熒光PCR反應(yīng)，實時熒光反應(yīng)體系見表5、表6，實時熒光反應(yīng)結(jié)果見結(jié)果見圖2。

圖2 小麥CM16過敏原實時熒光PCR結(jié)果
Fig.2 Real-time PCR results of wheat CM16 allergen

結(jié)果顯示，XM1-XM5五個含目標(biāo)基因的正品有擴增曲線，XM6-XM13不含目標(biāo)基因的偽品無擴增曲線，表明引物探針特異性滿足檢測要求。

進(jìn)行榛子正品與偽品的實時熒光PCR反應(yīng)，實時熒光反應(yīng)體系見表5、6，實時熒光反應(yīng)結(jié)果見結(jié)果見圖3。

圖3 榛子Cor a 1過敏原實時熒光PCR結(jié)果
Fig.3 Real-time PCR results of hazelnut Cor a 1 allergen

結(jié)果顯示，ZZ1-ZZ5五個含目標(biāo)基因的正品有擴增曲線，ZZ6-ZZ14九個不含目標(biāo)基因的偽品無擴增曲線，表明引物探針特異性滿足檢測要求。

2.4 方法重復(fù)性驗證

通過換用Transgen的實時熒光PCR預(yù)混液，在相同的實驗條件下，對方法進(jìn)行重復(fù)性驗證，結(jié)果見圖4、圖5。

圖4 小麥CM16過敏原重復(fù)性驗證
Fig.4 Repeatability verification of wheat CM16 allergen

圖5 榛子Cor a 1過敏原重復(fù)性驗證
Fig.5 Repeatability verification of of hazelnut Cor a 1 allergen

重復(fù)性驗證結(jié)果表明，在使用不同試劑盒時，同樣的實驗條件下均可獲得一致的檢測結(jié)果，證明本方法的重復(fù)性可滿足檢測要求。

2.5 方法檢出限驗證

為了確定方法的檢出限，我們將小麥、榛子烘干后，用球磨儀研成粉末狀，并與其他樣品粉末混勻，進(jìn)行DNA提取，具體混樣信息見表2，以確定本實驗建立的方法檢測靈敏度。具體檢測結(jié)果見圖6、圖7、表7。

圖6 小麥過敏原檢出限實時熒光PCR結(jié)果
Fig.6 RT-PCR results of wheat allergens LOD

圖7 榛子過敏原檢出限實時熒光PCR結(jié)果
Fig.7 RT-PCR results of hazelnut allergens LOD

表7 檢出限實時熒光PCR結(jié)果及判定Table 7 RT-PCR results and determine of LOD

結(jié)果顯示，10%濃度、1%濃度的小麥和榛子樣品檢測CT值在35以下，判定為含有小麥(或榛子)過敏原成分；而0.1%濃度的小麥和榛子樣品檢測CT值在35以上，判定為不含小麥(或榛子)過敏原成分。表明本實驗建立的方法可以準(zhǔn)確檢測過敏原成分含量在1%以上的樣品，即方法的檢出限為1%。

2.6 方法適用性驗證

為了驗證方法的可靠性與適用性，我們選擇了60批預(yù)包裝樣品(具體信息見表3)，進(jìn)行方法的驗證實驗，結(jié)果見表8和表9。

對樣品進(jìn)行DNA提取，經(jīng)檢測DNA濃度均在10～100 ng/μL之間，A260/280均在1.7～1.9之間。我們建立了內(nèi)參驗證實驗，進(jìn)行18Sr RNA驗證，以保證60批樣品的DNA均可用于實時熒光PCR檢測，驗證結(jié)果見圖8。

圖8 樣品18S rRNA內(nèi)參實驗
Fig.8 18S rRNA reference experiment

根據(jù)實驗熒光PCR結(jié)果可以看出，60批預(yù)包裝樣品的DNA結(jié)果理想，內(nèi)參實驗全部成功，CT值均在13～20之間，空白對照無CT值，表明所提取的DNA可用于實時熒光PCR檢測。

對30批XQ編號樣品進(jìn)行小麥過敏原CM16實時熒光檢測法的適用性驗證，驗證結(jié)果見圖9、表8。

圖9 小麥CM 16實時熒光結(jié)果
Fig.9 RT-PCR results of wheat CM16

表8 小麥CM 16實時熒光結(jié)果Table 8 RT-PCR results of wheat CM16

結(jié)果顯示，實時熒光判定結(jié)果與樣品實際情況一致，含有小麥麩質(zhì)樣品均檢出CT值，判定為含有過敏原成分；不含小麥麩質(zhì)的樣品CT值均>35或無CT值，判定為不含小麥過敏原成分，適用性驗證結(jié)果符合預(yù)期，表明本實驗建立的方法可用于小麥過敏原成分檢測的常規(guī)應(yīng)用。

對30批ZZ編號樣品進(jìn)行榛子過敏原Cora1實時熒光檢測法的適用性驗證，驗證結(jié)果見圖10、表9。

圖10 榛子Cor a 1實時熒光PCR結(jié)果
Fig.10 RT-PCR results of hazelnut Cor a 1

表9 榛子Cor a 1基因?qū)崟r熒光結(jié)果Table 9 RT-PCR results of hazelnut Cor a 1

結(jié)果顯示，實時熒光判定結(jié)果與樣品實際情況一致，含有榛子油質(zhì)蛋白過敏原成分的樣品均檢出CT值，判定為含有榛子過敏原成分；不含榛子油質(zhì)蛋白過敏原成分的樣品CT值均>35或無CT值，判定為不含榛子過敏原成分，適用性驗證結(jié)果符合預(yù)期，未出現(xiàn)假陽性或假陰性現(xiàn)象，表明本實驗建立的方法可用于榛子過敏原成分檢測的常規(guī)檢測。

3 結(jié)論

通過對本研究所建立的方法進(jìn)行討論分析，我們發(fā)現(xiàn)，實驗室建立的實時熒光PCR檢測方法可以準(zhǔn)確、高效地檢測樣品中的小麥、榛子過敏原成分，其特異性好，操作簡便，適用性廣，對市售常見預(yù)包裝食品均可準(zhǔn)確檢測過敏原成分，可以作為過敏原檢測的常規(guī)檢測方法。

由于免疫學(xué)檢測方法的準(zhǔn)確性和特異性主要依賴于抗體識別食物過敏原，但某些食品工業(yè)常利用熱加工、超高壓和酶解等深加工技術(shù)使過敏原蛋白發(fā)生變性和降解，而蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的改變又可干擾蛋白提取物或抗體結(jié)合部位，同時會導(dǎo)致假陰性結(jié)果的出現(xiàn)[18]；此外，由于某些過敏原缺少特異性的單克隆抗體，無法利用ELISA法進(jìn)行檢測。而新興的質(zhì)譜、SPR等技術(shù)所需的設(shè)備相對昂貴，并且對樣品要求較高，不適合作為普通實驗室及快檢實驗室的常規(guī)檢測手段，因此在過敏原檢測方面限制了其應(yīng)用。

實時熒光PCR法作為一種新型檢測技術(shù)，在過敏原檢測中發(fā)揮了越來越重要的作用。它有效地解決了免疫學(xué)方法存在的無法檢測加工食品、假陰性率高等問題，并且儀器較為廉價，對人員經(jīng)驗及操作要求較低，且檢測成本極低，準(zhǔn)確率高，重復(fù)性好，適用性強，遍于普及應(yīng)用。因此，實時熒光PCR法將是過敏原檢測的重要發(fā)展方向，我們初步建立了小麥、榛子的過敏原檢測方法，并適當(dāng)調(diào)整了方法的檢出限，以降低檢測誤判所帶來的風(fēng)險。同時，我們建立了過敏原基因的數(shù)據(jù)庫，為將來的實時熒光PCR檢測方法開發(fā)提供了理論基礎(chǔ)與數(shù)據(jù)支持。