黃勝佳，葉霜，熊博，劉新亞，徐穎歡，董志翔，汪志輝，2*

1(四川農業(yè)大學 園藝學院，四川 成都，611130) 2(四川農業(yè)大學 果蔬研究所，四川 成都，611130)

柑橘(Citrus)為蕓香科(Rutaceae)柑橘亞科(Subfamilyaurantioideae)植物[1]，是全世界種植最多的水果之一。橙類是世界栽培最廣泛的柑橘種類，分為甜橙、臍橙、血橙等[2]，具有非常高的營養(yǎng)價值。雜柑是由橘和橙(或柚)雜交而成，兼有橘和橙(或柚)的優(yōu)勢[3]。

柑橘果實富含能參與人體新陳代謝、調節(jié)有關生理活動、對人體保健和疾病防治有重要作用的生物活性物質[4-5]。果蔬中富含酚類物質，其中類黃酮約占2/3，酚酸約占1/3[6]。近年來研究表明，酚類物質具有抗炎[7]、抗氧化[8]、抗過敏、抗癌、抗突變、抑菌等重要作用[9]。目前，對不同柑橘品種酚酸和類黃酮的含量差異研究主要集中于柚類[10-12]、金柑[13]、寬皮柑橘以及柑橘幼果[14]，對名、特、優(yōu)、新且在水果市場具有廣闊發(fā)展前景的雜柑以及橙類進行比較、分析的報道較少。

本研究在前人基礎上[15-17]，通過優(yōu)化HPLC條件，在保證檢測酚類物質多元化的同時，樣品前期處理簡單、操作簡便，無需繁瑣的提取步驟，且檢測時間短，檢測限、精密度和回收率方面的效果優(yōu)良。本試驗對四川主栽雜柑和橙類中10種酚類物質的含量進行測定，探討不同柑橘品種果肉、果皮中酚類物質含量的差異，分析其規(guī)律。

1 材料與方法

1.1 材料

選取生長健壯、樹勢樹形基本一致、株行距為3 m×4 m、中等管理水平的口之津32號、沃柑、金諾、黃果柑、春見、晚紅血橙、塔羅科血橙、奈維林娜臍橙為試材。在果實成熟期，每株樹按樹冠外圍的東、南、西、北、中5個部位采樣，每個部位隨機采取中等大小、無病蟲害無畸形的3個果，采回后將果皮、果肉分離，置于-80 ℃冰箱中冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

標準品：柚皮素(naringenin)、柚皮苷(naringin)、新橙皮苷(neohesperidin)、咖啡酸(caffeic acid)、芥子酸(sinapic acid)、綠原酸(chlorogenic acid)、阿魏酸(ferulic acid)、沒食子酸(gallic acid)、蘆丁(rutin)和對羥基苯甲酸(p-hydroxybenzoic acid)，均購自Sigma公司，純度均在98%以上。甲醇、甲酸和乙腈均為色譜純，購自麥克林公司；實驗用水為超純水。

1.2 方法

1.2.1 樣品前處理

從-80 ℃冰箱中取出凍成塊的果皮、果肉，將其敲碎后混勻，分別取果皮和果肉至研缽中，加入液氮研磨成粉末后，準確稱取0.5 g混合樣放入2 mL離心管中，避光條件下加入1.5 mL提取液[V(甲醇)∶V(水)∶V(甲酸)=70∶28∶2]，充分混勻。將離心管放入超聲裝置中輔助提取30 min后，在4 ℃、5 000 r/min離心條件下離心15 min。取出離心管，吸取上清液。用0.45 μm微孔濾膜過濾，貯存于-20 ℃冰箱中，用于酚酸及類黃酮的分析。

1.2.2 標準曲線的繪制

用甲醇(色譜純)將每瓶定量的20 mg標準品分別溶解，定容于10 mL棕色容量瓶中，配制成2 g/L的標準品母液。全程都進行避光處理，將上述母液用流動相分別配制成0.25、0.5、1、2、5、10、25、50、100 mg/L的濃度梯度，再配制成混合標準溶液，避光保存于-20 ℃以下的環(huán)境中[17]。

將上述混合標準溶液進行色譜分析，以標樣的質量濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制出10種酚類物質的標準曲線，并且計算出回歸方程和相關系數。

1.2.3 色譜條件

使用安捷倫1260液相色譜儀，C18色譜柱(5 μm，4.6 mm×150 mm)，柱溫30 ℃，進樣量20 μL。流動相：A為甲酸溶液，體積分數為10%，B為乙腈，梯度洗脫，流速為1 mL/min，洗脫程序表1所示。

表1 流動相配比與洗脫時間Table 1 Flow matching ratio and elution time

柚皮苷、新陳皮苷、柚皮素用283 nm波長檢測，咖啡酸、芥子酸、綠原酸、阿魏酸用320 nm波長檢測，沒食子酸用280 nm波長檢測，對羥基苯甲酸用260 nm波長檢測，蘆丁用367 nm波長檢測[18-21]。由于本實驗所用安捷倫1260儀器的檢測器只能在方法中設置波長，而不能自動檢測并調整到最適波長，所以在測定前需對波長進行系統(tǒng)設置。蘆丁和芥子酸出峰時間相近，對羥基苯甲酸和綠原酸出峰時間相近，雖在樣品中能準確分離，但無法準確設置切換波長的時間，即檢測時1個樣測定2次，第1次共檢測280, 320，283 nm三個波長，在此條件下能檢測出咖啡酸、芥子酸、綠原酸、阿魏酸、柚皮苷、新橙皮苷、柚皮素、沒食子酸。第2次檢測260 nm和367 nm波長，在此條件下能檢驗出對羥基苯甲酸和蘆丁。

1.3 數據分析

試驗數據用IBM SPSS 19.0軟件，以p<0.05為顯著水平，對結果進行統(tǒng)計分析；用IBM SPSS 19.0軟件，進行維度的偏好性分析。

2 結果與分析

2.1 酚類物質標準品色譜分析

圖1為混合標準品55 min內分別在280、320、367、283 nm波長下的色譜圖。根據保留時間的不同，峰依次為沒食子酸、綠原酸、咖啡酸、阿魏酸、芥子酸、蘆丁、柚皮苷、新橙皮苷、柚皮素。由圖1可知，9種酚類物質出峰較好，可滿足多種酚類物質的同時分離。圖2為對羥基苯甲酸在260 nm波長下的色譜圖。由于對羥基苯甲酸出峰時間在7 min左右，與綠原酸出峰時間相近，無法準確設置切換波長的時間，故分開來測定。由圖2可知對羥基苯甲酸出峰較好。

圖1 混合標樣在不同波長下的色譜圖
Fig.1 Chromatogram of mixed standard samples at different wave lengths

圖2 對羥基苯甲酸在260 nm波長下的色譜圖
Fig.2 Chromatogram of p-hydroxybenzoic acid at 260 nm wave length

2.2 HPLC分析方法的考察

2.2.1 線性關系及檢出限

將混合標準溶液配制成不同濃度在色譜條件下進行測定，根據色譜圖計算回歸方程、相關系數、線性范圍和檢出限。由表2可知，各標準品的濃度與峰面積呈現出良好的線性相關，相關系數達到0.999 1～1，準確度較高。且檢出限低于0.03 μg/g，滿足酚酸和類黃酮的檢測分析。

表2 酚類物質的標準曲線回歸方程、相關系數、線性范圍、檢出限Table 2 Regression equations, correlation coefficients, linearity range, detection limit of phenolic compositions

2.2.2 精密度試驗

將50 mg/L混合標準溶液按1.2.3的色譜條件重復進樣6次，根據各標準品的峰面積計算標準溶液的標準偏差(RSD)以確定該色譜方法的精密度?？Х人?、芥子酸、綠原酸、阿魏酸、沒食子酸、蘆丁、柚皮苷、新陳皮苷、柚皮素、對羥基苯甲酸的RSD值分別為0.89%、0.92%、0.38%、0.82%、1.90%、0.96%、1.12%、1.00%、0.73%、0.61%。各物質的RSD介于0.38%～1.90%，說明該方法具有很好的精密度。

2.2.3 重復性試驗

準確稱取同一份樣品6份，按1.2.1的樣品前處理方法將樣品做相同處理后，在1.2.3的色譜條件下將進行測定，根據峰面積計算各樣品中酚類物質的含量，并計算得出RSD值?？Х人帷⒔孀铀?、綠原酸、阿魏酸、沒食子酸、蘆丁、柚皮苷、新陳皮苷、柚皮素、對羥基苯甲酸的RSD值分別為3.42%、3.45%、3.44%、2.42%、2.84%、2.85%、1.88%、3.16%、2.75%、3.52%，10種酚類物質的RSD值均小于3.52%，表明該測定方法的重復性良好。

2.2.4 穩(wěn)定性試驗

將處理好的待測溶液分別在0、2、4、6、8、12、24、36、48 h進樣，測定樣品中10種酚類物質含量。樣品中咖啡酸、阿魏酸、綠原酸、蘆丁、柚皮苷、對羥基苯甲酸、柚皮素保留時間和含量的RSD值均小于4.69%，表明在48 h內穩(wěn)定性良好；芥子酸、沒食子酸、新陳皮苷保留時間和含量的RSD值在12 h內小于4.22%，表明其在12 h內穩(wěn)定性良好，應在12 h內完成測定。

2.2.5 加樣回收率試驗

準確稱取已知含量的樣品6份，根據樣品中各酚類物質含量確定各標樣的添加量，分別加入一定量的混合標準溶液，進行回收率實驗。結果如表3所示，平均回收率為90.26%～118.85%，RSD為0.96%～3.01%，表明該試驗方法準確度較高。

表3 回收率試驗結果Table 3 Results of recovery

2.3 柑橘果實中酚酸物質含量的測定

2.3.1 柑橘果肉中酚酸含量的測定

由表4可知，不同柑橘品種果肉中酚酸含量組成差異較大，在雜柑和橙類果肉中均檢測到了咖啡酸、沒食子酸和對羥基苯甲酸；在橙類和口之津32號果肉中均未檢測到阿魏酸；只有塔羅科血橙、奈維林娜臍橙和黃果柑檢測到了芥子酸；除金諾外其他品種中均檢測到了綠原酸。

表4 不同柑橘品種果肉中酚酸含量 單位：μg/g 鮮重

注：表中所有含量均以鮮質量計。同列數據后字母不同表示處理間差異顯著(p<0.05)。表5、表6、表7同。

不同柑橘品種果肉中同一種酚酸的差異較顯著，口之津32號果肉中咖啡酸的含量為6.027 5 μg/g，顯著高于金諾、晚紅血橙和沃柑等，其中奈維林娜臍橙最低，為2.338 4 μg/g；奈維林娜臍橙和黃果柑果肉中芥子酸的含量顯著高于其他品種，分別為1.632 8、1.535 3 μg/g；塔羅科血橙果肉中綠原酸的含量為11.345 5 μg/g，其次為黃果柑和奈維林娜臍橙，顯著高于其他幾個品種；金諾和春見果肉中阿魏酸的含量分別為1.316 2 μg/g、1.289 6 μg/g，顯著高于其他品種；果肉中沒食子酸的含量以金諾最高，為4.076 7 μg/g；在不同柑橘品種果肉中，對羥基苯甲酸的含量差異顯著，含量為2.116 1～3.033 8 μg/g。

2.3.2 柑橘果皮中酚酸含量的測定

由表5可知，口之津32號果皮中總酚酸含量最高，其次依次為沃柑、晚紅血橙、春見、金諾、奈維林娜臍橙、塔羅科血橙、黃果柑。在橙類果皮中，塔羅科血橙的芥子酸含量最高，其次依次為奈維林娜臍橙、晚紅血橙，顯著高于其他雜柑；另一方面，從不同柑橘品種果皮中主要酚酸物質組成含量分析，口之津32號和金諾果皮中酚酸以咖啡酸為主，其次為綠原酸。塔羅科血橙、晚紅血橙、沃柑、奈維林娜臍橙果皮中酚酸以綠原酸為主，其次為咖啡酸。在春見和黃果柑果皮中，酚酸主要以綠原酸為主，其次為沒食子酸；從不同柑橘品種果皮中同一酚酸物質的含量差異方面分析，口之津32號果皮中咖啡酸含量(98.888 8 μg/g)顯著高于其他幾個品種，奈維林娜臍橙、春見、黃果柑中含量最低。塔羅科血橙果皮中芥子酸含量為12.088 8 μg/g，顯著高于其他幾個品種，其中口之津32號和黃果柑中最低；沃柑果皮中綠原酸含量最高，達100.860 μg/g，顯著高于其他幾個品種，黃果柑中僅有22.174 9 μg/g。

表5 不同柑橘品種果皮中酚酸含量 單位：μg/g 鮮重

2.4 柑橘果實中類黃酮含量的測定

2.4.1 柑橘果肉中類黃酮含量的測定

由表6可知，在8種果肉中均檢測到了蘆丁，均未檢測到新橙皮苷和柚皮素；本試驗測定的8個品種果肉中類黃酮以蘆丁和柚皮苷為主，柚皮苷含量最高的為沃柑，達14.407 3 μg/g。口之津32號、金諾和春見果肉中并未檢測到柚皮苷。金諾果肉中蘆丁含量最高，為18.799 1 μg/g，最低為口之津32號，僅1.295 0 μg/g。

表6 不同柑橘品種果肉中類黃酮含量 單位：μg/g 鮮重

2.4.2 柑橘果皮中類黃酮含量的測定

表7為不同柑橘品種果皮中類黃酮含量，在果皮中均檢測到了蘆丁、柚皮苷和新橙皮苷，而柚皮素僅在沃柑和黃果柑中檢測出來，沃柑果皮中柚皮素含量顯著高于黃果柑；與果肉中蘆丁含量相似，金諾果皮中蘆丁的含量顯著高于其他7個柑橘品種，達165.904 4 μg/g。橙類果皮中蘆丁含量顯著低于其他6種雜柑，塔羅科血橙、晚紅血橙、奈維林娜臍橙的含量依次為5.439 9、30.492 5、10.062 5 μg/g；沃柑果皮中柚皮苷和新橙皮苷的含量最高，分別為19.792 9、13.931 4 μg/g，顯著高于其他品種。

2.5 柑橘酚類物質的聚類分析

對柑橘果肉和果皮中的酚類物質進行維度的偏好性分析，結果如圖3所示。圖3-a為果肉中酚類物質維度的偏好性分析，由圖3-a可知在柑橘果肉中，阿魏酸、蘆丁和沒食子酸與金諾的距離較近，表明金諾與其他柑橘品種相比，果肉中阿魏酸、沒食子酸和蘆丁的含量最高；其他7個柑橘品種沒有明顯的分布規(guī)律。

圖3-b為果皮中酚類物質維度的偏好性分析，由圖3-b可知，咖啡酸、阿魏酸、對羥基苯甲酸與口之津32號的距離最近，口之津32號果皮中3種酚酸的含量顯著高于其他柑橘品種，說明這3種酚酸與口之津32號聯系較緊密；新橙皮苷、柚皮苷、沒食子酸、綠原酸與沃柑的距離較近，表明這4種酚類物質在沃柑果皮中含量最高；與其他5個雜柑品種相比，橙類與芥子酸的距離較近，且含量顯著高于雜柑，雜柑與蘆丁的距離較近，含量顯著高于橙類(表6)。

3 討論

圖3 果實酚類物質維度的偏好性分析
Fig.3 Preference analysis of phenols in fruits

不同柑橘品種果實中酚酸以咖啡酸和綠原酸為主，果肉中阿魏酸只在4個品種中檢測出來，而另有研究發(fā)現柑橘中主要以咖啡酸和阿魏酸為主[20,22-23]，產生的差異可能與品種之間的差異、成熟度、產地等有關；類黃酮以蘆丁和柚皮苷為主，該結果與李利改等[24]的研究結果基本一致；果肉中所測10種酚類的總量由高到低依次為：沃柑、塔羅科血橙、金諾、奈維林娜臍橙、黃果柑、晚紅血橙、口之津32號、春見。果皮中以口之津32號最高，其次依次為金諾、沃柑、春見、晚紅血橙、黃果柑、奈維林娜臍橙、塔羅科血橙；不同柑橘品種果肉中的酚類物質含量低于果皮，果皮中蘆丁含量是果肉的1.15～90.39倍，這與SCORDINO等[25]的研究結果基本一致。本研究的8個柑橘品種果皮和果肉中蘆丁含量均在金諾中最高，且在8個柑橘品種果肉中，金諾阿魏酸、沒食子酸和蘆丁的含量最高；在8個柑橘品種果皮中，口之津32號咖啡酸、阿魏酸、對羥基苯甲酸的含量最高；新橙皮苷、柚皮苷、沒食子酸和綠原酸在沃柑果皮中最多；橙類可能與芥子酸存在一定的關系，即芥子酸可能在橙類中的含量較高，同時雜柑中蘆丁含量顯著高于橙類，因此雜柑可能與蘆丁有一定的關系，即蘆丁在雜柑中的含量較高。目前，對雜柑和橙類分類研究的相關報道還較少，今后可繼續(xù)對雜柑和橙類中其他酚類物質以及不同品種進行研究，分析其規(guī)律，對探討不同柑橘品種果實間酚類物質含量的差異以及提高果實的綜合利用價值具有重要意義。

本研究用高效液相色譜法對柑橘進行測定時的優(yōu)點有：樣品提取方法簡單，無需繁瑣的提取步驟，如較多研究報道，樣品預處理需要振蕩提取[19-20]或者旋轉蒸干[20,26]，本方法能更快速簡便地對樣品進行有效提取，但提取后還有其他酚類物質有待進一步確定其成分；已有研究報道，在臍橙果肉和果皮中均未檢測到柚皮苷、新橙皮苷、柚皮素3種黃烷酮類酚類物質[19]，而本試驗檢測限低于0.03 μg/g，能在果肉和果皮中檢測到這3種黃烷酮。同時本方法重復性好，精密度高，加樣回收率高，因此能有效檢測柑橘中的酚類物質。