田潤苗 張雪海 湯繼華 白光紅 付志遠,*

?

玉米種子萌發(fā)相關性狀的全基因組關聯(lián)分析

田潤苗1,**張雪海1,**湯繼華1白光紅2付志遠1,*

1河南農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院, 河南鄭州 450002;2新疆農(nóng)業(yè)大學, 新疆烏魯木齊 830052

種子萌發(fā)是出苗的前提, 對玉米產(chǎn)量影響重大。為了解玉米種子萌發(fā)相關性狀的遺傳機制, 本研究對476份玉米自交系種子萌發(fā)相關的6個性狀進行調(diào)查, 結(jié)合125萬個(1.25M) SNP標記, 利用3種統(tǒng)計模型(Q, K, Q+K)進行全基因關聯(lián)分析(GWAS)。結(jié)果表明K模型能夠較好地評價吸脹前重量、吸脹前體積、吸脹后重量、吸脹后體積和吸脹體積5個性狀; Q+K模型能更好地評價吸脹重量性狀?；谶@6個性狀的最優(yōu)模型的GWAS結(jié)果, 共檢測到15個種子萌發(fā)相關性狀的顯著SNP, 15個SNP對應6個QTL, 集中分布在玉米第3、第6、第7和第10染色體上, QTL內(nèi)單個SNP能解釋的表型變異為5.09%~7.85%。其中5個QTL可在多個生物學重復中被檢測到。以最顯著SNP所在基因或附近基因作為QTL的候選基因, 共篩選到6個最可能的候選基因。GRMZM2G148411是吸脹后重量、吸脹重量和吸脹體積3個性狀共同鑒定到的QTL候選基因, 根據(jù)基因的功能注釋, 該基因編碼一個包含TLD-domain的鈣離子結(jié)合蛋白, 可能是一種調(diào)控種子休眠與萌發(fā)的信號分子。本研究鑒定的QTL為解析玉米種子萌發(fā)的遺傳機制和相應功能標記的開發(fā)奠定了基礎。

玉米; 種子萌發(fā); 全基因組關聯(lián)分析; 候選基因

隨著玉米機械化收獲程度的提高, 生產(chǎn)上對玉米種子田間出苗率和出苗整齊度的要求越來越高。種子的高效萌發(fā)是種子出苗的前提[1]。大量生產(chǎn)實踐證明不同玉米自交系的發(fā)芽率和出苗率均存在廣泛的遺傳變異[2-3], 解析玉米種子出苗能力的遺傳基礎, 發(fā)掘玉米萌發(fā)相關性狀的優(yōu)良等位基因, 對玉米產(chǎn)量的提高及農(nóng)業(yè)機械化收獲具有重要意義。

全基因組關聯(lián)分析(genome-wide association studies, GWAS)是研究數(shù)量性狀的重要方法之一, 最早用于人類疾病研究[4]。近年來, 隨著新一代測序技術的發(fā)展, GWAS在植物重要性狀遺傳機制研究中的應用越來越多。Atwell等[5]在擬南芥中首次證明應用GWAS的可行性, 并指出此方法也適用于其他植物。玉米具有豐富的遺傳變異和快速的連鎖不平衡衰減, 是遺傳學研究的重要模式作物。近十年來, 以玉米為材料的GWAS取得了很大進展[7]。以本研究所用關聯(lián)群體為例, Li等[8]用1.03萬個SNP標記對籽粒含油量進行GWAS, 共檢測出74個顯著位點。Liu等[9]通過整合簡化基因組測序、高密度SNP芯片及深度RNA測序數(shù)據(jù), 開發(fā)一套包含1.25M SNP的標記(MAF≥AFP), 并以此重新檢測了關聯(lián)群體的籽粒含油量, 檢測到13個新的顯著位點。而利用GWAS對種子萌發(fā)相關性狀進行遺傳分析的報道相對較少。Huang等[10]用5.6萬個SNP標記對125個玉米自交系在種子萌發(fā)階段和幼苗期的耐冷性進行GWAS, 共檢測到43個顯著位點。Shi等[11]利用GWAS對水稻種子在鹽脅迫條件下的7個萌發(fā)相關性狀進行分析, 檢測到11個主效位點。Kan等[12]用大豆種子萌發(fā)階段耐鹽性的GWAS檢測到8個顯著SNP。

種子出苗受多種因素影響, 如種子萌發(fā)能力、種子活力等。種子萌發(fā)包含吸脹和代謝過程的起始、吸水滯后期、進一步吸水后胚根出現(xiàn)3個階段[13]。目前的研究主要集中在種子萌發(fā)的第二和第三階段。Fu等[14]利用蛋白質(zhì)組學方法獲得了玉米種子萌發(fā)第二階段的雜種優(yōu)勢相關差異表達蛋白。Hu等[15]對玉米種子低溫條件下萌發(fā)能力的QTL分析, 鑒定出6個種子發(fā)芽率的QTL及6個胚根長度的QTL。Han等[16]在人工老化的條件下對玉米種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢、幼苗干重及幼苗根部干重的QTL分析, 共檢測到65個QTL, 結(jié)合代謝組mQTL分析, 共鑒定出23個候選基因, 這些基因通過調(diào)控糖酵解通路和蛋白質(zhì)代謝進而影響種子的萌發(fā)。種子吸脹作為種子休眠結(jié)束和種子萌發(fā)第一階段, 對種子的正常萌發(fā)具有重要意義, 但相關的遺傳研究很少。Farzaneh等[17]利用反向遺傳學方法找到一些在擬南芥種子吸脹過程中差異表達的基因, 這些基因的缺失突變體表現(xiàn)出與種子萌發(fā)和休眠相關的表型。Li等[18]研究水稻家族基因時, 發(fā)現(xiàn)6個與種子吸脹有關的基因。Noblet等[19]在玉米種子低溫吸脹過程中的細胞膜磷脂重組的研究中發(fā)現(xiàn), 玉米種子中飽和脂肪酸與不飽和脂肪酸的差異積累與種子吸脹過程中對低溫的敏感性有關。目前有關玉米種子吸脹相關性狀的QTL研究尚無報道。為了解玉米種子吸脹相關性狀的遺傳機制, 本研究對476份玉米自交系種子吸脹前后及吸脹程度的6個相關性狀進行測定, 利用1.25M的SNP標記(http://www. maizego.org/Resources.html)對這些性狀進行GWAS, 以挖掘影響種子萌發(fā)的相關候選基因, 并為相應基因的克隆及功能標記的開發(fā)奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗設計與性狀調(diào)查

476份玉米自交系來自溫帶、熱帶及亞熱帶(http://www.maizego.org/Resources.html), 于2017年春季在室內(nèi)進行發(fā)芽實驗, 共3個生物學重復, 每個生物學重復3次抽樣測定, 每次抽樣均由20粒大小一致的健康種子構(gòu)成。種子浸泡前, 分別測定每次抽樣的20粒干種子的重量(W1)和排水體積(V1); 種子吸脹24 h后(溫度26℃, 濕度60%), 用濾紙拭干種子表面的水分, 再次測定每次抽樣的重量(W2)和排水體積(V2); 每次抽樣的吸脹重量W3和吸脹體積V3分別由W3=W2–W1和V3=V2–V1公式計算得到。以每個生物學重復3次抽樣的平均值作為該重復的值, 以每個材料3個生物學重復的平均值作為該性狀的值。對每個生物學重復及其平均值分別進行GWAS。測定完種子性狀后, 繼續(xù)培養(yǎng)(室內(nèi)發(fā)芽盒中土培)以確保種子萌發(fā)出苗。

1.2 統(tǒng)計分析

使用SPSS 23.0軟件對各表型數(shù)據(jù)進行雙因素方差分析(two-way ANOVA)、皮爾遜相關性分析(Pearson correlation analysis)及正態(tài)性檢驗(normality test)。

1.3 全基因組關聯(lián)分析

1.25M SNP基因型數(shù)據(jù)從Maizego網(wǎng)站獲得(http://www.maizego.org/Resources.html), 在TASSEL3.0軟件中, 分別用只控制群體結(jié)構(gòu)的Q模型、只控制親緣關系的K模型, 以及同時控制群體結(jié)構(gòu)和親緣關系的Q+K模型實現(xiàn)關聯(lián)分析。根據(jù)Quantile- Quantile 散點圖(QQ plot)對每一個性狀在3種模型下的結(jié)果進行比較, 并選擇最優(yōu)模型下的GWAS結(jié)果作為后續(xù)QTL分析的基礎。每個性狀的曼哈頓圖和QQ plot均利用R完成(R Core Team 2012, http:// www.R-project.org/)。以=2.04×10–6(1/,為GEC軟件計算出的有效標記數(shù)490 547)作為顯著關聯(lián)SNP的閾值[20]。

1.4 候選基因的篩選

由于該關聯(lián)群體10條染色體的平均連鎖不平衡衰減(LD)距離為30 kb[9], 本研究以顯著SNP上下游各延伸30 kb的區(qū)間定義為一個QTL, 當相鄰QTL物理區(qū)間有重疊時(B73 v2版本), 則認為是同一個QTL。以每個QTL內(nèi)最顯著SNP所在基因或鄰近基因作為該QTL的首要候選基因, 利用MaizeGDB、NCBI及TAIR網(wǎng)站對QTL內(nèi)的候選基因進行功能注釋和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 種子萌發(fā)相關性狀的統(tǒng)計分析

6個性狀均表現(xiàn)廣泛的遺傳變異, 其中, 吸脹前體積(V1)的變異系數(shù)最小為17.35%, 吸脹體積的變異系數(shù)最大為28.41% (表1)。所有性狀的頻次分布 (圖1)、峰度和偏度(絕對值均小于1)都表現(xiàn)出明顯的正態(tài)分布特征, 說明這6個性狀均是由微效多基因控制的典型數(shù)量性狀。

方差分析和相關性分析結(jié)果表明, 6個性狀在不同材料間均存在極顯著差異(表2), 且6個性狀兩兩之間均極顯著相關(表3), 說明這些性狀彼此影響, 且基因型的差異是導致其性狀差異的主要原因, 環(huán)境因素對性狀的表現(xiàn)影響較小。

表1 種子萌發(fā)性狀表型統(tǒng)計分析

W1: 吸脹前重量; V1: 吸脹前體積; W2: 吸脹后重量; V2: 吸脹后體積; W3: 吸脹重量; V3: 吸脹體積。

W1: weight before imbibition; V1: volume before imbibition; W2: weight after imbibition; V2: volume after imbibition; W3: weight of imbibition; V3: volume of imbibition.

表2 種子萌發(fā)性狀方差分析

各性狀詳細名稱見表1。*和**分別表示在0.05和0.01水平差異顯著。

Name of each trait is given in Table 1.*,**stand for significant at the 0.05 and 0.01 probability levels, respectively

圖1 種子萌發(fā)性狀的頻次分布圖

各性狀詳細名稱見表1。Name of each trait is given in Table 1.

表3 種子萌發(fā)性狀皮爾遜關聯(lián)分析

各性狀詳細名稱見表1。*和**分別表示在0.05和0.01水平差異顯著。

Name of each trait is given in Table 1.*,**stand for significant at the 0.05 and 0.01 probability levels, respectively.

2.2 關聯(lián)分析最優(yōu)模型選擇

從3種模型的Q-Q圖可以看出(圖2), Q模型的假陽性最高(產(chǎn)生更多的I型錯誤)。對吸脹前重量、吸脹前體積、吸脹后重量、吸脹后體積和吸脹體積性狀而言, K模型的擬合效果最好, 即–lg()的真實值最接近預測值, 可以很好地控制假陽性, 因此, 選擇K模型的GWAS結(jié)果對這5個性狀進行QTL解析; 對吸脹重量性狀而言, Q+K模型擬合效果最好。因此, 選擇Q+K模型作為吸脹重量性狀GWAS的最終模型。

2.3 全基因組關聯(lián)分析與候選基因篩選

基于最優(yōu)模型, 在閾值為≤2.04×10–6(1/, 1/490 547)時, 共檢測到與6個性狀顯著關聯(lián)的15個SNP, 分布在玉米第3、第6、第7、第10染色體上(圖3和表4)。15個SNP對應6個QTL, 其中, 第7染色體上有2個QTL, 分別影響吸脹前重量(Chr7.S_4828028所在QTL)和吸脹體積(Chr7.S_145970024所在QTL), 可分別解釋5.84%和5.13%的表型變異; 第10染色體上的QTL (Chr10.S_6373105所在QTL), 可同時影響吸脹后重量、吸脹重量和吸脹體積, 說明該位點為一因多效位點, 可解釋的表型變異為5.17%~6.95%; 第6染色體上檢測出2個QTL, 均影響吸脹前體積(Chr6.S_95604386所在QTL和Chr6.S_95604386所在QTL), 可分別解釋5.28%和5.93%的表型變異; 第3染色體上檢測出1個QTL (Chr3.S_197658474所在QTL), 可解釋5.93%的吸漲體積表型變異; 但沒有檢測到與吸脹后體積顯著相關的SNP (圖3)。各生物學重復的GWAS結(jié)果與各性狀均值的GWAS結(jié)果高度一致, 除影響吸脹體積的chr3.S_197658474所在QTL外, 其余QTL均在一個或多個生物學重復中被檢測到(表5和圖4)。

圖2 種子萌發(fā)性狀3種模型比較的QQ圖

各性狀詳細名稱見表1。橫軸表示經(jīng)過負的常數(shù)對數(shù)轉(zhuǎn)換的期望值, 縱軸表示經(jīng)過負的常數(shù)對數(shù)轉(zhuǎn)換觀察到的值。

Detailed name of each trait was given in Table 1. The horizontal axis shows ?lg transformed expected-values, and the vertical axis shows –lg transformed observed-values.

6個QTL內(nèi)共涉及到44個候選基因(表4), 其中僅有34% (15/44)有功能注釋, 根據(jù)候選基因的功能注釋, 選擇最顯著SNP所在基因或鄰近基因作為首要候選基因(表4)。其中, 吸脹前重量候選基因GRMZM2G167892編碼籽粒成熟蛋白(seed mature protein)。同時影響吸脹后重量、吸脹重量和吸脹體積的候選基因GRMZM2G148411 (第10染色體上), 編碼一個包含TLD結(jié)構(gòu)域的鈣離子結(jié)合蛋白。吸脹前體積的候選基因GRMZM2G318592和吸脹體積的候選基因GRMZM2G146173均編碼包含鋅指結(jié)構(gòu)域的蛋白。吸脹前體積的候選基因GRMZM2G 449489和吸脹體積的候選基因GRMZM2G544352分別編碼硒富集相關蛋白和未知功能蛋白。

圖3 種子萌發(fā)性狀全基因組關聯(lián)分析曼哈頓圖

各性狀詳細名稱見表1。黑色虛線代表全基因組關聯(lián)分析的顯著閾值。

Name of each trait is given in Table 1. Black dotted line indicates the genome-wide significance threshold.

3 討論

不同的分析模型影響關聯(lián)分析的結(jié)果。為確保關聯(lián)結(jié)果的準確性, 最大程度降低假陽性結(jié)果, GWAS前要對每個性狀進行最優(yōu)模型的選擇。Wang等[21]在玉米絲黑穗病的全基因組關聯(lián)分析中發(fā)現(xiàn), Q+K模型能更好地降低假陽性的發(fā)生。本研究對每個性狀進行了3種模型(Q, K, Q+K)的分析, 發(fā)現(xiàn)Q+K模型對吸脹前重量、吸脹前體積、吸脹后重量、吸脹后體積和吸脹體積這5個性狀的假陽性控制過于嚴格, 產(chǎn)生了一些假陰性的結(jié)果, K模型的擬合效果最好; 而Q+K模型則能更好的地控制吸脹重量性狀的假陽性。

種子的萌發(fā)受赤霉素(GA)和脫落酸(ABA)等植物激素、光照、溫度等環(huán)境因素以及一氧化氮(NO)和活性氧(ROS)等信號分子[22–27]在內(nèi)的多種因素影響。本研究所篩選的候選基因的功能大多與種子內(nèi)部激素水平、信號分子調(diào)控及活性氧有關。Li等[18]對水稻OSCA家族基因的功能研究證明鈣離子可以通過調(diào)控吸脹種子的水勢影響萌發(fā), 因此與鈣離子結(jié)合相關的結(jié)構(gòu)或蛋白均可能影響種子萌發(fā)。GRMZM2G148411編碼具有TLD結(jié)構(gòu)域的核仁蛋白(TLD-domain containing nucleolar protein), 在擬南芥中有2個同源基因。其中, AT4G34070編碼一種具有EF-hand基序的鈣結(jié)合蛋白(Calcium-binding EF-hand family protein), 可能與NADPH氧化酶的合成有關; AT5G06260編碼一種與影響鈣離子結(jié)合的具有TLD結(jié)構(gòu)域的核仁蛋白。GA可以作為主要的鈣離子感受器, 增加鈣離子和鈣調(diào)蛋白, 對大麥糊粉層中鈣離子信號傳導起重要作用; ABA的作用與GA相反[28]。因此, 我們推測GRMZM2G148411可能作為NADPH氧化酶的組分, 調(diào)節(jié)種子內(nèi)部ROS的濃度; 或作為鈣離子調(diào)控的信號分子, 通過調(diào)節(jié)鈣離子與鈣調(diào)節(jié)蛋白的濃度影響種子內(nèi)部GA和ABA的相對水平, 進而影響種子萌發(fā)。吸脹前體積候選基因GRMZM2G318592和吸脹體積候選基因GRMZM2G146173, 均編碼一種含有鋅指結(jié)構(gòu)的蛋白。Baek等[29]發(fā)現(xiàn), 擬南芥中的基因?qū)BA和氧化脅迫下的種子萌發(fā)和ROS含量具有重要作用, 該基因編碼一種包含鋅指結(jié)構(gòu)域的核蛋白。Joseph等[30]研究擬南芥種子中ABA的合成與信號轉(zhuǎn)導時, 發(fā)現(xiàn)ZFP3 (鋅指蛋白3)是種子萌發(fā)過程中抑制ABA的調(diào)控因子, 賦予種子對ABA的不敏感性。因此, 推測本研究中的2個編碼鋅指蛋白的候選基因, 可能是通過調(diào)控玉米種子對ABA的敏感程度進一步影響種子的休眠和萌發(fā)。上述3個候選基因均作為信號分子直接或間接地參與種子萌發(fā)期間內(nèi)部GA與ABA的相對水平以及ROS含量的調(diào)控, 進而影響種子的休眠與萌發(fā)。Yazdanpanah等[17]通過反向遺傳學方法找到的種子休眠與萌發(fā)有關基因中, AT3G22490編碼種子成熟蛋白(seed maturation protein), 該基因的敲除突變導致種子提前終止休眠。本研究中的候選基因GRMZM2G167892也編碼一種種子成熟蛋白, 該基因可能與種子的萌發(fā)及休眠有關, 具體作用機制還有待進一步研究。

(圖4)

Fig 4 Manhattan of GWAS for seed germination traits (single round)

各性狀詳細名稱見表1。R1: 第1重復; R2: 第2重復, R3: 第3重復。黑色虛線代表全基因組關聯(lián)分析的顯著閾值。

Name of each trait is given in Table 1. R1: the first biological repeat; R2: the second biological repeat; R3: the third biological repeat. Black dotted line indicates the genome-wide significance threshold.

表5 種子萌發(fā)性狀顯著關聯(lián)位點

(續(xù)表5)

各性狀詳細名稱見表1。每個性狀中重復檢測到的SNP用粗體標注。

Name of each trait is given in Table 1. SNPs repeatedly detected in each trait are marked boldly.

4 結(jié)論

共檢測到15個顯著的SNP-性狀關聯(lián), 涉及6個QTL, 并鑒定出6個最可能的候選基因, 其中, 3個可能通過調(diào)節(jié)種子萌發(fā)過程中激素及ROS水平影響種子萌發(fā), 1個可能通過調(diào)控種子成熟影響種子萌發(fā), 另2個影響種子萌發(fā)的機制未知。

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Genome-wide Association Studies of Seed Germination Related Traits in Maize

TIAN Run-Miao1,**, ZHANG Xue-Hai1,**, TANG Ji-Hua1, BAI Guang-Hong2, and FU Zhi-Yuan1,*

1College of Agronomy, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002, Henan, China;2Xinjiang Agricultural University, Urumqi 830052, Xinjiang, China

Germination is important for seed emergence, which has significant impact on maize yield. To reveal the genetic mechanism of maize seed germination, we investigated six traits related to seed germination using 467 diverse inbred lines. The genome-wide association studies (GWAS) between the six traits and 1.25M SNPs were implemented in three different models (Q model, K model, and Q+K model). The K model was much better than the other two models for weight before imbibition, volume before imbibition, weight after imbibition, volume after imbibition and volume of imbibition. While weight of imbibition trait could be well evaluated by Q+K model. In total, 15 SNPs were significantly associated with the six traits by the optimal model. These SNPs correspond to six QTLs, including five QTLs co-located in different biological replications. The six QTLs were located on chromosomes 3, 6, 7, and 10. The single SNP could explain 5.09%–7.85% variation of phenotype. Genes within or nearby most significant SNP were selected as candidates, and six candidate genes were identified for seed germination related traits in the six loci. Among these genes, GRMZM2G148411 encoding a TLD-domain calcium ion binding protein according to the annotations associated with weight after imbibition, volume after imbibition and volume of imbibition might be a signal molecule regulating seed germination and dormancy. The QTLs identified in this study are useful for developing functional markers and elucidating the genetic basis of seed germination.

maize; seed germination; genome-wide association study; candidate gene

2017-11-02;

2018-03-15;

2018-03-16.

10.3724/SP.J.1006.2018.00672

本研究由國家自然科學基金地區(qū)科學基金項目(31760389)資助。

This study was supported by the Regional Science Foundation of National Natural Science Foundation of China (31760389).

付志遠, E-mail: fuzhiyuan2004@163.com

E-mail: tianrunmiao@foxmail.com

**同等貢獻(Contributed equally to this work)

http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20180316.0917.006.html