張 萍，師文飛，黃文福，牛 春

(寧夏泰瑞制藥股份有限公司，銀川 750100)

紅霉素( Erythromycin, Er)是由紅色糖多孢菌(Saccharopolysporaerythraea)合成的14元大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，又被稱為robimycin 或e-mycin，包括ErA～ErF[1]，其中ErA的抑菌活性最高。紅霉素具有廣譜抗菌作用，其抗菌譜與青霉素相似[2]，對(duì)革蘭陽(yáng)性菌尤其敏感，對(duì)葡萄球菌、化膿性鏈球菌、綠色鏈球菌、肺炎鏈球菌、梭狀芽孢桿菌、白喉?xiàng)U菌等有較強(qiáng)的抑制作用，是治療耐藥性金黃色葡萄球菌和溶血性鏈球菌感染而引起疾病的首選藥物，臨床上可用于治療對(duì)青霉素過(guò)敏的患者。近幾年紅霉素衍生物的興起，大大刺激了母體紅霉素的需求[3-4]。

我國(guó)紅霉素發(fā)酵水平屬低水平重復(fù)操作，與發(fā)達(dá)國(guó)家相比差距較大。目前國(guó)外發(fā)酵單位己達(dá)8000～12000 U/mL，而國(guó)內(nèi)大多企業(yè)紅霉素發(fā)酵水平卻一直在4000～5000 U/mL[5]。紅霉素發(fā)酵水平主要受工作菌種、培養(yǎng)基組成、發(fā)酵條件控制以及后期的分離提純條件等多方面因素的影響，國(guó)內(nèi)很多科技工作者從紅霉素發(fā)酵相關(guān)參數(shù)和調(diào)控入手，希望提高紅霉素發(fā)酵水平。對(duì)前期選育的一株高產(chǎn)紅霉素紅色糖多孢菌菌株培養(yǎng)基進(jìn)行了響應(yīng)面法優(yōu)化，以使其更好的發(fā)揮菌株的生長(zhǎng)特性，進(jìn)一步提高發(fā)酵液中紅霉素產(chǎn)量。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株 紅色糖多孢菌，由寧夏泰瑞制藥股份有限公司技術(shù)研發(fā)中心菌種研究室選育、保藏的高產(chǎn)菌株EM15-15。

1.1.2 培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件[6]種子培養(yǎng)基：含淀粉、糊精、蛋白胨、葡萄糖、黃豆餅粉、NaCl、(NH4)2SO4、MgSO4·7H2O、KH2PO4、CaCO3和油，pH7.00。250 mL搖瓶裝種子培養(yǎng)基30 mL，28 ℃，200 r/min培養(yǎng)48～52 h。發(fā)酵培養(yǎng)基：含正丙醇、(NH4)2SO4、MgSO4·7H2O、CaCO3、淀粉、糊精、黃豆餅粉、棉籽餅粉、玉米漿、葡萄糖和油，pH7.00。250 mL搖瓶裝發(fā)酵培養(yǎng)基30 mL，接種量10%，28 ℃，220 r/min培養(yǎng)7 d。

1.1.3 主要試劑及原料 玉米漿購(gòu)自華北制藥康欣股份有限公司；(NH4)2SO4、MgSO4·7H2O、KH2PO4、糊精、蛋白陳和葡萄糖等，均為分析純；紅霉素對(duì)照品，中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，批號(hào):130307，含量:883 U/mg。

1.2 方法

1.2.1 發(fā)酵液化學(xué)效價(jià)檢測(cè)方法 硫酸水解法[7]，發(fā)酵液經(jīng)離心后，根據(jù)確定好的倍數(shù)吸取一定量的濾液，用0.35%碳酸鉀液稀釋。然后，取稀釋液20 mL于分液漏斗中，加入醋酸丁醋20 mL，振搖30 min，放置分層，棄去下層水液，于丁醋液中加入無(wú)水硫酸鈉1g左右(可酌量多加使丁醋液澄清)，振蕩至透明。準(zhǔn)確吸取其上層脫水液10 mL于另一干燥的分液漏斗中，精確加入鹽酸(0.1 mol/L)10 mL，振蕩30 min，放置分層，把下層鹽酸水液放入試管中，從中吸取5 mL放入另一試管中，加入硫酸(8 mol/L) 5 mL，搖勻，放入50 ℃水浴中，保溫30 min取出冷卻，于483 nm測(cè)定吸光度值，以紅霉素標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算發(fā)酵液紅霉素的化學(xué)效價(jià)。

1.2.2 Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 選取(NH4)2SO4、MgSO4·7H2O、KH2PO4、CaCO3、淀粉、糊精、黃豆餅粉、棉籽餅粉、玉米漿、葡萄糖和正丙醇11個(gè)因素，應(yīng)用Minitab 15進(jìn)行Plackett-Burman設(shè)計(jì)，從而篩選出影響紅霉素效價(jià)的主要因素。

1.2.3 最陡爬坡實(shí)驗(yàn)(steepest ascent design) 根據(jù)Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)結(jié)果中各顯著影響因素效應(yīng)的大小設(shè)定步長(zhǎng)及變化方向，以快速逼近最佳響應(yīng)區(qū)域。而其他因素的取值則根據(jù)各因素效應(yīng)的正負(fù)和大小確定，正效應(yīng)的因素均取較高值，負(fù)效應(yīng)的因素均取較低值。

1.2.4 響應(yīng)面法(response surface methodology) 依據(jù)Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)和最陡爬坡實(shí)驗(yàn)確定的實(shí)驗(yàn)因素與水平，采用Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行4因素3水平的響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)。每個(gè)因素取三個(gè)水平，以(-1，0，1)編碼，根據(jù)相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)表進(jìn)行實(shí)驗(yàn)后，對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析及多元回歸分析，方差分析及回歸方程的顯著性檢驗(yàn)采用F檢驗(yàn)，以P<0.05判定為顯著。多元回歸模型擬合度采用R-Sq表示，以R-Sq>0. 9判定為優(yōu)；擬合度失擬(Lack of Fit)以P>0. 05判定為失擬不顯著，說(shuō)明回歸模型與數(shù)據(jù)擬合較好。最后在一定的水平范圍內(nèi)求取各因素的最佳值。

2 結(jié)果與分析

2.1 紅霉素發(fā)酵效價(jià)主要氮源、碳源影響因子的確定 在前期單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上選用N=20的Placket-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，對(duì)淀粉(A)、糊精(B)、玉米漿(C)、棉籽餅粉(D)、黃豆餅粉(E)、葡萄糖(F)、(NH4)2SO4(G)、MgSO4·7H2O(H)、CaCO3(J)、油(K)和正丙醇(L)11個(gè)因素進(jìn)行了考察，每個(gè)因素取高(+)、低(-)兩水平，高水平約為低水平的1.25倍，響應(yīng)值為紅霉素的效價(jià)(Y)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表1，因素水平取值、效應(yīng)及顯著性分析見(jiàn)表2。

表1 N=20的Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Tab 1 N = 20 Plackett-Burman experimental design and results

表2 Plackett-Burman試驗(yàn)因素水平及其主效應(yīng)分析Tab 2 Plackett-Burman test factor level and its main effect analysis

由表2可知淀粉、糊精、黃豆餅粉、玉米漿發(fā)酵液中紅霉素的效價(jià)有顯著性影響，其中糊精和黃豆餅粉影響極顯著。選出具有顯著性影響的4個(gè)因素做最陡爬坡試驗(yàn)，這4個(gè)因素都有顯著負(fù)效應(yīng)，因此在以后的實(shí)驗(yàn)中應(yīng)減少加量。

2.2 最陡爬坡實(shí)驗(yàn) 接近最大響應(yīng)面區(qū)域，響應(yīng)面擬合方程只在考察的緊接鄰域里才充分近似真實(shí)情形，要先逼近最佳值區(qū)域后才能建立有效的響應(yīng)面擬合方程。根據(jù)Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)結(jié)果，確定不顯著因素的水平，表現(xiàn)為正效應(yīng)的因素取高水平，表現(xiàn)為負(fù)效應(yīng)的因素取低水平。顯著因素的變化步長(zhǎng)及方向的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果表明(表3)，第3組效價(jià)最高，因此以第3組的水平作為響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)的中心點(diǎn)。

表3 最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Tab 3 The steepest slope test design and results

2.3 Box-Behnken設(shè)計(jì)及分析結(jié)果 根據(jù)Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)和最陡爬坡實(shí)驗(yàn)得出淀粉52.0 g/L，糊精14.0 g/L，黃豆餅粉48.0 g/L，玉米漿15.0 g/L作為中心點(diǎn)，以紅霉素效價(jià)為響應(yīng)值(Y)，利用Minitab 15響應(yīng)面分析中的Box-Behnken設(shè)計(jì)，設(shè)計(jì)4因素3水平的實(shí)驗(yàn)，各因素水平見(jiàn)表4，Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表5。通過(guò)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多元回歸擬合，得到二次多項(xiàng)式方程：

Y=-306806+5167.81A+6777.17B-352.250E+19088.6C-44.3984A2-310.375B2-16.1719E2-495.250C2+52.6250AB+21.5000AE-152.625AC-23.6250BE+17.0000BC+69.9375CE

表4 因素水平編碼表Tab 4 Factor level coding table

表5 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Tab 5 Box-Behnken experimental design and results

通過(guò)Minitab 15軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)和模型進(jìn)行分析，采用置信度為95% ，結(jié)果見(jiàn)表6?？梢钥闯觯摱位貧w模型極為顯著(P=0.000)，失擬項(xiàng)不顯著(P=0.1731)，說(shuō)明模型與試驗(yàn)擬合良好，可以用于紅霉素效價(jià)的分析和預(yù)測(cè)。方程的決定系數(shù)R-Sq=94.04%，說(shuō)明模型可以解釋94.04%試驗(yàn)所得發(fā)酵效價(jià)的變化，進(jìn)一步說(shuō)明該模型擬合程度良好。

依據(jù)回歸方程，利用Minitab 15軟件繪出響應(yīng)曲面圖和等高線圖，結(jié)果見(jiàn)圖1和圖2。

表6 二次多項(xiàng)式的方差分析Tab 6 Variance analysis of quadratic polynomials

圖1 淀粉、糊精、黃豆餅粉和玉米漿對(duì)紅霉素效價(jià)交互影響的曲面圖Fig 1 Curve of interaction of starch, dextrin, soybean meal and corn steep liquor on erythromycin titers

圖2 淀粉、糊精、黃豆餅粉和玉米漿對(duì)紅霉素效價(jià)交互影響的等高線圖Fig 2 Contours of starch, dextrin, soybean meal and corn steep liquor on erythromycin titer interaction

等高線的形狀可以反映因素間交互作用的強(qiáng)弱大小，圓形表示交互作用不顯著，橢圓形表示交互作用顯著[8]。淀粉-糊精的交互作用、淀粉-黃豆餅粉的交互作用、淀粉-玉米漿的交互作用以及黃豆餅粉-玉米漿的交互作用的等高線均呈橢圓形，表明淀粉-糊精、淀粉-黃豆餅粉、淀粉-玉米漿以及黃豆餅粉-玉米漿的交互作用均對(duì)紅霉素的效價(jià)有顯著性影響。利用Minitab 15軟件中的響應(yīng)優(yōu)化器對(duì)試驗(yàn)?zāi)Ｐ瓦M(jìn)行分析，得到淀粉含量為52.3 g/L、糊精含量為14.0 g/L、黃豆餅粉含量為45.3 g/L和玉米漿含量為14.6 g/L時(shí)，紅霉素效價(jià)(Y)預(yù)測(cè)最大值為7734 U/mL。

2.4 響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果的驗(yàn)證 根據(jù)最優(yōu)化結(jié)果配制發(fā)酵培養(yǎng)基，分批次(3次)發(fā)酵，紅霉素發(fā)酵效價(jià)分別為7821、7709和7762 U/mL，均值7764 U/mL，與預(yù)測(cè)值7734 U/mL十分接近。同時(shí)，與原發(fā)酵培養(yǎng)基比較，紅霉素效價(jià)提高了12%。

3 討論與結(jié)論

在紅霉素的發(fā)酵生產(chǎn)中常采用的菌種為紅色糖多胞菌S.erythraea。1952年從具有不同抗生素活性的菌種中分離出S.erythraeaNRRL2338。起初該菌種的紅霉素產(chǎn)最僅為0.25～1.0 g/L。但在2005年有報(bào)道其產(chǎn)量已經(jīng)達(dá)到10～13 g/L[9]。在紅霉素產(chǎn)量提升的過(guò)程中，菌種選育和發(fā)酵工藝優(yōu)化起著重要角色。目前，傳統(tǒng)的紫外誘變、氯化鋰誘變、離子注入等方法仍被生產(chǎn)企業(yè)用來(lái)提高紅霉素產(chǎn)量[10-11]。工業(yè)生產(chǎn)菌株多為經(jīng)過(guò)多次誘變后的高產(chǎn)菌株，但“誘變疲勞”效應(yīng)使傳統(tǒng)誘變方法很難在提高產(chǎn)物產(chǎn)量方面再有較大突破。因此，代謝工程手段漸漸成為企業(yè)提高紅霉素產(chǎn)量的突破口，紅霉素發(fā)酵工藝優(yōu)化已作為企業(yè)研究的重中之重。

紅霉素發(fā)酵培養(yǎng)基的主要成份為淀粉和黃豆餅粉[12]。在紅霉素工業(yè)生產(chǎn)中，降低原料成本是提高企業(yè)效益的有效手段，所以在國(guó)內(nèi)出現(xiàn)了較多的采用廉價(jià)氮源替代昂貴氮源的報(bào)道。王曉磊等采用玉米粉水解物作為碳源在30噸發(fā)酵罐規(guī)模上使發(fā)酵單位提高了5.8%，綜合成本降低了26.0%[13]。張金國(guó)等采用廉價(jià)A粉和B粉替代淀粉、葡萄糖和黃豆餅粉后在10噸罐規(guī)模下產(chǎn)量提高了6.11%[14]。Zou等在初始培養(yǎng)基中添加玉米漿促進(jìn)了菌體的前期生長(zhǎng)，最終紅霉素效價(jià)提高了22.2%[15]。El-Enshasy等采用甘蔗糖蜜替代葡萄糖后結(jié)合補(bǔ)加正丙醇工藝使紅霉素產(chǎn)量提高了33.0%[16]。

研究采用響應(yīng)面法對(duì)紅霉素發(fā)酵培養(yǎng)基中氮源和碳源進(jìn)行了優(yōu)化。首先，用Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)法選出了對(duì)紅霉素效價(jià)有顯著性影響的4個(gè)因素，分別是淀粉、糊精、玉米漿和黃豆餅粉；然后用最陡爬坡試驗(yàn)逼近最佳響應(yīng)面區(qū)域；最后通過(guò)Factors=4，Run=27的Box-Behnken設(shè)計(jì)進(jìn)行優(yōu)化，得出紅霉素最佳發(fā)酵培養(yǎng)基配方：淀粉52.3 g/L、糊精14.0 g/L、黃豆餅粉45.3 g/L、玉米漿14.6 g/L、(NH4)2SO48.0 g/L、MgSO4·7H2O 1.0 g/L、CaCO35.4 g/L、棉籽餅粉 20.0 g/L、葡萄糖 20.0 g/L、正丙醇 10.0 mL/L、油 20 mL/L，與華承偉等[6]做的優(yōu)化結(jié)果基本一致。優(yōu)化后的配方經(jīng)過(guò)發(fā)酵之后測(cè)得紅霉素效價(jià)為7764 U/mL，比原配方提高了12%。

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