戴 青，韓寧寧，于麗娜，張 璐，徐 嫄，趙 暉

(中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081)

頭孢噻呋是美國法瑪西亞普強(qiáng)公司研制的動(dòng)物專用第3代頭孢類抗生素，主要用于豬細(xì)菌性呼吸道感染和雞的大腸埃希菌、沙門氏菌感染，其抗菌活性強(qiáng)，毒副作用小，殘留低，近年來在世界各地應(yīng)用非常廣泛[1-2]。目前，國內(nèi)已上市的頭孢噻呋制劑有頭孢噻呋鈉粉針劑和鹽酸頭孢噻呋注射液等[3]。鑒于抗生素品種含量通常以活性成分計(jì)，其含量限度的確定，應(yīng)考慮分子中含酸根離子或鹽的量等因素。由于鹽酸頭孢噻呋比頭孢噻呋鈉更穩(wěn)定，在進(jìn)行頭孢噻呋國家對照品的研制時(shí)，通常采用鹽酸頭孢噻呋作為對照品原料，準(zhǔn)確測定鹽酸頭孢噻呋中氯離子的含量，確定成鹽比例，可佐證針對藥物部分的含量測定結(jié)果，從而確保對照品賦值準(zhǔn)確。

離子色譜法具有靈敏度高、選擇性好、前處理簡單、試樣用量少等優(yōu)點(diǎn)，目前已成為分析化學(xué)領(lǐng)域中發(fā)展最快的分析方法之一，已被廣泛地用于無機(jī)陰、陽離子和有機(jī)離子的測定[4-5]。研究首次建立了鹽酸頭孢噻呋中氯離子的抑制電導(dǎo)離子色譜檢測方法，進(jìn)而確定其成鹽比例，對于頭孢噻呋對照品的標(biāo)定賦值以及進(jìn)一步完善鹽酸頭孢噻呋質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、提高藥品質(zhì)量穩(wěn)定性具有重要意義。

1 儀器與試藥

Dionex Aquion離子色譜儀和Chromeleon 7軟件(美國Thermo公司)；Dionex AERS-4mm抑制器(美國Thermo公司)；Milli-Q超純水系統(tǒng)(美國Millipore公司)；Mettler Toledo XS 205型電子分析天平(瑞士Mettler公司)。

鹽酸頭孢噻呋(齊魯晟華制藥有限公司，批號(hào)：704067203111)；Cl-標(biāo)準(zhǔn)溶液(中國計(jì)量科學(xué)研究院，1000 μg/mL，批號(hào)：17032)；氫氧化鉀淋洗液(Dionex EGC Ⅲ KOH，序列號(hào)：161240299015)；亞硝酸鈉、氟化鈉、硝酸鉀、硫酸鉀、磷酸氫二鈉、溴化鉀、溴酸鉀(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，均為分析純)；水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱：Dionex IonPac AS19(250 mm×4 mm，5 μm)，預(yù)柱：Dionex IonPac AG19(50 mm×4 mm，5 μm)，流速：1.0 mL/min，柱溫：30 ℃，檢測池溫度：35 ℃，進(jìn)樣量：25 μL，檢測器：電導(dǎo)檢測器，抑制電流：112 mA，以氫氧化鉀溶液為淋洗液按表1梯度洗脫。

表1 梯度淋洗條件Tab 1 Gradient elution conditions

2.2 溶液的制備

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液 精密量取氯離子標(biāo)準(zhǔn)溶液(1000 μg/mL)10 mL，置100 mL量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，作為標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。分別精密量取標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液適量，加水稀釋制成含氯離子分別為0.5、1、2、5、10、20 μg/mL的溶液，作為氯離子標(biāo)準(zhǔn)工作液。

2.2.2 供試品溶液 取鹽酸頭孢噻呋樣品約25 mg，精密稱定，置50 mL量瓶中，加4 mmol/L氫氧化鈉溶液溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密量取5 mL，置50 mL量瓶中，用4 mmol/L氫氧化鈉溶液稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液。

2.3 專屬性試驗(yàn) 分別取亞硝酸鈉、氟化鈉、硝酸鉀、硫酸鉀、磷酸氫二鈉、溴化鉀、溴酸鉀適量，精密稱定，加水溶解并稀釋制成濃度各約100 μg/mL的混合離子溶液，精密量取1 mL，置10 mL量瓶中，加“2.2.1”項(xiàng)下標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液1 mL，用水稀釋至刻度，作為專屬性溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測定。在該色譜條件下，其他離子能與氯離子較好分離，該方法專屬性良好，見圖1。

2.4 線性關(guān)系考察 取氯離子標(biāo)準(zhǔn)工作液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測定。結(jié)果表明：在0.5～20 μg/mL濃度范圍內(nèi)，氯離子溶液的峰面積與其濃度呈良好的線性關(guān)系，線性方程為y=0.2917x-0.0177，r2=0.9999。

按F-、BrO3-、Cl-、NO2-、SO42-、Br-、NO3-和PO43-順序出峰

2.5 檢出限與定量限 取氯離子標(biāo)準(zhǔn)工作液適量，用水逐步稀釋至一定濃度后測定，氯離子定量限為0.8 μg/mL(S/N>10)，檢出限為0.2 μg/mL(S/N>3)。

2.6 精密度試驗(yàn) 取濃度為10 μg/mL的氯離子標(biāo)準(zhǔn)工作液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)重復(fù)進(jìn)樣6次，計(jì)算氯離子峰面積的RSD為1.0%。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取鹽酸頭孢噻呋供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測定，計(jì)算氯離子的含量，平均含量為5.92%，RSD為0.5%。氯離子標(biāo)準(zhǔn)工作液及鹽酸頭孢噻呋供試品溶液色譜圖見圖2～圖3。

圖2 氯離子標(biāo)準(zhǔn)工作液色譜圖(5 μg/mL)Fig 2 Chromatogram of standard working solution of chloride ion(5 μg/mL)

圖3 鹽酸頭孢噻呋供試品溶液色譜圖Fig 3 Chromatogram of ceftiofur hydrochloride test solution

2.8 回收率試驗(yàn) 采用加樣回收率試驗(yàn)測定準(zhǔn)確度。取已知氯離子含量為5.92%的鹽酸頭孢噻呋約25 mg，精密稱定，置50 mL量瓶中，加4 mmol/L氫氧化鈉溶液溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密量取5 mL，置50 mL量瓶中，分別精密加入氯離子標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液(100 μg/mL)1、1.5和3 mL，用4 mmol/L氫氧化鈉溶液稀釋至刻度，搖勻，制成低、中、高三個(gè)濃度的回收率試驗(yàn)溶液。每個(gè)濃度平行操作3次，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測定，采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法，計(jì)算回收率，結(jié)果見表2。

表2 氯離子回收率Tab 2 Recovery rate of chloride ion

2.9 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取鹽酸頭孢噻呋樣品約25 mg，精密稱定，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，室溫靜置，分別于0、1、2、4、8、16和24 h按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定，計(jì)算氯離子峰面積的RSD為0.8%(n=7)。

2.10 樣品測定 取供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測定，采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法，計(jì)算氯離子含量，再折算成鹽酸的含量(鹽酸含量=氯離子含量×36.5/35.5)，得到氯離子含量為5.92%，鹽酸含量為6.09%。

3 討論與小結(jié)

有些成鹽藥物分子中成鹽位點(diǎn)不唯一，可能以多種比例成鹽，對于這類成鹽藥物的對照品標(biāo)化，確定成鹽比對于對照品賦值十分重要，尤其是當(dāng)多種定值方式給出的含量差異較大時(shí)，更需要去驗(yàn)證成鹽比例[6-7]。根據(jù)研究結(jié)果，若鹽酸頭孢噻呋的成鹽比例為1∶1，則鹽酸的理論含量為6.51%，若其成鹽比例為1∶2，則鹽酸的理論含量為12.23%，若其成鹽比例為1∶3，則鹽酸的理論含量為17.28%，而樣品實(shí)測值為6.09%，由此可知，其成鹽比例應(yīng)該為1∶1，以活性成分頭孢噻呋計(jì)，其理論含量為93.49%。若將鹽酸頭孢噻呋的成鹽率控制在理論值的90.0%～110.0%，則鹽酸的含量限度應(yīng)為5.86%～7.16%。

離子色譜法對于固體樣品的前處理比較簡單，最常用的方法是用去離子水或氫氧化鈉溶液直接溶解配制樣品溶液[8]。試驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)樣品在超純水中幾乎不溶，因此試驗(yàn)采用濃度較低的氫氧化鈉溶液作為溶劑，溶解樣品時(shí)宜邊超聲邊振搖，使其溶解完全?？紤]到樣品中可能有保留強(qiáng)度不同的多種離子存在，等度淋洗會(huì)出現(xiàn)多種組分共淋洗或強(qiáng)保留組分無法洗脫等現(xiàn)象[9]，因此試驗(yàn)采用梯度洗脫，待氯離子出峰后使用高濃度的KOH淋洗液沖洗色譜柱，將吸附在色譜柱上的強(qiáng)保留性物質(zhì)洗脫下來，從而得到更好的效果。

離子色譜中無機(jī)陰離子的保留行為受到離子價(jià)態(tài)、離子半徑及離子的極化程度等多種因素的影響[10]。研究開發(fā)的方法準(zhǔn)確、靈敏、專屬性好，在本文所述的試驗(yàn)條件下，可實(shí)現(xiàn)Cl-與F-、BrO3-、NO2-、SO42-、Br-、NO3-、PO43-等常見陰離子的有效分離，該色譜條件可以適用于鹽酸頭孢噻呋中Cl-的測定，以控制成鹽比例，為頭孢噻呋對照品的標(biāo)定賦值提供了技術(shù)參考，為鹽酸頭孢噻呋質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的完善提供了研究基礎(chǔ)。

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