高 芊，劉俊渤，唐珊珊，孫 琳，王光宇，靳瑞發(fā)

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，吉林，長春，130118; 2.赤峰學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院，內(nèi)蒙古，赤峰，024000)

氯霉素(Chloramphenicol，CAP)是一種抑菌效果良好的廣譜抗生素類藥物，由于會(huì)引起人類的再生不良性貧血等疾病，我國農(nóng)業(yè)部于2002年禁止使用該藥[1]，規(guī)定在所有食品動(dòng)物的可食組織中不可檢出CAP。但由于CAP抗菌性好且價(jià)格低廉，養(yǎng)殖業(yè)上仍存在違法使用CAP。為有效監(jiān)控CAP的違禁使用，合成一種能夠準(zhǔn)確地富集和分離殘留于動(dòng)物源性食品中CAP的新型萃取功能材料是非常必要的。

分子印跡技術(shù)也稱分子模板技術(shù)，是制備空間結(jié)構(gòu)和結(jié)合位點(diǎn)與印跡分子相匹配的分子印跡聚合物(Molecularly imprinted polymers，MIPs)的一門分離技術(shù)。目前該技術(shù)廣泛應(yīng)用于化學(xué)傳感器、模擬酶催化及藥物控釋等[2-4]領(lǐng)域。為提高M(jìn)IPs在復(fù)雜基質(zhì)動(dòng)物源性食品中對(duì)待測(cè)物的特異吸附性，近年來分子模擬已廣泛應(yīng)用于MIPs的設(shè)計(jì)[5-8]，為MIPs的制備提供了理論指導(dǎo)。

目前，國內(nèi)外有關(guān)CAP分子印跡聚合物(CAP-MIPs)的研究主要以甲基丙烯酸(MAA)及丙烯酰胺(AM)為功能單體[9-10]，而以4-乙烯基吡啶(4-Vpy)為功能單體制備CAP-MIPs的相關(guān)研究極少，且未見在分子水平上構(gòu)建空間模型用以研究CAP與4-Vpy的相互作用及CAP印跡體系中交聯(lián)劑優(yōu)化的研究報(bào)道。因此，本研究以CAP為印跡分子，4-Vpy為功能單體，分別以乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA)、季戊四醇三丙烯酸酯(PETA)和三羥甲基丙烷三甲基丙烯酸酯(TRIM)為交聯(lián)劑，采用量子化學(xué)密度泛函理論(DFT)的ωB97XD方法，從理論上探討CAP與4-Vpy復(fù)合物的構(gòu)型、印跡作用機(jī)理等，優(yōu)化CAP與4-Vpy摩爾反應(yīng)比例及交聯(lián)劑，同時(shí)以計(jì)算結(jié)果為指導(dǎo)，采用沉淀聚合法合成CAP-MIPs，并對(duì)CAP-MIPs的吸附性等性能進(jìn)行了研究與表征。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器 CAP(標(biāo)準(zhǔn)品，上海阿拉丁試劑有限公司)；4-Vpy(化學(xué)純，阿法埃莎化學(xué)有限公司)；EGDMA、PETA、TRIM(分析純，上海阿拉丁試劑有限公司)；偶氮二異丁腈(ABIN)、乙腈(分析純，天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司)，甲醇、乙酸(分析純，北京化工)。

DZF-6062真空干燥箱(上海恒科儀器有限公司)；TU-1950雙光速紫外分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限公司)；KQ5200DE超聲波清洗儀(昆山超生儀器有限公司)，SHZ-B水浴恒溫振蕩器(上海博迅實(shí)業(yè)有限公司)，TDL-60B臺(tái)式離心機(jī)(上海安亭科技儀器廠)。

1.2 理論計(jì)算部分 借助Gaussian 09軟件[11]構(gòu)建CAP分子模型，分別使用B3LYP，LC-WPBE，PBE1PBE和ωB97XD四種DFT方法優(yōu)化CAP印跡分子，收斂采用默認(rèn)值。選取最接近實(shí)驗(yàn)值的理論方法作為本研究的計(jì)算方法。采用自洽反應(yīng)場(chǎng)中的Tomasi極化連續(xù)介質(zhì)模型模擬CAP與4-Vpy、CAP與交聯(lián)劑、4-Vpy與交聯(lián)劑間的相互作用。計(jì)算結(jié)合能時(shí)，基組迭加誤差(Basis set superposition error，BSSE)采用Counterpoise(CP)方法消除[12]，印跡分子CAP與交聯(lián)劑摩爾比例為1∶1時(shí)，結(jié)合能(ΔE)計(jì)算公式如下：

ΔE=EC-ET-ECL

(1)

式中，EC為CP方法校正后印跡分子CAP與交聯(lián)劑形成復(fù)合物的總能量；ET為印跡分子CAP的能量；ECL為交聯(lián)劑的能量。

功能單體4-Vpy與交聯(lián)劑摩爾比例為1∶1時(shí)，結(jié)合能計(jì)算公式如下：

ΔE=EC-EF-ECL

(2)

式中，EC為CP方法校正后功能單體4-Vpy與交聯(lián)劑形成復(fù)合物的總能量；EF為功能單體4-Vpy的能量；ECL為交聯(lián)劑的能量。

1.3 氯霉素分子印跡聚合物與非印跡聚合物的制備 稱0.1 mmol CAP(0.0323g)溶于60 mL乙腈中，按一定摩爾比加入4-Vpy，超聲溶解后靜置24 h；加入交聯(lián)劑與引發(fā)劑，超聲30 min，通入氮?dú)? min，除去體系中的氧氣；密封后，放入SHA-C恒溫水浴鍋中于60 ℃熱聚合24 h，將聚合物放于真空干燥箱中干燥24 h得到白色的聚合物沉淀；用冰乙酸/甲醇(1∶9，V/V)溶液于索氏提取器中洗脫印跡分子CAP，在用甲醇溶液洗脫至上清液中檢不出CAP為止；蒸干至恒重，得到CAP-MIPs微球。NIPs的制備不加CAP外，其余步驟同上。

1.4 聚合物的吸附性實(shí)驗(yàn) 準(zhǔn)確稱取20.0 mg的CAP-MIPs(NIPs)于50 mL錐形瓶中，加入100mg/L CAP甲醇溶液10 mL，超聲后放入振蕩器中室溫24 h，取上清液離心后用0.22微米的濾頭過濾，稀釋至一定濃度，用紫外分光光度計(jì)測(cè)量溶液吸光度，根據(jù)吸附前后濃度變化計(jì)算CAP-MIPs的吸附量Q(mg/g)：

Q=(C0-C)V/W

(3)

式中，其中Q為聚合物對(duì)CAP的吸附量(mg/g)，C0和C分別為CAP吸附前后的濃度(mg/L)，V為CAP甲醇溶液體積(ml)，W為CAP-MIPs(或NIPs)的質(zhì)量(mg)。

1.5 掃描電鏡(SEM) 取少量的CAP-MIPs或NIPs懸浮液，用甲醇稀釋后超聲，使CAP-MIPs或NIPs微球分散均勻，取少量混合液均勻涂抹到硅片上自然晾干，噴金，采用JSM-5600掃描電鏡觀測(cè)CAP-MIPs與NIPs的粒徑大小及形貌。

2 結(jié)果與討論

2.1 計(jì)算方法 表1列出了B3LYP、LC-WPBE、PBEIPBE和ωB97XD四種DFT方法對(duì)CAP分子(圖1)幾何結(jié)構(gòu)的優(yōu)化數(shù)據(jù)。由表1可知，四種方法計(jì)算所得的理論結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)與實(shí)驗(yàn)晶體數(shù)據(jù)相差不大，且均在誤差允許范圍內(nèi)，說明DFT在幾何結(jié)構(gòu)優(yōu)化計(jì)算方面具有優(yōu)勢(shì)。由表1還可知，與其他三種方法相比，ωB97XD[13]方法計(jì)算得到的CAP結(jié)構(gòu)參數(shù)更接近其實(shí)驗(yàn)值[14]。如C20-O7其鍵長實(shí)驗(yàn)值為0.1442 nm，B3LYP、LC-WPBE、PBEIPBE和ωB97XD方法理論鍵長為0.1431、0.1418、0.1419、0.1434 nm，與實(shí)驗(yàn)值的偏差為0.0011、0.0024、0.0023、0.0008 nm。C19-C18-O6其鍵角實(shí)驗(yàn)值為119.94°，四種方法與實(shí)驗(yàn)值偏差分別為1.60°、0.88°、1.39°、0.70°，顯然，相比于其他三種方法，ωB97XD方法優(yōu)化計(jì)算得到的鍵長與鍵角參數(shù)與晶體數(shù)據(jù)值更接近。因此研究選取ωB97XD/6-31G(d,p)方法優(yōu)化CAP、4-Vpy及其復(fù)合物幾何構(gòu)型。

圖1 氯霉素的分子結(jié)構(gòu)式Fig 1 Molecular structure of CAP

2.2 印跡分子與功能單體反應(yīng)活性位點(diǎn)的確定 采用ωB97XD/6-31G(d,p)方法模擬計(jì)算印跡分子CAP與功能單體4-Vpy的幾何構(gòu)型并計(jì)算原子的自然鍵軌道電荷(Natural bond orbital，NBO)，預(yù)測(cè)其印跡作用活性位點(diǎn)，結(jié)果見圖2。由圖2可知：從NBO電荷布局分析來看，CAP負(fù)電荷較多的原子主要是對(duì)硝基苯基、丙二醇、二氯乙酰胺基上的O原子與N原子，分別為O3、O4、O5、O6、O7、N9；正電荷較多的原子主要是丙二醇、二氯乙酰胺基上的H原子，如H21、H22、H23、H29。考慮與CAP印跡分子活性作用位點(diǎn)相互作用的主要是4-Vpy上的吡啶基，功能單體4-Vpy主要活性作用位點(diǎn)為H6、H9、N10。

表1 采用B3LYP，LC-WPBE，PBEIPBE 和 ωB97XD方法計(jì)算CAP的結(jié)構(gòu)參數(shù)和實(shí)驗(yàn)值Tab 1 Bond angles of CAP calculated at the B3LYP, LC-WPBE, PBEIPBE and ωB97XD levels and available experimental data

圖2 CAP(A)與4-Vpy(B)的NBO電荷分布Fig 2 NBO chanrges of CAP (A) and 4-Vpy(B)

2.3 CAP-MIPs 復(fù)合物印跡反應(yīng)摩爾比例的優(yōu)化 印跡分子CAP與功能單體4-Vpy反應(yīng)比例合適時(shí)，相互作用較強(qiáng)，這種較強(qiáng)的相互作用可使制備的CAP-MIPs具有更好的穩(wěn)定性與特異識(shí)別性。以NBO電荷布局為依據(jù)，借助Gaussian 09軟件構(gòu)建分子模型模擬印跡分子CAP與功能單體4-Vpy在不同印跡摩爾反應(yīng)比例下的復(fù)合物穩(wěn)定構(gòu)型及其氫鍵鍵合數(shù)據(jù)見圖3。計(jì)算模擬以相互作用位點(diǎn)越多，復(fù)合物越穩(wěn)定的原則，選取最穩(wěn)定的復(fù)合物構(gòu)型作為研究對(duì)象。

從圖3可以看出，隨著CAP與4-Vpy摩爾反應(yīng)比例增加，分子間作用位點(diǎn)氫鍵數(shù)目也在增加，即反應(yīng)比例為1∶1、1∶2、1∶3、1∶4時(shí)，CAP與4-Vpy復(fù)合物氫鍵數(shù)目分別為2、5、7、9。這說明隨著印跡分子與功能單體的摩爾反應(yīng)比例增大，穩(wěn)定復(fù)合物中氫鍵數(shù)目增多，相互作用增強(qiáng)，形成的復(fù)合物也更穩(wěn)定。當(dāng)反應(yīng)比例增加至1∶5時(shí)，功能單體間的相互作用，阻礙了印跡分子與功能單體間氫鍵的相互作用，最終導(dǎo)致反應(yīng)比例為1∶5時(shí)的復(fù)合物氫鍵作用點(diǎn)低于1∶4，穩(wěn)定性亦隨之降低。因此，反應(yīng)比例為1∶4時(shí)的印跡分子與功能單體形成的復(fù)合物，見圖3(D)。穩(wěn)定性最好，所有鍵的鍵長均在氫鍵范疇之內(nèi)[15-16]。

圖3 CAP與4-Vpy在不同摩爾反應(yīng)比例下的復(fù)合物構(gòu)型Fig 3 The complex configurations of CAP and 4-Vpy at different molar ratios

表2 CAP與4-Vpy在不同摩爾反應(yīng)比例下結(jié)合能(ΔE)(kJ/mol)Tab 2 the Binding energies (ΔE) of CAP and 4-Vpy in different imprinted molar ratio (kJ/mol)

2.4 交聯(lián)劑的優(yōu)化 MIPs制備過程中，交聯(lián)劑的作用是使印跡分子與功能單體聚合形成高度交聯(lián)、剛性的聚合物。交聯(lián)劑控制著聚合物的形態(tài)以及聚合物的物理化學(xué)性質(zhì)，同時(shí)影響聚合物的識(shí)別性能。為了使制備的MIPs既具有一定的剛性以維持孔穴，又有一定的柔韌性以便與印跡分子再結(jié)合，所選的交聯(lián)劑與印跡分子的結(jié)合能應(yīng)高于其與功能單體的結(jié)合能。EGDMA、PETA、TRIM三種交聯(lián)劑與印跡分子CAP、功能單體4-Vpy的結(jié)合能見圖4。由圖4可知，所有的交聯(lián)劑與印跡分子CAP的結(jié)合能不僅都高于其與功能單體4-Vpy的結(jié)合能，且高于印跡分子與功能單體的結(jié)合能-58.26 kJ/mol(表2)，說明三種交聯(lián)劑均適合作為CAP-MIPs的交聯(lián)劑。但是由于PETA與印跡分子CAP結(jié)合能最高，與功能單體4-Vpy的結(jié)合能最低。因此，PETA更適合作為CAP-MIPs的交聯(lián)劑。

2.5 聚合物的吸附性 在333 K乙腈溶劑中，分別以EGDMA、PETA及TRIM為交聯(lián)劑制備CAP與4-Vpy最佳印跡摩爾比例(1∶4)MIPs與NIPs，并測(cè)定其吸附性。由圖5可知，以PETA為交聯(lián)劑制備的CAP-MIPs對(duì)CAP的平衡吸附量最高，其次為TRIM、EGDMA。這說明PETA比其它交聯(lián)劑更適合制備CAP-MIPs，也說明了適合的交聯(lián)劑有助提高CAP-MIPs的印跡效果。同時(shí)，該實(shí)驗(yàn)結(jié)果與上述理論計(jì)算結(jié)果一致，再一次證明理論計(jì)算的準(zhǔn)確性。

在333 K乙腈溶劑中，以PETA為交聯(lián)劑制備CAP與4-Vpy在1∶1～1∶5摩爾反應(yīng)比例下的MIPs和NIPs，并測(cè)其吸附性。由圖6可知，隨著印跡摩爾比例的遞增，聚合物的平衡吸附量在逐漸增加。當(dāng)反應(yīng)比例為1∶5時(shí)，其吸附性略有降低。這說明CAP與4-Vpy的最佳反應(yīng)比例為1∶4，與上述計(jì)算結(jié)果一致。此外，從圖中還可以看出所有對(duì)應(yīng)反應(yīng)比例下MIPs的平衡吸附量明顯高于NIPs，說明印跡微球存在與CAP分子空間結(jié)構(gòu)相互匹配的孔穴，對(duì)底物的選擇識(shí)別起了關(guān)鍵作用。

為探討以4-Vpy為功能單體制備的CAP-MIPs和NIPs微球形貌、粒徑大小與分布范圍，采用掃描電子顯微鏡對(duì)其進(jìn)行了表征(圖7)。由圖7可知在333 K乙腈溶劑中制備的CAP-MIPs和NIPs形態(tài)比較均一，都近似球狀，且分散性良好。借助Nano Measurer 1.2軟件對(duì)聚合物微球進(jìn)行粒徑分布分析，結(jié)果表明CAP-MIPs與NIPs粒徑分別在180～370 nm(平均粒徑285 nm)與130～350 nm(平均粒徑224 nm)范圍內(nèi)，CAP-MIPs的粒徑略大，這可能是由于CAP-MIPs中模板分子的存在占有一定的空間體積，從而表現(xiàn)為粒徑更大。

在最佳實(shí)驗(yàn)條件下，采用Scatchard方程進(jìn)一步研究了以4-Vpy為功能單體，PETA為交聯(lián)劑制備的CAP-MIPs的吸附性能。Scatchard公式如下：

圖4 CAP和交聯(lián)劑(CL)與4-Vpy和交聯(lián)劑(CL)的結(jié)合能(ΔE)Fig 4 Binding energies (ΔEB) of CAP and cross-linking agents(CL) as well as 4-Vpy and cross-linking agents(CL)

圖5 不同交聯(lián)劑制備的CAP-MIPs與NIPs的吸附量Fig 5 Equilibrium adsorption amount of MIPs and NIPs synthesized with different cross-linking agents

圖6 不同摩爾反應(yīng)比例下的CAP-MIPs與NIPs的吸附量Fig 6 Equilibrium adsorption amount of CAP-MIPs and NIPs in different molar rations

圖7 CAP-MIPs與NIPs的掃描電鏡與粒徑分布圖Fig 7 SEM photographs and particle size distributions of CAP-MIPs and NIPs

式中，Q是平衡時(shí)吸附到聚合物上的CAP的量(mg/g)；[CAP]是平衡時(shí)溶液中剩余的CAP的濃度(mg/L)；Kd是解離常數(shù)(mg/L)；Qmax是聚合物的最大表觀吸附量(mg/g)。

以Q/C對(duì)Q作圖，得到一條線性相關(guān)的Scatchard直線，見圖8。由圖8知：

Q/C=0.0621-8.3955×10-4Q(5)

由直線斜率與截距求得：CAP-MIPs的解離常數(shù)(Kd)和最大表觀吸附量(Qmax)分別為1191 mg/L和73.97 mg/g。

圖8 CAP-MIPs的Scatchard曲線Fig 8 Scatchard plot of CAP-MIPs

3 結(jié) 論

采用DFT的ωB97XD/6-31G(d,p)方法模擬研究了CAP印跡分子與4-Vpy功能單體復(fù)合物的構(gòu)型及印跡作用機(jī)理，優(yōu)化了摩爾反應(yīng)比例和交聯(lián)劑。理論與實(shí)驗(yàn)結(jié)果均表明：CAP與4-Vpy的最佳摩爾反應(yīng)比例為1∶4，以PETA作為交聯(lián)劑制備的CAP-MIPs具有相對(duì)較大的吸附量。Scatchard分析方程表明：在最佳印跡條件下制備的CAP-MIPs對(duì)CAP表現(xiàn)出較高的吸附能力，最大表觀吸附量為73.97 mg/g。本研究為CAP-MIPs應(yīng)用于復(fù)雜基質(zhì)食品中CAP殘留的分離和檢測(cè)提供了一定的理論與實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

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