王 博，閆展燕，孔令聰，賈博巖，魏 星，劉樹(shù)明，馬紅霞,2*

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,長(zhǎng)春 130118; 2.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物生產(chǎn)及產(chǎn)品質(zhì)量安全教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,長(zhǎng)春130118)

殺鮭氣單胞菌(A.salmonida)是氣單胞菌科氣單胞菌屬的一員，呈全球性分布，廣泛存在于淡水、污水和土壤中,宿主范圍較廣。該菌屬條件性致病菌，可經(jīng)皮膚、鰓、口及血液等途徑傳染，多引起水生動(dòng)物包括鮭鱒魚(yú)類和非鮭科魚(yú)類發(fā)病[1-4]，給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。1984 年Emmerich和Weibel首次從患病溪鱒中分離到該病原菌[5]，近年來(lái)相關(guān)研究顯示，其宿主范圍正逐步擴(kuò)大，除導(dǎo)致水生生物發(fā)生癤瘡病或潰瘍病等[6]，還可引起人畜食物中毒，同時(shí)，隨著臨床抗生素不合理使用導(dǎo)致細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性及耐藥菌株在不同種群間的傳播，給人畜健康和食品安全問(wèn)題造成巨大威脅[6-8]。2016年夏季吉林省某羊場(chǎng)飼養(yǎng)的山羊陸續(xù)產(chǎn)生體溫升高，呼吸困難等癥狀，最終相繼死亡。本研究對(duì)其送檢的病羊肺臟組織進(jìn)行病原微生物的分離培養(yǎng)，結(jié)合分子生物學(xué)鑒定方法確定分離菌株為多重耐藥的殺鮭氣單胞菌，并通過(guò)致病性實(shí)驗(yàn)和藥物敏感性檢測(cè)確定其致病性及耐藥性，以期為臨床疾病的防制提供科學(xué)的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病料來(lái)源 采自吉林省某羊場(chǎng)患有呼吸系統(tǒng)疾病病羊的肺臟組織。

1.2 試劑與培養(yǎng)基 Taq DNA聚合酶、10×Buffer、dNTPs、DL2000 DNA Marker、pMD18-T載體均購(gòu)自Takara公司；DNA抽提試劑盒、膠回收試劑盒、LB培養(yǎng)基均購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司；BHI平板(腦心浸出液瓊脂)和腦心浸出液肉湯購(gòu)自賽奧克生物公司；多黏菌素B、強(qiáng)力霉素、鏈霉素、環(huán)丙沙星、氟苯尼考、頭孢噻肟等藥品購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所和索萊寶生物科技有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 20 ～ 25 g Balb/c小鼠90只，雌雄各半，購(gòu)自吉林大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.4 山羊肺臟的病理組織學(xué)檢查 對(duì)采集到的病羊肺臟組織進(jìn)行初步的病理學(xué)變化觀察，并取病變嚴(yán)重部位用10%的甲醛溶液固定，然后將固定好的組織修整為大小1 cm2的正方體塊，經(jīng)過(guò)對(duì)組織洗滌、脫水、透明、浸蠟、包埋、切片、H.E染色和封片等一系列處理，在顯微鏡下進(jìn)行病理組織學(xué)觀察。染色過(guò)程參考Fischer等[9]的方法。

1.5 細(xì)菌的分離培養(yǎng) 無(wú)菌操作下，取患病山羊肺臟組織劃線接種于BHI平板上，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h。挑取形態(tài)大小不同的單一菌落反復(fù)劃線純化培養(yǎng)，觀察記錄菌落的形態(tài)、顏色、大小等特征。純化后的菌液于4 ℃保存待用。

1.6 小鼠致病性試驗(yàn) 菌液制備：將上述純化后分離菌分別接種于BHI固體培養(yǎng)基，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，挑取單個(gè)菌落接種于5 mL LB液體培養(yǎng)基，置于恒溫?fù)u床中37 ℃，150 r/min培養(yǎng)至菌液濃度為0.5麥?zhǔn)媳葷岫取?dòng)物試驗(yàn)：Balb/c小鼠，隨機(jī)分組，每組10只，實(shí)驗(yàn)組小鼠腹腔注射上述培養(yǎng)菌液0.02 mL/g，對(duì)照組腹腔注射相同劑量的LB液體培養(yǎng)基，隔離飼養(yǎng)，隨時(shí)觀察小鼠的精神狀態(tài)并記錄。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.7 小鼠肺臟的病理組織學(xué)觀察 無(wú)菌采取試驗(yàn)組死亡小鼠和對(duì)照組小鼠的肺臟組織進(jìn)行H.E染色切片制備及病理組織學(xué)檢查。

1.8 分離菌株16SrDNA特異性核酸片段的擴(kuò)增 使用生工生物工程有限公司的細(xì)菌基因組DNA快速抽提試劑盒提取分離致病菌基因組，以提取的基因組作為模板，采用16SrDNA通用引物(上游引物：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG- 3′；下游引物：5′-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′)對(duì)分離菌株進(jìn)行16SrDNA特異性核酸片段的PCR擴(kuò)增。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

PCR反應(yīng)體系25 μL：DNA模板4 μL，dNTP 2 μL，10×Buffer 2.5 μL，Ex Taq DNA聚含酶0.3 μL，上下游引物各0.5 μL，dd H2O補(bǔ)至25 μL。PCR擴(kuò)增條件：95 ℃-5 min；95 ℃-45 s，50 ℃-45 s，72 ℃-1 min 45 s，32個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。

PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，對(duì)目的條帶進(jìn)行回收純化，純化產(chǎn)物與pMD18-T克隆載體連接，克隆至大腸桿菌 DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，提取質(zhì)粒進(jìn)行 PCR 鑒定。陽(yáng)性克隆質(zhì)粒送至生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行基因序列測(cè)定。

1.9 系統(tǒng)進(jìn)化分析 將分離致病菌16SrDNA基因序列與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中的相關(guān)核酸序列進(jìn)行Blast比對(duì)分析，并應(yīng)用MEGA6.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

1.10 藥物敏感性試驗(yàn) 選取慶大霉素、丁胺卡那霉素、氟苯尼考、頭孢噻肟、環(huán)丙沙星、氧氟沙星等19種獸醫(yī)臨床常用的抗菌藥物，采用平皿二倍稀釋法測(cè)定分離致病菌株對(duì)臨床常用藥物的體外敏感性。藥敏試驗(yàn)結(jié)果參照美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì)(CLSI2015)標(biāo)準(zhǔn)判定敏感率、中介率、耐藥率。

2 結(jié)果與分析

2.1 病羊肺臟組織的病理學(xué)檢查 對(duì)患病山羊的肺臟組織進(jìn)行病理學(xué)觀察，可見(jiàn)病變肺臟肺泡輪廓界限不明顯，肺間質(zhì)增寬，細(xì)支氣管壁脫落和肺水腫的變化(圖1 A)，并且伴有巨噬細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)的現(xiàn)象(圖1 B)，而健康羊肺組織無(wú)病變(圖1 C)。

2.2 細(xì)菌的分離培養(yǎng) 在超凈工作臺(tái)中，取患病山羊肺臟組織樣品劃線接種于BHI平板上，37 ℃恒溫培養(yǎng)后，可見(jiàn)圓形略微凸起、邊緣整齊、光滑、半透明、較濕潤(rùn)的中等大小微白色菌落。

2.3 小鼠致病性試驗(yàn)結(jié)果 實(shí)驗(yàn)組小白鼠在接種菌液6 h后其中一組出現(xiàn)眼瞼腫脹，眼分泌物增多并伴有輕微出血的現(xiàn)象，精神萎靡，表現(xiàn)為對(duì)外界刺激反應(yīng)遲鈍，不愿活動(dòng)。12 h后4只小白鼠死亡，36 h后10只小白鼠全部死亡。而對(duì)照組小白鼠完全正常，無(wú)任何異狀。剖檢實(shí)驗(yàn)組死亡小白鼠可見(jiàn)明顯的肺臟出血，且從病死小白鼠肺臟重新分離得到上述致病菌。對(duì)照組小白鼠繼續(xù)飼養(yǎng)7 d后全部存活，剖檢未見(jiàn)相關(guān)病變。

2.4 小鼠肺臟組織的病理學(xué)檢查結(jié)果 對(duì)病死小白鼠肺臟進(jìn)行病理組織學(xué)檢查，結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組死亡小白鼠的肺臟組織出現(xiàn)了急性間質(zhì)性肺炎(圖2 A)和肺水腫，肺泡膈充滿水腫液(圖2 B)，而對(duì)照組小白鼠的肺臟無(wú)病理學(xué)變化(圖2 C)?？梢?jiàn)，該分離菌引發(fā)小白鼠的病理變化與臨床剖檢患病羊的病理變化相同，均為急性間質(zhì)性肺炎。

A：患病羊肺間質(zhì)增寬；B：患病羊肺臟組織嗜中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)；C：健康羊肺臟A: pulmonary mesenchyme are widened; B: neutrophil infiltration in lung tissue; C: healthy goat lungs

A：死亡小鼠出現(xiàn)急性間質(zhì)性肺炎；B：死亡小鼠肺泡膈充滿水腫液；C：健康小鼠肺臟A: acute interstitial pneumonia in dead mice; B: alveolar septa filled with edema fluid; C: healthy mice lungs

2.5 16SrDNA特異性核酸片段的擴(kuò)增結(jié)果 以提取的分離菌基因組 DNA 為模板，進(jìn)行16SrDNA特異性核酸片段的 PCR 擴(kuò)增，其擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。結(jié)果顯示，PCR反應(yīng)成功擴(kuò)增得到一條大小約為1500 bp 的條帶(圖3)。對(duì)目的片段進(jìn)行序列測(cè)定，測(cè)定結(jié)果在 GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)中經(jīng)Blast對(duì)比分析，結(jié)果顯示該分離菌16SrDNA序列與殺鮭氣單胞菌16SrDNA序列一致性為98%，將其命名為A.sal-1。

2.6 系統(tǒng)進(jìn)化分析 測(cè)序結(jié)果在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行Blast比對(duì)分析， 并應(yīng)用MEGA7.0軟件對(duì)分離菌株與氣單胞菌屬不同種代表菌株進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建，結(jié)果顯示，分離菌A.sal-1與GeneBank中已登錄的殺鮭氣單胞菌處于不同分支(圖4)。

M : DL2000 DNA Marker ；1:A.sal-1 16S rDNA的PCR產(chǎn)物M：DL2000 DNA Marker ；1：PCR-amplified 16S rDNA gene of strain A.sal-1

圖4 A.sal-1與相關(guān)菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig 6 Phylogenetic tree of A.sal-1 and other related strains based on 16S rDNA sequence

2.7 藥敏試驗(yàn)結(jié)果 藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示(表1)，分離菌株A.sal-1對(duì)頭孢噻肟和強(qiáng)力霉素等藥物相對(duì)敏感(MIC≤2 μg/mL)，對(duì)慶大霉素、氟苯尼考、氧氟沙星等藥物中度敏感(MIC≤8 μg/mL)，對(duì)丁胺卡那霉素、鏈霉素、大觀霉素等藥物均有不同程度的耐藥(MIC≥256 μg/mL)。

表1 分離菌株A.sal-1 對(duì)19種抗菌藥物的敏感性試驗(yàn)Tab 1 Sensitivity of the isolated strain A.sal-1 to 19 kinds of antibioties

“S”表示高度敏感；“I”表示中度敏感;；“R”表示不敏感
Note："S"-Sensitive；"I"-Intermediate；"R"-Resistant

3 討論與小結(jié)

殺鮭氣單胞菌宿主廣泛，其不僅能引發(fā)鮭鱒魚(yú)類的癤瘡病，還可導(dǎo)致其他多種水生動(dòng)物發(fā)病，F(xiàn)ernndez-lvarez C[10]等首次從患病鱸魚(yú)體內(nèi)分離到殺鮭氣單胞菌，張曉君[11]等的人工感染試驗(yàn)顯示該菌對(duì)牙鲆、鯉、鯽、泥鰍等都具有不同程度的致病作用。同時(shí)，該菌還可傳播給人和動(dòng)物，引起人畜發(fā)生敗血癥等疾病，國(guó)內(nèi)外均有報(bào)道顯示，從豬肉[12]、人體血液中[13]分離到了殺鮭氣單胞菌。本研究從患有呼吸系統(tǒng)疾病的病羊肺臟組織中分離到1株病原菌，其對(duì)健康小鼠具有較強(qiáng)的致病性，且該分離菌引發(fā)小鼠的病理變化與臨床剖檢患病羊的病理變化相同，均為急性間質(zhì)性肺炎。分子生物學(xué)鑒定結(jié)果顯示該菌為殺鮭氣單胞菌。

目前，我國(guó)對(duì)于感染殺鮭氣單胞菌的防治仍以投放抗生素為主要手段，研究表明，在長(zhǎng)期的藥物壓力下殺鮭氣單胞菌已對(duì)常用藥物產(chǎn)生了耐藥性。王海娟[2]等2015年對(duì)鯉魚(yú)殺鮭氣單胞菌的耐藥性分析結(jié)果顯示，其所分離到的殺鮭氣單胞菌對(duì)氨芐西林、氨芐西林/舒巴坦、甲氧卞胺嘧啶和磺胺異惡唑等抗生素產(chǎn)生了耐藥性。本研究對(duì)分離菌A.sal-1進(jìn)行的藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果顯示，該菌對(duì)頭孢噻肟、強(qiáng)力霉素等藥物相對(duì)敏感，與王海娟等[2]的研究結(jié)果一致；對(duì)慶大霉素、氟苯尼考、氧氟沙星等藥物中度敏感；對(duì)環(huán)丙沙星、恩諾沙星、克林霉素等多種藥物產(chǎn)生了不同程度的耐藥性，該結(jié)果與李紹戊等[5]的研究結(jié)果相反。藥物敏感性實(shí)驗(yàn)為山羊源殺鮭氣單胞菌引發(fā)疾病的預(yù)防和治療提供了理論依據(jù)。同時(shí)，也應(yīng)積極進(jìn)行殺鮭氣單胞菌疫苗的研發(fā)工作，逐漸減少臨床抗生素的使用。

隨著殺鮭氣單胞菌宿主范圍的日益增加，不但對(duì)國(guó)內(nèi)外水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成了較嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失，也對(duì)畜牧養(yǎng)殖業(yè)產(chǎn)生了一定的影響，病原菌通過(guò)水體、食品等傳遞給人類，對(duì)人類健康及食品安全也造成巨大威脅，尤其是耐藥殺鮭氣單胞菌的產(chǎn)生和流行，更為該菌引發(fā)疾病的治療增添了困難[14]。為此，在獸醫(yī)臨床治療過(guò)程中，應(yīng)及時(shí)對(duì)該菌進(jìn)行藥物敏感性檢測(cè)，篩選出敏感藥物，以最大程度的減少因該菌耐藥性產(chǎn)生而造成的抗感染失敗。

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