張世芹，吳新文，魏 杰，陳迎麗，王 睿

(貴州省檢測技術研究應用中心，貴州 貴陽 550014)

噻呋酰胺是噻唑酰胺類殺菌劑，在葉面噴霧或土壤澆灌時，能迅速被植物根和葉吸收，并在整個植物體的木質(zhì)部和質(zhì)外體傳導，常用于水稻、馬鈴薯、玉米和市容草，主要防治擔子菌綱真菌引起的紋枯病[1-3]。己唑醇是三唑類殺菌劑，具有保護和治療活性，用于防治子囊菌和擔子菌引起的病害，能有效防治紋枯病、白粉病和黑星病、葡萄黑腐病和白粉病、咖啡銹病、花生葉斑病等[4-5]。二者復配對水稻紋枯病的有效防治以及緩解單一藥劑長期使用可能導致的病原菌抗藥性風險具有非常明顯的特效作用[6-7]。

目前，噻呋酰胺和己唑醇分別已經(jīng)報道了液相色譜、氣相色譜以及GC-MS的分析方法[8-15]，而二者復配制劑沒有相關國家標準、行業(yè)標準以及地方標準，關于有效成分同時分析也鮮有公開報道[16-17]。本試驗建立了一種對27.8%噻呋酰胺·己唑醇懸浮劑中的有效成分同時進行定量分析的高效液相色譜方法，該方法操作更為簡便、快速，分離效果好，線性關系、準確度和精密度均滿足要求，檢測機構間驗證結果亦符合性良好，適用于生產(chǎn)和監(jiān)管環(huán)節(jié)中的質(zhì)量控制。

1 實驗部分

1.1 試劑和溶液 甲醇(HPLC級)，超純水(電阻率，18.2 MΩ·cm，25℃)，噻呋酰胺標準品(ω=99.0%)，己唑醇標準品(ω=99.0%)，27.8%噻呋酰胺·己唑醇懸浮劑。

1.2 儀器 高效液相色譜儀：Agilent 1260，具有DAD檢測器；Agilent色譜數(shù)據(jù)處理工作站；梅特勒-托利多電子天平XSE205DU型；明澈超純水制備系統(tǒng)；色譜柱：Thermo Scientific AcclaimTM120 C18(250mm×4.6mm，5μm)。

1.3 高效液相色譜操作條件 流動相：體積比Ψ(甲醇﹕水)=75：25，流速：1.0mL/min，柱溫：35℃，進樣體積：5μL，檢測波長：230nm。在上述色譜操作條件下噻呋酰胺保留時間約為8.2min，己唑醇保留時間約為13.2min。標樣及27.8%噻呋酰胺·己唑醇懸浮劑的高效液相色譜(圖1、圖2)。

圖1 噻呋酰胺、己唑醇標樣色譜圖

圖2 27.8%噻呋酰胺·己唑醇懸浮劑色譜圖

1.4 測定步驟

1.4.1 標樣溶液的配制 準確稱取噻呋酰胺標準品0.025g、己唑醇標準品0.025g，置于50mL容量瓶中，用甲醇溶解，超聲波振蕩5min，冷卻至室溫，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，得到噻呋酰胺、己唑醇的混合標樣儲備液。

1.4.2 試樣溶液的配制 稱取含0.025g噻呋酰胺的試樣，置于50mL容量瓶中，先加入5mL水使試樣分散，再加入甲醇溶解，超聲波振蕩5min，冷卻至室溫，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，過濾。

1.5 測定 在上述操作條件下，待儀器穩(wěn)定后，連續(xù)注入數(shù)針標樣溶液，直至相鄰2針噻呋酰胺和己唑醇峰面積相對變化<1.2%后，按照標樣溶液、試樣溶液、試樣溶液、標樣溶液的順序進行測定。

1.6 計算 將測得的2針試樣溶液以及試樣前后2針標樣溶液中噻呋酰胺和己唑醇峰面積分別進行平均。試樣中噻呋酰胺(己唑醇)質(zhì)量分數(shù)按式(1)計算：

(1)

式中：

ω1——試樣中噻呋酰胺(己唑醇)的質(zhì)量分數(shù)，%；

A2——試樣溶液中噻呋酰胺(己唑醇)峰面積的平均值；

m1——標樣的質(zhì)量，g；

ω——標樣中噻呋酰胺(己唑醇)的質(zhì)量分數(shù)，%；

A1——標樣溶液中噻呋酰胺(己唑醇)峰面積的平均值；

m2——試樣的質(zhì)量，g。

2 結果與討論

2.1 色譜條件的選擇 使用Agilent 1260的DAD檢測器將檢測波長調(diào)整為波長掃描范圍為190～400nm對噻呋酰胺、己唑醇標樣進行3D譜圖掃描，得到噻呋酰胺、己唑醇的紫外吸收曲線圖及光譜圖，從圖中可以看到噻呋酰胺(204nm)和己唑醇(202nm)在205nm附近出現(xiàn)最大吸收，甲醇溶劑的截止波長和背景吸收可能會對目標峰產(chǎn)生一定分析干擾，且選擇在230nm波長處，標樣及試樣中噻呋酰胺與己唑醇上行峰光譜圖與下行峰光譜圖一致，且噻呋酰胺和己唑醇標樣、27.8%噻呋酰胺·己唑醇懸浮劑中有效成分峰純度值均>990，確認有效成分處無其它物質(zhì)干擾，符合定量分析要求(圖3、圖4)。

圖3 噻呋酰胺、己唑醇紫外吸收曲線

圖4 噻呋酰胺、己唑醇HPLC-DAD峰純度色譜圖

根據(jù)企業(yè)標準信息公共服務平臺中同類產(chǎn)品的企業(yè)標準和2012版《農(nóng)藥分析手冊》。經(jīng)過反復測試的結果顯示：選擇250mm×4.6mm(i.d.)不銹鋼柱，內(nèi)裝C18、5μm填充物的反相色譜柱，當流速控制在1.0mL/min，流動相甲醇+水=75+25(V/V)時，分析時間適宜，分離度及峰型較好。

2.2 線性相關性測定 在一定質(zhì)量范圍內(nèi)，按照濃度遞增的順序配制數(shù)個噻呋酰胺(己唑醇)混合標樣樣品，在1.3的色譜條件下，測定噻呋酰胺(己唑醇)的峰面積，取2次測定的平均結果。以噻呋酰胺(己唑醇)質(zhì)量濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標繪制標準曲線，分別得到噻呋酰胺的線性方程為y=8.961 7x-10.038，相關系數(shù)R2為0.999 8；己唑醇的線性方程為y=6.021 7x-1.917，相關系數(shù)R2為1.000 0，結果(表1、圖5)。

表1 線性范圍的測定結果

圖5 噻呋酰胺、己唑醇線性關系圖

2.3 分析方法的精密度 準確稱取6個供試物，在上述色譜操作條件下進行分析，計算噻呋酰胺、己唑醇的標準偏差和變異系數(shù)，結果顯示本方法對27.8%噻呋酰胺·己唑醇懸浮劑中噻呋酰胺和己唑醇的含量測定有良好的精密度，滿足NT/T 2887—2016《農(nóng)藥產(chǎn)品質(zhì)量分析方法確認指南》3.3制劑中有效成分和相關雜質(zhì)關于精密度(重復性)的要求，結果(表2)。

表2 分析方法的精密度測定結果

2.4 分析方法的準確度試驗 稱取已知質(zhì)量分數(shù)的試樣5份，分別加入一定量的噻呋酰胺(己唑醇)標準樣品，在1.3的色譜條件下測定噻呋酰胺(己唑醇)含量并計算回收率，噻呋酰胺的回收率范圍為99.25%～101.46%，己唑醇的回收率范圍為99.26%～101.92%，均滿足NT/T 2887—2016《農(nóng)藥產(chǎn)品質(zhì)量分析方法確認指南》3.3制劑中有效成分和相關雜質(zhì)關于準確度的要求，結果(表3)。

表3 準確度試驗結果

2.5 實驗室間驗證試驗 將用于建立方法的27.8%噻呋酰胺·己唑醇懸浮劑和標樣，發(fā)送至其他3家檢測實驗室，要求按照已建立的方法進行方法驗證試驗。各單位在2個不同日期對樣品含量進行重復測定，從統(tǒng)計結果看，27.8%噻呋酰胺·己唑醇懸浮劑中噻呋酰胺再現(xiàn)性相對標準偏差RSDR為1.622 1%；己唑醇再現(xiàn)性相對標準偏差RSDR為0.963 5%，都<相應的Horwitz公式2(1-0.51ogC)理論計算值，表明不同實驗室間的檢測結果符合性良好，該方法可以滿足日常檢測工作需要，數(shù)據(jù)統(tǒng)計結果(表4)。

表4 各單位驗證試驗數(shù)據(jù)統(tǒng)計結果

續(xù)表

3 結論

試驗建立了27.8%噻呋酰胺·己唑醇懸浮劑中有效成分的液相色譜分析方法，該方法操作簡便、快速，分離效果好，線性關系、準確度和精密度均滿足要求，不同檢測機構運用該方法檢測結果符合性亦良好，適用于生產(chǎn)和監(jiān)管環(huán)節(jié)中對噻呋酰胺和己唑醇復配制劑中有效成分的質(zhì)量檢測。