魏秀麗，常 雪，王艷芬，楊志昆，馮言言，張傳津*，徐恩民*，李有志

(1.山東省獸藥質(zhì)量檢驗(yàn)所，山東省畜產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)測與風(fēng)險評估重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，動物源細(xì)菌耐藥性監(jiān)測與精準(zhǔn)化用藥山東省工程實(shí)驗(yàn)室，濟(jì)南250022；2.齊魯動物保健品有限公司，濟(jì)南250100)

頭孢噻呋晶體注射液是一種緩釋制劑，活性成分是頭孢噻呋，用于治療和預(yù)防溶血性巴氏桿菌、多殺性巴氏桿菌和睡眠嗜血桿菌感染引起的牛呼吸系統(tǒng)疾病(肺炎，運(yùn)輸熱)，以及治療胸膜肺炎放線桿菌、多殺性巴氏桿菌、副豬嗜血桿菌和豬鏈球菌引起的豬呼吸系統(tǒng)疾病[1-2]。在中華人民共和國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部公告第11號等文獻(xiàn)中頭孢噻呋晶體及其注射液或其他相關(guān)制劑對頭孢噻呋含量測定均采用高效液相色譜方法[3-8]，檢測所用流動相配制比較復(fù)雜，有機(jī)試劑品種較多，對實(shí)驗(yàn)室人員操作性要求較高。本實(shí)驗(yàn)開發(fā)了超高效液相色譜-光電二極管陣列檢測法(UPLC-PDA)測定頭孢噻呋晶體注射液中頭孢噻呋的含量，與高效液相色譜法相比建立的方法流動相組成簡單，配制容易，毒性相對較小，簡單快速，經(jīng)濟(jì)環(huán)保。

1 材料與方法

1.1 藥品及試劑 頭孢噻呋對照品，批號K0331711，含量89.5%，中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；乙腈、冰醋酸、甲醇、四氫呋喃等均為色譜純；醋酸銨、正丁醇、二甲基甲酰胺、正己烷、氫氧化四丁基銨等為分析純；超純水。

頭孢噻呋晶體注射液(豬用)，來自齊魯動物保健品有限公司產(chǎn)品，規(guī)格，50 mL:5 g，100 mL:10 g；頭孢噻呋晶體注射液(牛用)，來自齊魯動物保健品有限公司產(chǎn)品，規(guī)格，50 mL:10 g，100 mL:20 g。

1.2 儀器 Waters AcquityTMUltra performance LC超高效液相色譜儀，配備二極管陣列檢測器，美國waters 公司；Agilent 1260高效液相色譜儀，配備紫外檢測器，美國安捷倫公司。分析天平，感量0.00001 g，瑞士梅特勒公司。

1.3 方法

1.3.1 供試品溶液制備 嚴(yán)格按照農(nóng)業(yè)農(nóng)村部公告第11號頭孢噻呋晶體注射液質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)儲備液的制備 精密稱取頭孢噻呋對照品44.7 mg，按照農(nóng)業(yè)農(nóng)村部公告第11號頭孢噻呋晶體注射液質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)配制成400 μg/mL儲備液。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)工作液的制備 取儲備液適量，配制成標(biāo)準(zhǔn)工作液：每1 mL含頭孢噻呋200、80、40、20、8、4、2 μg的溶液。

1.3.4 色譜操作條件及參數(shù) 色譜柱：C8色譜柱(2.1 mm×100 mm,1.7 μm)；以乙腈為流動相A，0.1%甲酸為流動相B，按表1規(guī)定進(jìn)行梯度洗脫；光電二極管陣列檢測器，掃描范圍190～400 nm，檢測波長為292 nm，柱溫35 ℃，進(jìn)樣室溫度10 ℃，流速0.35 mL/min，進(jìn)樣量1 μL。

表1 梯度洗脫條件表Tab 1 Gradient elution condition

1.3.5 重復(fù)性試驗(yàn)和精密度試驗(yàn) 精密吸取頭孢噻呋對照品儲備溶液，制成每1 mL含頭孢噻呋40 μg的對照品溶液，重復(fù)配制6份，進(jìn)樣，計算其峰面積RSD。精密吸取上述對照品溶液，重復(fù)進(jìn)樣6次，計算其峰面積RSD。

1.3.6 檢測限和定量限的測定 對頭孢噻呋的標(biāo)準(zhǔn)工作液，進(jìn)行UPLC的分析，并逐級降低其濃度，以溶液檢測時的信噪比S/N≥3作為檢測限、S/N≥10作為定量限。

1.3.7 不同色譜條件樣品檢測比較 分別使用高效液相色譜儀(參照農(nóng)業(yè)農(nóng)村部公告第11號文[1],紫外檢測器，254 nm；流速：1.5 mL/min；進(jìn)樣量：20 μL)和超高效液相色譜儀(光電二極管陣列檢測器，254、292 nm；流速：0.35 mL/min；進(jìn)樣量：1 μL)在不同的色譜條件下運(yùn)行，對同一樣品中頭孢噻呋的含量和出峰時間分別進(jìn)行比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜分離 在優(yōu)化的色譜條件下，測得頭孢噻呋色譜峰峰形良好，且均達(dá)到基線分離，在1.3.4項(xiàng)條件下，頭孢噻呋對照品和頭孢噻呋晶體注射液樣品，色譜保留時間約為5.05 min，分離度均滿足要求。頭孢噻呋UPLC色譜圖見圖1。

(a.40 μg/mL頭孢噻呋對照品;b.10%頭孢噻呋晶體注射液;c.20%頭孢噻呋晶體注射液)圖1 UPLC圖(254 nm 1 μL)Fig 1 (40 μg/mL Ceftiofur reference,10% Ceftiofur Crystalline Free Acid Injection,20% Ceftiofur Crystalline Free Acid Injection)chromatogram UPLC 254 nm 1 μL

2.2 線性 在選定的色譜條件下，使用梯度洗脫的方法，可以有效地分離目的峰，頭孢噻呋在4～200 μg/mL的范圍內(nèi)，線性回歸方程為y=6417.2x-2328.8，R2>0.9998。其標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖2。

圖2 頭孢噻呋標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig 2 Standard curve of Ceftiofur

2.3 重復(fù)性和精密度試驗(yàn) 在選定的色譜條件下，配制40 μg/mL頭孢噻呋對照品溶液，重復(fù)配制6份，進(jìn)樣，測得頭孢噻呋峰面積RSD為0.33%；取40 μg/mL頭孢噻呋對照品溶液，重復(fù)進(jìn)樣6次，測得頭孢噻呋峰面積RSD為0.21%，均滿足實(shí)驗(yàn)要求。

2.4 檢測限和定量限 2 μg/mL頭孢噻呋對照品溶液信噪比≥3，為檢出限，4 μg/mL頭孢噻呋對照品溶液信噪比≥10，為定量限。

2.5 不同色譜條件樣品檢測結(jié)果的比較 不同色譜條件下的主成分理論塔板數(shù)、保留時間等參數(shù)的比較見表2。

表2 不同色譜條件下的主成分不同色譜參數(shù)的比較Tab 2 Comparison of principal components and chromatographic parameters under different chromatographic conditions

由表2可見，使用的Waters 的C8 色譜柱理論塔板數(shù)非常高，性能是完全滿足要求的。通過響應(yīng)值比較及光譜圖各成分的最大吸收波長為254 nm和292 nm，兩波長結(jié)果偏差極小，小于1%，都能滿足檢測需求；農(nóng)業(yè)農(nóng)村部質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)選擇的254 nm，但292 nm的響應(yīng)值較高，所以選擇292 nm。光譜圖見圖3；色譜圖見圖1、圖4。保留時間為約5.05 min，滿足檢測需求。

圖3 頭孢噻呋對照品光譜圖Fig 3 Ceftiofur control spectrum

使用Waters超高效液相色譜儀(本實(shí)驗(yàn)色譜條件1.3.4項(xiàng))和高效液相色譜儀(1.3.7項(xiàng))，對同一樣品中頭孢噻呋的含量分別進(jìn)行了比較，無顯著差異，相對偏差均小于1%，表明本實(shí)驗(yàn)方法簡單可行，結(jié)果精確可靠。結(jié)果如表3所示。

表3 不同色譜條件檢測結(jié)果表 (n=4)Tab 3 Test results using different chromatographic method (n=4)

由于兩種色譜方法均已通過其方法學(xué)驗(yàn)證，均可以準(zhǔn)確控制其指標(biāo)成分。從檢測效率上看，優(yōu)選超高效液相色譜法(UPLC)，各色譜圖見圖1、圖4、圖5。從樣品噪音和峰形分離度等方面來看，優(yōu)選超高效液相色譜儀條件，背景更干凈，與雜質(zhì)峰的分離度更好。

(a.40 μg/mL頭孢噻呋對照品；b.10%頭孢噻呋晶體注射液；c.20%頭孢噻呋晶體注射液) (40 μg/mL Ceftiofur reference，10% Ceftiofur Crystalline Free Acid Injection，20% Ceftiofur Crystalline Free Acid Injection)圖4 UPLC圖(292 nm，1 μL)Fig 4 chromatogram UPLC 292 nm 1 μL

(a.40 μg/mL頭孢噻呋對照品；b.10%頭孢噻呋晶體注射液；c.20%頭孢噻呋晶體注射液) (40 μg/mL Ceftiofur reference，10% Ceftiofur Crystalline Free Acid Injection，20% Ceftiofur Crystalline Free Acid Injection)圖5 HPLC圖(254 nm 1 μL)Fig 5 chromatogram HPLC 254 nm 1 μL

3 討論與結(jié)論

3.1 UPLC方法色譜柱耐用性實(shí)驗(yàn) 本研究將頭孢噻呋的對照溶液利用PDA檢測器采集其光譜圖，在波長190～400 nm范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，頭孢噻呋在254/292 nm處有最大吸收，根據(jù)光譜圖可以判斷含有主成分；改變流速0.34、0.36 mL/min，柱溫35 ℃不變，保留時間上下浮動0.3 min以內(nèi)。改變柱溫33、38 ℃，流速0.35 mL/min不變，保留時間上下浮動0.3 min以內(nèi)，均能達(dá)到良好的分離度和精確的含量測定結(jié)果。色譜柱性能穩(wěn)定，適合本項(xiàng)目頭孢噻呋含量的測定。最終選擇292 nm作為檢測波長，35 ℃柱溫，保留時間約為5.05 min。

3.2 本方法與農(nóng)業(yè)農(nóng)村部頒布的進(jìn)口質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)[3]方法的對比 本實(shí)驗(yàn)分別采用建立的超高效液相色譜方法和標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的高效液相色譜方法，對獸藥企業(yè)生產(chǎn)的頭孢噻呋晶體注射液進(jìn)行含量測定，測得頭孢噻呋晶體注射液中頭孢噻呋含量相對偏差均小于1%，說明本試驗(yàn)建立的超高效液相色譜方法滿足該產(chǎn)品質(zhì)控檢測要求。此外，超高效液相色譜法流速為0.35 mL/min，運(yùn)行10 min，每個樣品需要消耗3.5 mL流動相；高效液相色譜法流速為1.5 mL/min，運(yùn)行時間14 min，每個樣品需要消耗21 mL流動相。通過比較，超高效液相色譜法更節(jié)約實(shí)驗(yàn)溶劑等，每個樣品節(jié)省流動相16.5 mL、縮短4 min分析時間，提高了工作效率。

本實(shí)驗(yàn)建立的超高效液相色譜法，對頭孢噻呋晶體注射液中頭孢噻呋進(jìn)行定性和定量測定，方法快速，可以作為企業(yè)內(nèi)控標(biāo)準(zhǔn)方法，具備精準(zhǔn)快捷、經(jīng)濟(jì)環(huán)保的特點(diǎn)，能有效控制頭孢噻呋晶體注射液的質(zhì)量。