吳利軍，何斌，周源，譚珺雋，胡修忠，龔萍，邵志勇，陳潔，陳夏冰，楊文海，童偉文，劉武，金爾光

(武漢市農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，武漢 430208)

抗生素類藥物的廣泛應(yīng)用推動(dòng)了規(guī)模化、集約化畜禽養(yǎng)殖業(yè)的快速發(fā)展，但抗生素類藥物在動(dòng)物體內(nèi)吸收性差，約30～90%以原形或初級(jí)代謝物形式隨畜禽糞尿排出體外，從而產(chǎn)生大量抗生素殘留的糞污。畜禽糞污還田利用是當(dāng)前資源化利用的主要途徑，還田利用過程中糞污殘留的抗生素可通過地表徑流、滲濾等方式進(jìn)入環(huán)境，對(duì)地表水、農(nóng)田土壤和地下水造成污染，對(duì)生態(tài)環(huán)境和人類健康造成嚴(yán)重危害[1-4]。

目前用于分析抗生素痕量的檢測(cè)方法主要有高效液相色譜法(HPLC)和高效液相-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS)[5]。LC-MS法雖然可以提高定量分析的精密度和靈敏度，但對(duì)畜禽養(yǎng)殖糞污中的復(fù)雜成分存在較強(qiáng)的基質(zhì)效應(yīng)，且操作復(fù)雜，使用及維護(hù)成本較高。HPLC技術(shù)與之相比具有檢測(cè)成本低、易于操作且檢測(cè)速度快等特點(diǎn)，已成功用于不同環(huán)境基質(zhì)中抗生素的定量分析[6]。目前建立的抗生素檢測(cè)方法主要集中在食品、土壤、城市污水及養(yǎng)殖廢水等，而對(duì)奶牛場(chǎng)糞污中抗生素殘留的檢測(cè)方法的報(bào)道較少[7-9]。奶牛場(chǎng)糞污主要指奶牛排泄的糞便、尿液、降溫與擠奶廳沖洗等產(chǎn)生的污水及生活污水等組成的混合物，由于其成分復(fù)雜，樣品前處理顯得冗雜而費(fèi)時(shí)費(fèi)力，因此探索一種簡(jiǎn)單、快捷的樣品前處理技術(shù)十分必要。固相萃取是近年發(fā)展起來的一項(xiàng)樣品前處理技術(shù)，主要通過固相填料對(duì)樣品組分的選擇性吸附及解吸過程，降低樣品基質(zhì)干擾，提高檢測(cè)靈敏度，實(shí)現(xiàn)樣品的分離、純化和富集[10]。本研究以畜禽糞污抗生素檢出率和檢出濃度較高的5種磺胺類抗生素作為目標(biāo)分析化合物，建立了一種固相萃取-高效液相色譜法，可同時(shí)定量測(cè)定奶牛糞污中的五種磺胺類抗生素的痕量殘留，研究結(jié)果對(duì)加強(qiáng)奶牛糞污的安全處理與資源化利用的安全評(píng)價(jià)具有積極的意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器 Agilent-1200 高效液相色譜儀 (美國(guó)Agilent 公司)；超聲波破碎儀 (寧波新芝生物科技股份有限公司)；渦旋混合器 (海門市其林貝爾儀器制造有限公司)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 (上海亞榮生化儀器廠)；固相萃取裝置 (天津市富城達(dá)科技有限公司)；氮吹儀 (杭州聚同電子有限公司)；MCX固相萃取柱 (上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司)；pH計(jì) (上海佑科儀器儀表有限公司)；AgiLent SB-C18色譜柱 (500 mm×4.6 nm,5 μm);離心機(jī) (湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司)；0.22 μm的微孔濾頭 (天津津騰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)。

1.1.2 試劑 磺胺嘧啶(SDZ)、磺胺二甲嘧啶(SDMD)、磺胺間甲氧嘧啶(SMM)、磺胺甲惡唑(SMZ)、磺胺喹噁啉(SQ)標(biāo)準(zhǔn)品，均購(gòu)自美侖生物有限公司，純度≥98%；乙腈、甲醇色譜純，購(gòu)自美國(guó)Themo公司；氯化鈉、氨水、鹽酸和冰乙酸等試劑均為分析純，購(gòu)自上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配置 分別稱取0.0100 g的抗生素標(biāo)準(zhǔn)品，加入乙腈溶解并定容至100 mL棕色容量瓶，配制成100 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，放置-20 ℃冰箱避光保存。準(zhǔn)確稱取各種單標(biāo)儲(chǔ)備液，用乙腈定容至1 mL,得10 mg/L混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，備用。

1.2.2 樣品前處理 在某奶牛養(yǎng)殖場(chǎng)多點(diǎn)采集奶牛糞漿，混合均勻，取約1000 g作為代表性樣品。樣品采集后用黑色塑料袋密封，并立即存放于冰盒中運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，并進(jìn)行冷凍干燥處理。凍干后的樣品避光保存，分析前用高速粉碎機(jī)將其粉碎，過篩，使其粒徑小于2 mm孔徑試驗(yàn)篩，混合均勻后均分至100 g，儲(chǔ)存于樣品瓶中，-20 ℃密閉保存，供檢測(cè)用[11]。

在奶牛糞漿樣品中加入抗生素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，加標(biāo)濃度為50 μg/kg，混合均勻后放置24 h，使抗生素與樣品介質(zhì)充分接觸，以模擬實(shí)際情況，按照上述步驟進(jìn)行樣品前處理。

分析前用研缽研磨，并過2 mm篩后進(jìn)行樣品前處理。稱取5.0 g前處理樣品,加入10 mL水，10 mL乙腈，漩渦混勻，超聲15 min，加入3.0 g氯化鈉，漩渦混勻后4 500 rpm/min，離心3 min，上層提取液轉(zhuǎn)移至100 mL離心管中，殘?jiān)屑尤?0 mL乙腈重復(fù)提取2次，合并提取液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)近干，用20 mL 0.1 mol/L鹽酸溶液溶解殘?jiān)?，加入正己烷去?次，每次6 mL,棄去正己烷，水層備用[11]。

1.2.3 凈化 MCX固相萃取小柱在使用前，依次用6 mL超純水和6 mL甲醇進(jìn)行活化。將以上提取液以2 mL/min流速過柱，依次用6 mL 0.1 mol/L鹽酸水溶液、6 mL超純水和6 mL甲醇沖洗MCX固相萃取小柱，吹干柱中殘留液體，加入6 mL 2% 氨化甲醇洗脫目標(biāo)抗生素，收集洗脫液，氮吹近干，用乙酸-乙腈混合溶液定容至1 mL，高效液相色譜儀分析[12]。

2.5 色譜條件 AgiLent SB-C18色譜柱(500 mm×4.6 nm,5 μm)；流動(dòng)相為0.3%的乙酸(A)和乙腈(B)，流速為1.0 mL/min；柱溫 30 ℃；梯度洗脫程序：0～18 min，85% A；15～20 min，60% A，20～20.1 min,85% A;20.1～25 min,85% A；紫外檢測(cè)波長(zhǎng)270 nm。

2 結(jié)果與分析

2.1 SPE凈化過程的優(yōu)化

2.1.1 固相萃取柱選擇 奶牛糞污樣品成分復(fù)雜，基質(zhì)中含有蛋白質(zhì)、脂類、纖維素、有機(jī)酸、氨基酸等有機(jī)物和各種無機(jī)組分[13]。這些復(fù)雜成分的存在對(duì)樣品中抗生素的測(cè)定會(huì)產(chǎn)生嚴(yán)重干擾，樣品的凈化對(duì)目標(biāo)抗生素的準(zhǔn)確定量至關(guān)重要。目前，HLB固相萃取小柱和MCX萃取小柱均可用于環(huán)境、食品、畜禽糞污中磺胺類藥物的凈化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，采用HLB固相萃取柱凈化，一方面殘?jiān)芙庖核玫木彌_液配制復(fù)雜，而且需要調(diào)節(jié)pH，檢測(cè)過程相對(duì)復(fù)雜；另一方面HLB固相萃取柱沒有選擇機(jī)制，對(duì)性質(zhì)相似的化合物均有保留，所以雜質(zhì)相對(duì)較多，對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響較大。采用MCX固相萃取小柱凈化，提取殘?jiān)盟嵝运芤喝芙?，可以去除部分不溶于酸性溶液的雜質(zhì)，不僅可以有效凈化樣品，而且凈化步驟簡(jiǎn)單。綜合考慮，本研究選用MCX固相萃取小柱。

2.1.2 上樣過柱體積優(yōu)化 提取液旋蒸近干，用0.1 moL/L鹽酸溶液溶解提取殘?jiān)鼤r(shí)，本研究嘗試了不用不同體積的鹽酸溶液溶解殘?jiān)Y(jié)果表明，從5 mL至20 mL，目標(biāo)物質(zhì)的回收率呈現(xiàn)增長(zhǎng)趨勢(shì)，但當(dāng)溶解液體積超過25 mL后，回收率沒有明顯增長(zhǎng)，分析其主要原因是過柱體積越小，同一樣品前處理所得的過柱溶液中目標(biāo)物含量越高，在相同流速下，過柱時(shí)間越短，目標(biāo)物與固相萃取小柱中填料結(jié)合時(shí)間越短，所以會(huì)有部分目標(biāo)物未與填料結(jié)合即流出固相萃取柱，導(dǎo)致回收率偏低。因此，本研究選擇20 mL作為最終的過柱溶解體積。

2.1.3 氮吹流速優(yōu)化 本研究?jī)?yōu)化了氨化甲醇氮吹速度對(duì)回收率的影響，將目標(biāo)物質(zhì)直接用6 mL 2% 氨化甲醇溶解，調(diào)節(jié)氮?dú)饬魉伲刂频邓俣?。結(jié)果表明，當(dāng)氨化甲醇的流失速度大于0.05 mL/min時(shí)，氮吹可能導(dǎo)致目標(biāo)物有10%～20%的損失。所以本方法建議控制氮吹流速，保持氨化甲醇流失速度不大于0.05 mL/min。

2.2 流動(dòng)相的確定 流動(dòng)相一般采用有機(jī)溶劑和緩沖液按照一定比例組成。有機(jī)溶劑一般采用乙腈和甲醇。相比較甲醇，乙腈具有紫外吸收低、洗脫能力強(qiáng)、峰型好、柱效高等優(yōu)點(diǎn)[12]。所以本方法采用乙腈做為有機(jī)溶劑?？股厥且活惪呻x子化的極性有機(jī)化合物，因此流動(dòng)相的pH值對(duì)抗生素物質(zhì)的分離和檢測(cè)非常重要。調(diào)節(jié)流動(dòng)相pH值常用甲酸、乙酸、磷酸和草酸[11]。本研究用0.3%(v/v)的乙酸水溶液與乙腈做為流動(dòng)相，同時(shí)測(cè)定5種抗生素，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，可以獲得良好的分離效果和適宜的保留時(shí)間，峰形尖銳，對(duì)稱性良好，無拖尾現(xiàn)象，5種抗生素在20 min內(nèi)可以獲得較好的分離。

2.3 方法線性范圍、檢出限及回收率 配置濃度范圍在0.2～10 mg/L的系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測(cè)定，以質(zhì)量濃度(c)為橫坐標(biāo)，相應(yīng)峰面積(S)為縱坐標(biāo)，得到了5種抗生素的線性范圍，結(jié)果如表1所示，在0.2～10 mg/L范圍內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)曲線具有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)r均大于0.99。以3倍信噪比(S/N=3)所對(duì)應(yīng)的濃度為方法檢出限，5種抗生素的檢出限均為20 μg/kg。在加標(biāo)量為50 μg/kg條件下，5種抗生素的回收率均在70%～75%之間，選定某一濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)品，在最適宜條件下連續(xù)進(jìn)行10次分離測(cè)定，5種抗生素的保留時(shí)間和峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)在2.5%和3.9%之間。

表1 目標(biāo)抗生素的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù),檢出限及回收率Tab 1 Linear regression equation,correlation coefficiency,quantification limits and recoveries of 5 sulfonamide antibiotics

2.4 實(shí)際樣品的測(cè)定 按照上述建立的檢測(cè)方法對(duì)某奶牛場(chǎng)糞污樣品中5種磺胺類抗生素進(jìn)行檢測(cè)。通過多點(diǎn)取樣，采集新鮮糞污樣品經(jīng)冷凍干燥，研磨過篩后按照上述建立的方法進(jìn)行樣品預(yù)處理和檢測(cè)。結(jié)果表明，糞污樣品中磺胺嘧啶的含量為45～50 μg/kg，磺胺二甲嘧啶、磺胺間甲氧嘧啶、磺胺甲惡唑、磺胺喹噁啉均未檢出。

3 討論與結(jié)論

目前,關(guān)于利用固相萃取-高效液相色譜法檢測(cè)奶牛糞污中磺胺類抗生素的研究鮮有報(bào)道。奶牛糞污樣品基質(zhì)成分復(fù)雜，因此樣品的前處理對(duì)目標(biāo)抗生素的準(zhǔn)確定量至關(guān)重要。固相萃取技術(shù)是近年來發(fā)展起來的一項(xiàng)樣品前處理技術(shù)，由液固萃取和液相色譜技術(shù)相結(jié)合發(fā)展而來，主要通過固相填料對(duì)樣品組分的選擇性吸附及解吸過程，實(shí)現(xiàn)對(duì)樣品的分離、純化和富集。主要目的在于降低樣品基質(zhì)干擾，提高檢測(cè)靈敏度。商品化的固相萃取小柱根據(jù)填料可以分為不同的類型，需要注意的是，在選擇固相萃取柱時(shí)，要考慮固相吸附層的吸附能力，避免實(shí)際操作時(shí)出現(xiàn)過載現(xiàn)象。已有的研究較多使用HLB固相萃取小柱對(duì)土壤、畜禽糞便、養(yǎng)殖水體及沉積物和沼液中的抗生素進(jìn)行富集[4,7,11,12]。本實(shí)驗(yàn)采用MCX固相萃取小柱能夠?qū)δ膛＜S污中的抗生素和其他雜質(zhì)進(jìn)行有效分離，并且凈化步驟簡(jiǎn)單，重復(fù)性較高。

實(shí)驗(yàn)對(duì)色譜條件的檢測(cè)波長(zhǎng)和流動(dòng)相進(jìn)行了嚴(yán)格的優(yōu)化。研究表明，磺胺類藥物的結(jié)構(gòu)中有一個(gè)苯環(huán)，在270 nm附近有較強(qiáng)的紫外吸收[15]。本實(shí)驗(yàn)中利用二級(jí)管陣列檢測(cè)器，選用270 nm做為檢測(cè)波長(zhǎng)對(duì)5種磺胺類抗生素進(jìn)行檢測(cè)時(shí)發(fā)現(xiàn)，色譜峰分離效果好，峰形較好，結(jié)果見圖1。因此,本研究選擇270 nm作為紫外檢測(cè)波長(zhǎng)。目前從高效液相色譜法檢測(cè)磺胺類抗生素含量的文獻(xiàn)報(bào)道來看，流動(dòng)相的組成主要有乙腈∶甲醇∶2%乙酸[14]，0.1%甲酸∶乙腈[12]，草酸∶乙腈[7]，0.1%甲酸∶甲醇[17]，本實(shí)驗(yàn)對(duì)以上流相進(jìn)行了優(yōu)化，最終確定以0.3%(v/v)的乙酸水溶液與乙腈做為流動(dòng)相，抗生素的出峰時(shí)間較理想，峰形較好，且與雜質(zhì)分離良好。

圖1 目標(biāo)抗生素標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖Fig 1 Chromatogrm of 5 studies antibiotics

本研究建立了一種固相萃取-高效液相色譜法同時(shí)檢測(cè)奶牛糞污樣品中五種磺胺類抗生素的檢測(cè)方法。本方法對(duì)5種抗生素的檢出限為20 μg/kg，回收率在70～75%之間。本方法靈敏度高、檢出限低，能夠準(zhǔn)確對(duì)樣品中磺胺類抗生素進(jìn)行定量分析，對(duì)畜禽糞污殘留抗生素污染評(píng)估和治理具有重要的指導(dǎo)意義。