程傳東 趙淑江

[摘要]為了加深對(duì)舟山東極海域微型真核浮游生物優(yōu)勢(shì)物種與相關(guān)海洋環(huán)境因子之間相關(guān)性的了解。于2016年6月和2017年2月采取夏季和冬季兩季海水樣品。通過(guò)過(guò)濾濾膜收集海水中3～20μm的浮游生物?；?8S rDNA進(jìn)行高通量測(cè)序得到相關(guān)數(shù)據(jù)，并利用SPSS17.0相關(guān)性分析探討海洋生態(tài)因子與微型真核浮游生物之間的關(guān)系。微型真核浮游生物群落組成在各個(gè)站位之間不盡相同，但都主要包括Cryptomonadales、Ciliophora、Ascomycota三大優(yōu)勢(shì)物種。SPSS相關(guān)性分析結(jié)果表明微型真核浮游生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性情況與所在站位的環(huán)境因子息息相關(guān)，夏季優(yōu)勢(shì)物種主要由Ascomycota、Ciliophora組成，冬季優(yōu)勢(shì)物種主要由Cryptomonadales組成。

[關(guān)鍵詞]舟山東極海域；微型真核浮游生物；相關(guān)分析；環(huán)境因子；優(yōu)勢(shì)度

[中圖分類(lèi)號(hào)]Q178 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A

微型真核浮游生物通常是指粒徑在3～20μm之間的真核浮游生物，是構(gòu)成海洋微型食物鏈和生物量的重要組成部分，在海洋生態(tài)系統(tǒng)中占有十分重要的地位。隨著顯微技術(shù)、分子生物學(xué)等新的技術(shù)手段被越來(lái)越廣泛地應(yīng)用到海洋浮游生物領(lǐng)域，人們發(fā)現(xiàn)了以前未知的個(gè)體微小的真核生物。許多微型真核浮游生物無(wú)明顯的外部特征，大多呈球形或近球形，準(zhǔn)確鑒定其種類(lèi)仍存在很大的困難。微型浮游生物的研究最早始于英國(guó)，直到近幾十年來(lái)，基于現(xiàn)代觀測(cè)技術(shù)和實(shí)驗(yàn)技術(shù)的進(jìn)步，微型浮游生物的研究才逐漸得到更多重視并且有了較快的發(fā)展。目前我國(guó)對(duì)海洋微型真核生物的研究主要集中于時(shí)空分布和豐度檢測(cè)層面，對(duì)其分子多樣性研究仍頗為匱乏。微型真核浮游生物作為初級(jí)生產(chǎn)者、細(xì)菌捕食者和較大型生物寄生者，在維持生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定和群落結(jié)構(gòu)多樣性中起核心作用。因此，研究微型真核浮游生物對(duì)舟山海域水生生態(tài)系統(tǒng)中的物質(zhì)循環(huán)和能量流動(dòng)有著重要意義，有助于更多地了解水體中微生物網(wǎng)的結(jié)構(gòu)和功能。

本研究以分子生物學(xué)技術(shù)為研究方法，基于高通量測(cè)序手段，揭示目標(biāo)海域的微生物群落多樣性情況，同時(shí)應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)其數(shù)據(jù)進(jìn)行相關(guān)性分析，探索海洋真核微型浮游生物群落結(jié)構(gòu)與環(huán)境因素之間的關(guān)系，對(duì)微型真核浮游生物的環(huán)境影響因素進(jìn)行討論。本研究將為進(jìn)一步了解海洋真核微型浮游生物群落結(jié)構(gòu)及多樣性提供了分子生物學(xué)層面的數(shù)據(jù)支持，并對(duì)微型真核浮游生物可作為一些經(jīng)濟(jì)魚(yú)類(lèi)的餌料持樂(lè)觀預(yù)測(cè)，值得研究者們的深入研究。

1 樣品采集及預(yù)處理

2016年7月及2017年2月在舟山東極海域設(shè)置6個(gè)代表性站位采集夏、冬兩季的海水樣品，共12個(gè)海水樣品，各采樣站位坐標(biāo)分別為S1（122.6982，30.1953）、S2（122.6973，30.2021）、S3（122.6956，30.2064）、S4（122.6953，30.2125）、S5（122.6921，30.2191）、S6（122.6869，30.2285）。夏季樣品名分別是X1、X2、X3、X4、X5、X6，冬季樣品名分別是D1、D2、D3、D4、D5、D6（見(jiàn)圖1）。

1.1 生態(tài)因子及微型浮游生物樣品采集

在水樣采集站點(diǎn)，利用便攜式 HQ-30D 溶氧儀立即測(cè)定各采樣站點(diǎn)的溶解氧（DO）和水溫（Temperature），用便攜式鹽度計(jì)測(cè)定鹽度，用記錄表單記錄下來(lái)；各站點(diǎn)分別采集表層（0.5 m）海水并經(jīng)過(guò)腳踏式真空抽濾裝置（富林004）進(jìn)行抽濾，先后經(jīng)過(guò)20μm和3μm混合纖維素濾膜（Millipore公司）分子膜過(guò)濾，富集海洋細(xì)菌于膜上，然后把過(guò)濾后的分子膜放置于凍存管中并立即加入終濃度為0.5%的戊二醛混勻固定。再放入液氮罐中保存并帶回實(shí)驗(yàn)室，然后轉(zhuǎn)移到-80 ℃超低溫冰箱保存直到實(shí)驗(yàn)開(kāi)始。

1.2 DNA的提取及檢測(cè)及PCR擴(kuò)增

取出保存分子膜的凍存管并在常溫下待其解凍，在無(wú)菌的條件下剪碎。采用水體DNA試劑盒（OMEGA Water DNA Kit：D525-01）進(jìn)行提取，DNA提取完成后用紫外分光光度計(jì)（NANO Drop 2000）檢測(cè)其濃度和純度，合格后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，采用擴(kuò)增引物（SSU0817F_SSU1196R），PCR反應(yīng)體系為95 ℃預(yù)變性3 min，95 ℃30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸20 s，循環(huán)35次，72 ℃延伸7 min。采用20 ul反應(yīng)混合液，擴(kuò)增產(chǎn)物用2%（W/V）的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增效果。將DNA樣品送至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司在Illumina MiSeqTM 平臺(tái)上進(jìn)行高通量測(cè)序。為了提高分析結(jié)果的質(zhì)量，按照97%相似性進(jìn)行OTU聚類(lèi)。還可以提供環(huán)境因子，進(jìn)行相關(guān)性分析。

2 結(jié)果

2.1 東極海域微型真核浮游生物優(yōu)勢(shì)物種組成

通過(guò)測(cè)序后所得數(shù)據(jù)可以發(fā)現(xiàn)以下規(guī)律：東極海域總體微型真核浮游生物種類(lèi)數(shù)量較多，每個(gè)站位的真核微生物種類(lèi)比較繁多且不盡相同，但同季節(jié)各站位微型真核浮游生物優(yōu)勢(shì)物種相似性較大。如冬季優(yōu)勢(shì)物種：Cryptomonadales、Ciliophora，在各站位所占比例處于85.8%～90.7%之間；夏季優(yōu)勢(shì)物種：Ascomycota在各站位所占比例處于59.9%～94.6%。由表1和表2可以發(fā)現(xiàn)，以上三種優(yōu)勢(shì)物種無(wú)論冬季還是夏季都占據(jù)著前三的平均優(yōu)勢(shì)度，特別是冬季的Cryptomonadales以及夏季的Ascomycota，都占據(jù)著絕對(duì)的優(yōu)勢(shì)比例。因此可以說(shuō)明，這三個(gè)物種在該海域微型真核浮游生物中占據(jù)著主導(dǎo)地位（見(jiàn)表1和表2）。

2.2 豐度及多樣性

從OTU聚類(lèi)結(jié)果來(lái)看，本次實(shí)驗(yàn)共得到42個(gè)門(mén)（phyla），69個(gè)綱（Class），193個(gè)目（order），115個(gè)科（family），138個(gè)屬（genus）。本文通過(guò)測(cè)序在門(mén)水平做出了群落的Heatmap圖，該圖可以通過(guò)顏色梯度及相似程度來(lái)直觀的反映多個(gè)樣本在各分類(lèi)水平上群落組成的相似性和差異性，可以比較直觀的展現(xiàn)出各個(gè)站位的物種的相對(duì)豐度及多樣性的情況（見(jiàn)圖2），圖中顏色越深說(shuō)明該細(xì)菌門(mén)類(lèi)豐度越高。在門(mén)水平下，冬、夏兩季的物種組成比例差異相對(duì)明顯，從其中可以清楚地看出所占比例較大的有三類(lèi)物種：Cryptomonadales、Ciliophora、Ascomycota。明顯地，夏季的Ascomycota豐度最高，冬季則是Cryptomonadales豐度最高，其次是Ciliophora。

2.3 微生物與環(huán)境因子相關(guān)性分析

采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件，篩選出生物量相對(duì)較多的幾種優(yōu)勢(shì)種的生物量與水溫（T）、溶解氧（Do）、PH值、鹽度（Salinity）四個(gè)環(huán)境因子進(jìn)行Person相關(guān)性分析，結(jié)果表明：（1）該海域微型真核浮游生物優(yōu)勢(shì)種與所列環(huán)境因子相關(guān)性不盡相同。從表3中可以看出，優(yōu)勢(shì)種Ascomycota只與T環(huán)境因子為極顯著正相關(guān)，與Do和Salinity為極顯著負(fù)相關(guān)，與其他物種呈極顯著負(fù)相關(guān)（P<0.01），Ascomycota、Ciliophora兩個(gè)優(yōu)勢(shì)物種都與PH和Do呈極顯著正相關(guān)，與T呈極顯著負(fù)相關(guān)（P<0.01）；環(huán)境因子之間PH與Do呈極顯著正相關(guān)，與T呈極顯著負(fù)相關(guān)，Do與T呈極顯著負(fù)相關(guān)（P<0.01）；各參數(shù)指標(biāo)間的相關(guān)系數(shù)見(jiàn)表3。

3 討論與結(jié)論

3.1 舟山東極海域海洋微型浮游生物優(yōu)勢(shì)物種的豐度影響分析

由上述研究可知，舟山東極海域冬、夏兩季微型真核浮游生物優(yōu)勢(shì)物種主要有3種，都在各自季節(jié)占據(jù)著絕對(duì)的比例，分別為Cryptomonadales、Ciliophora以及Ascomycota。但不難發(fā)現(xiàn)，冬季優(yōu)勢(shì)物種Cryptomonadales和Ciliophora在各站位所占比例處于85.8%～90.7%之間，變化區(qū)間不大，有力地說(shuō)明了該兩物種在該海域的優(yōu)勢(shì)地位，而夏季優(yōu)勢(shì)物種Ascomycota在各站位所占比例處于59.9%～94.6%，變化幅度較大，從1站位的94.6%到6站位的59.9%，表現(xiàn)出了該優(yōu)勢(shì)物種豐度的變化較大，而從1到6號(hào)站位大致是從近岸到遠(yuǎn)岸，可能這些距離也導(dǎo)致著站位間的海水生態(tài)環(huán)境的不同，間接地影響了夏季該優(yōu)勢(shì)物種的豐度值。舟山東極海域蘊(yùn)含著較為豐富的微型真核浮游生物群落，為全面認(rèn)識(shí)舟山功能海域中真核微生物多樣性奠定基礎(chǔ)。

3.2 真核微型浮游生物多樣性與環(huán)境因子之間的關(guān)系

微型真核浮游生物與環(huán)境變量之間有著相互影響、相互支撐的作用，每片海域定然會(huì)有著不同的海域環(huán)境，因此其環(huán)境因子也會(huì)相應(yīng)的有所不同，進(jìn)而影響著不同海域微生物多樣性的程度。比較常被引用的環(huán)境因素主要包括溫度、鹽度、DO和無(wú)機(jī)營(yíng)養(yǎng)鹽等。在本研究中，毫無(wú)疑問(wèn)，溫度環(huán)境因子是我們考慮的首要因素，選擇冬夏兩季也是由此而來(lái)。相關(guān)系數(shù)矩陣中所得出的結(jié)果也與實(shí)際情況相符，兩季的樣品很明顯地呈現(xiàn)出負(fù)相關(guān)，與夏季樣品有著極強(qiáng)的相關(guān)性的環(huán)境因子有Do、PH，而與冬季樣品表現(xiàn)出較強(qiáng)的相關(guān)性的環(huán)境因子有Salinity和T。其中，Salinity環(huán)境因子與這些優(yōu)勢(shì)種無(wú)顯著相關(guān)，影響較小。

綜上，舟山東極海域的微型真核浮游生物優(yōu)勢(shì)種在冬夏兩季雖有差異，但都有較為豐富的多樣性；同時(shí)在環(huán)境影響因子方面，本文只選用了四個(gè)相對(duì)比較常用的且影響力比較明顯的環(huán)境因子，因此該海域環(huán)境因子的相關(guān)分析也值得學(xué)者們的進(jìn)一步研究，而目前有關(guān)東極海域微型真核浮游生物的相關(guān)研究甚少，所以本研究也可以為研究者們的進(jìn)一步研究提供一些數(shù)據(jù)及經(jīng)驗(yàn)上的幫助，目前的分子生物學(xué)技術(shù)迅速發(fā)展，如本研究所使用的高通量測(cè)序等，可以為研究者們提供效率高、成本較低、數(shù)據(jù)準(zhǔn)確的先進(jìn)技術(shù)，使海洋微生物的研究能夠更好地發(fā)展。

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