俞璐云

[摘 要]聚合酶鏈式反應（polymerasechainreaction，PCR）提出至今已有20年時間，期間PCR已發(fā)展成為分子生物學領域的一項關鍵技術和常規(guī)技術，極大地推動了生命科學各個領域的發(fā)展。本文簡單介紹了PCR技術原理、反應過程并舉例了兩個具體實驗中的PCR技術應用，最后簡單介紹現(xiàn)今運用廣泛的發(fā)展后的一些PCR技術，如熒光定量PCR技術等。

[關鍵詞]聚合酶鏈式反應；熒光定量PCR技術；PCR技術發(fā)展

[中圖分類號]F274 [文獻標識碼]A

1 PCR技術簡介

聚合酶鏈式反應技術（polymerase chain reaction，PCR）又稱無細胞分子克隆或特異性DNA序列體外引物定向酶促擴增技術，是體外酶促擴增DNA或RNA序列的一種方法，由高溫變性、低溫退火及適溫延伸等幾步反應組成一個周期，循環(huán)進行，使目的DNA得以迅速擴增，具有特異性強、靈敏度高、操作簡便、省時等特點。

它與分子克?。╩olecular cloning）、DNA測序（DNA sequencing）一起構成了分子生物學的大主流技術。這項技術使人們能夠在數(shù)小時內(nèi)通過試管中的酶促反應將特定的DNA片段擴增數(shù)百萬倍，給生命科學領城的研究手段中帶來了革命性的變化。由于PCR 技術的實用性和極強的生命力，PCR 技術成為生物科學研究的一種重要方法，極大地推動了分子生物學以及生物技術產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

2 具體實驗實例

2.1 PCR技術測定不同山核桃品種特定基因的實驗

核桃價格歷來都比較昂貴，可利用PCR技術研究高產(chǎn)高品質核桃品種基因從而在種植上挑選特定品種提高經(jīng)濟效益。

2.1.1 前期準備

2.1.1.1 引物 每組引物都有相應上游引物和下游引物

2.1.1.2 其他材料 200ul槍頭，10ul、50ul移液槍，50ul移液排槍 96孔板，擎科 PCR MIX

2.1.1.3 設備 PCR擴增儀，電泳儀，拍照儀

2.1.1.4 DNA模板樣品（來源于不同地區(qū)山核桃樹的芽、樹枝或樹葉）

2.1.2 實驗過程

2.1.2.1 反應體系

Taq pcr主要混合物、前后引物再加上DNA模板，最后用無菌水定容，反應體系共為15.0ul。

2.1.2.2 擴增程序設定

PCR擴增儀蓋105℃預熱，設定合適的定性溫度和時間、退火溫度與時間設定，還有延伸溫度和時間并確定合適延伸循環(huán)數(shù)。

為了防止實驗人員離開而擴增結束后溫度回升所帶來的不利后果，可再加上4℃保溫一段時間。

2.1.2.3 凝膠電泳

1.5%瓊脂糖配成凝膠90ml，EB染料8ul，樣品裝量5ul，DNA marker（DL2000 DNA marker）5ul，電壓150V，電流150A，時間20min

2.1.2.4 結果分析（紫外光拍照）

電泳結果圖片對比標準的DNA maker條帶長度就能知道電泳結果中，特異性條帶的長度，從而也可與實際引物理論長度作對比分析，PCR擴增后顯示的特異性可用作原始DNA模板的篩選和基因鑒定。批量的測定不同引物序列在這些不同的山核桃DNA模板的擴增結果，最后匯總可篩選出高產(chǎn)量和質量的山核桃樹種，當然這需要大量的實驗數(shù)據(jù)，本文只講述其中一次的實驗結果。

2.2 乳桿菌突變菌柱中H+-ATPase的調控機制實驗PCR應用

2.2.1 乳酸桿菌和H+-ATPase概述

乳酸菌是發(fā)酵糖類主要產(chǎn)生乳酸的一類無芽孢、革蘭氏陽性細菌的總稱。H+-ATPase是一種細胞膜蛋白，廣泛存在于乳酸菌體內(nèi)，它對乳酸菌的代謝和產(chǎn)酸具有重要影響。

H+-ATPase的主要功能是催化ATP的合成與水解，但在不同的生物中其功能有不同的體現(xiàn)。在含有呼吸鏈的真核生物中，通常是利用呼吸鏈途徑來合成ATP，同時又能水解ATP。但乳酸菌是原核生物，主要通過底物磷酸化途徑來合成ATP，所以對于乳酸菌而言，H+-ATPase只能水解ATP而不能合成ATP，同時，通過水解ATP釋放的能量來把胞內(nèi)H+運出胞外，維持H+梯度。

2.2.2 PCR技術應用的重要性

PCR技術常用于基因檢測序列，而在該實驗中突變菌基因序列的對比，乳桿菌調控H+-ATPase編碼基因檢測是實驗中必不可少的一部分，PCR技術的應用極大地方便了實驗中基因的測序，并且結合凝膠電泳紫外觀察電泳結果，更能清晰快速找出基因序列，為實驗找到調控機制基因提供便利。

通過實時熒光定量 PCR 分析了親本菌以及兩種突變菌（TB-1、TB-2）的基因表達水平，同時對兩株突變菌的測序結果分析，分析酶活力下降的原因與基因突變的聯(lián)系。利用二環(huán)己基碳二亞胺（DCCD）和2，4-二硝基苯酚（DNP）兩種抑制劑對乳酸菌細胞膜上的H+-ATPase的抑制作用進行實驗，分析乳酸菌的兩種不同突變菌種在代謝過程中的各類代謝物的含量差異，比較兩種突變菌中H+-ATPase的活性，進而更加準確地分析H+-ATPase在乳酸菌代謝過程中的調控機制。

3 發(fā)展后的一些PCR技術

3.1 定量PCR技術

3.1.1 熒光定量PCR技術研究現(xiàn)狀

在PCR對擴增產(chǎn)物定性鑒別的基礎上，幾年前又發(fā)展起來對模板DNA片段進行定量研究的方法，即定量 PCR（Quantitative PCR，Q-PCR）。目前應用最多的為熒光定量 PCR（FQ-PCR），它是利用Taq酶的5' 3'外切酶活性，在PCR反應系統(tǒng)中加入一個熒光標記探針，經(jīng)激光激發(fā)后熒光量隨PCR循環(huán)而累積，從而達到定量目的。

實時熒光定量PCR（Real-time fluorescent quantitative PCR，F(xiàn)Q-PCR）是在PCR技術基礎上發(fā)展起來的一種高度靈敏的核酸定量技術。它是在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號來實時監(jiān)測整個PCR進程，最后通過標準曲線對未知模板濃度進行定量分析。它的特點是：（1）用產(chǎn)生熒光信號的指示劑顯示擴增產(chǎn)物的量。（2）熒光信號通過熒光染料嵌入雙鏈DNA，或雙重標記的序列特異性熒光探針或能量信號轉移探針等方法獲得，大大提高了檢測的靈敏度、特異性和精確性。（3）進行實時動態(tài)連續(xù)的熒光監(jiān)測，消除了標本和產(chǎn)物的污染，且無復雜的產(chǎn)物后續(xù)處理過程。與傳統(tǒng)的PCR相比，實時定量PCR更加快速、靈敏，并能有效地減少實驗過程中產(chǎn)生污染的危險。

3.1.2 發(fā)展趨勢

定量PCR技術具有以下的發(fā)展趨勢：定量水平從粗略定量、半定量到精確定量、絕對定量；定量過程中參照物的選擇從單純外參照非競爭性定量到多種參照定量；檢測手段從擴增樣本終點一次檢測到擴增過程中動態(tài)連續(xù)檢測進行定量；檢測方法由手工檢測、半自動檢測發(fā)展到成套設備檢測， 且檢測效率及自動化程度越來越高。

定量 PCR 技術在家蠶分子生物學研究中也起著相當重要的作用。常規(guī) PCR法已廣泛用于家蠶基因的克隆與研究中 ，但是僅僅在定性方面檢測基因中核酸序列是否存在 ， 這是不夠的，還必須從量上確定標本中的核酸 。

3.2 數(shù)字PCR技術

3.2.1 數(shù)字PCR技術簡介

數(shù)字 PCR 是近年來迅速發(fā)展起來的一種定量分析技術。與傳統(tǒng)定量 PCR技術不同的是數(shù)字PCR 不依賴于擴增曲線的循環(huán)閾值（CT）進行定量，受擴增效率的影響，也不必采用看家基因和標準曲線，具有很好的準確度和重現(xiàn)性，可以實現(xiàn)絕對定量分析。

數(shù)字 PCR（也可稱單分子 PCR） 一般包括兩部分內(nèi)容，即 PCR 擴增和熒光信號分析。在 PCR 擴增階段，與傳統(tǒng)技術不同，數(shù)字 PCR 一般需要將樣品稀釋到單分子水平，并平均分配到幾十至幾萬個單元中進行反應。不同于 qPCR 對每個循環(huán)進行實時熒光測定的方法，數(shù)字 PCR 技術是在擴增結束后對每個反應單元的熒光信號進行采集。最后通過直接計數(shù)或泊松分布公式計算得到樣品的原始濃度或含量。

3.2.2 數(shù)字PCR技術應用

近年來隨著人類對癌癥的不斷研究和認識，大量證據(jù)表明癌癥是一種基因（染色體）異常變化引起的疾病，普遍認可的異常情況包括癌基因及抑癌基因的突變、插入或缺失等。不過，癌細胞通常與大量正常細胞同時存在，因此，如何從大量正常細胞的DNA 中檢測到少量的異?；虺蔀榘┌Y研究領域關注的焦點問題之一。Vogelstein及其同事以KRAS基因突變?yōu)檠芯繉ο螅瑢δc癌患者的糞便樣品進行了數(shù)字 PCR 分析，得到KRAS基因第12號密碼子點突變率約為4%。

另外數(shù)字PCR技術還常用于腫瘤早期研究和產(chǎn)前診斷，這都為人類的健康發(fā)展提供了許多便利。

[參考文獻]

[1] 林彩琴，姚波.數(shù)字PCR技術進展[J].化學進展，2012（12）.

[2] 王偉杰.實時PCR技術及其在果樹研究中的應用[A].中國園藝學會.中國園藝學會第七屆青年學術討論會論文集[C].中國園藝學會，2006.