田云方 傅澤欽 葉瑩瑩

摘要 [目的]從舟山常見潮間帶海洋動物中分離篩選得到具有產(chǎn)抗菌活性物質(zhì)的共附生放線菌，采用不同方法測定其抗菌活性和抗菌譜，同時鑒定拮抗菌的分類地位，為研究海洋來源產(chǎn)抗菌物質(zhì)的菌源提供基礎(chǔ)資料。[方法]通過分離純化技術(shù)，從舟山幾個潮間帶海洋動物中獲得放線菌菌株。點種法初篩后獲得對金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）有一定抑菌作用的菌株；酶標儀法定量測定抑菌活性；濾紙片擴散法復篩獲得高效拮抗菌株；采用大腸桿菌（Escherichia coli）、白色念珠球菌（Monilia albican）和枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）作為指示菌測定其抗菌譜。[結(jié)果]對典型菌株GP57和GT16進行生理生化、形態(tài)學觀察及16S rDNA分子鑒定，其均為鏈霉菌屬（Streptomyces），相似度分別為99%和100%，其中GT16鑒定為灰平鏈霉菌（Streptomyces griseoplanus）。[結(jié)論]海洋共附生微生物中，海洋放線菌可能是一類很好的產(chǎn)抗菌活性物的菌源，值得更進一步的研究。

關(guān)鍵詞 潮間帶；海洋動物；共附生微生物；抗菌活性；篩選

中圖分類號 S917 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2018）21-0001-04

Abstract [Objective]Symbiotic or epiphytic actinomycetes with antibacterial active substances were isolated and screened from common intertidal zone marine animals in Zhoushan.Different methods were used for determining the antimicrobial activity and antimicrobial spectrum，the classification status of antagonistic bacteria was also identified for providing basic data for studying the source of marine antibacterial substances.[Method]Through separation and purification technology，strains were obtained from several intertidal zone marine animals in Zhoushan.Strains with certain bacteriostatic effects on Staphylococcus aureus were obtained after initial screening by spot inoculation.Antimicrobial activity was quantitatively determined by enzyme assay.The highefficiency antagonistic bacteria strains were obtained by filter paper diffusion method.Escherichia coli， Monilia albican and Bacillus subtilis were used as indicators to determine their antimicrobial spectrum.[Result]The typical strains GP57 and GT16 were identified by physiological， morphological and 16S rDNA molecular identification.All of them were Streptomyces with a similarity of 99% and 100% respectively，GT16 was identified as a Streptomyces griseoplanus.[Conclution] Among marine symbiotic or epiphytic microbes，marine actinomycetes may be a very good source of bacteria producing antibacterial actives and deserve further study.

Key words Intertidal zone；Marine animals；Symbiotic or epiphytic microbe；Antimicrobial activity；Screening

海洋放線菌生活在海洋極端環(huán)境中，其特殊的產(chǎn)生抗菌活性物質(zhì)的能力以及代謝途徑，有助于其在極端環(huán)境中生存下來，也為人們提供大量新的天然來源抗生素。海洋環(huán)境是放線菌產(chǎn)次生代謝物的重要來源[1]。海洋微生物的多樣性依賴于海洋環(huán)境的獨特性，有的在海水里自由生活，有的在一些海底沉淀物或海泥的表面依附著，還有一部分與海洋環(huán)境中的動植物處于共生、共棲、寄生或附生的關(guān)系，此類微生物稱為共附生微生物[2]。共附生指的是2種或2種以上生物在空間上緊密生活在一起，包括共生和附生2種。這些類型的共附生微生物很多棲息于海洋無脊椎動物的組織細胞內(nèi)和組織細胞外，數(shù)量非常大。至今發(fā)現(xiàn)海洋無脊椎動物和藻類能和許多細菌、放線菌、真菌等共附生，且很多具有產(chǎn)生生物活性的次級代謝產(chǎn)物[3-5]的能力。海洋共附生微生物是海洋微生物的重要類群，具有產(chǎn)生生物活性物質(zhì)的巨大潛力[6]。

近年來，人們對海綿、珊瑚等海洋環(huán)境動植物共附生微生物的研究頗多，研究表明這些動植物所攜帶的微生物種類最多，其微生物代謝產(chǎn)生的活性物質(zhì)也成為眾多科學家研究的熱點。目前已從海洋共附生微生物中分離到多種具有較強生物活性的物質(zhì)，包括維生素、毒素、抗生素、不飽和脂肪酸、酶類及酶抑制劑、抗腫瘤活性物質(zhì)、色素等。這些天然活性物質(zhì)具有高能效、副作用少、易被人體吸收等特性。此外，從微生物中提取到的代謝活性物質(zhì)，相較于動植物，來源更廣，且生產(chǎn)過程簡單，不僅不會破壞生態(tài)環(huán)境，而且易于工業(yè)化生產(chǎn)。

目前發(fā)現(xiàn)的一些海洋生物活性物質(zhì)就是由與動植物宿主共生的微生物所產(chǎn)生的[7-10]。共附生微生物的組成和生物活性不僅與宿主有關(guān)，而且與其所處的地理環(huán)境有密切關(guān)系，但目前從地理環(huán)境角度研究其對微生物分布與生物活性等方面影響的報道甚少[2]。越來越多的研究表明：海洋放線菌具有產(chǎn)生各種各樣特殊的生物活性代謝物和酶的潛力，而這些具有很大的科學研究和實際應(yīng)用的意義。伴隨著分子生物學方法的廣泛興起和應(yīng)用，新的培養(yǎng)策略和培養(yǎng)手段不斷發(fā)展，生物、化學、制藥等相互交叉和滲透學科的發(fā)展，為海洋放線菌產(chǎn)生的活性代謝產(chǎn)物的研究和開發(fā)提供了強有力的技術(shù)支持。由于目前對海洋放線菌的采集和培養(yǎng)仍存在很多技術(shù)上的困難，因此仍然有很大數(shù)量的海洋放線菌未能培養(yǎng)利用。

筆者以舟山等地潮間帶海洋動物為研究對象，采用不同培養(yǎng)基分離純化篩選得到152株具有抗菌活性的菌株，獲得具有高效抑菌活性的菌株，最后分子鑒定有抑菌作用的菌株，以期為研究潮間帶海洋動物共附生微生物提供基礎(chǔ)。

1 材料及方法

1.1 材料

1.1.1 樣品。四齒大額蟹（Metopograpsus quadridentatus）、近江牡蠣（Ostrea rivularis Gould）、褐菖鲉（Sebastiscus marmoratus）、鱗笠藤壺（Tetraclita squamosa）和日本菊花螺（Siphonaria japonica），均采集于舟山等地潮間帶巖灘。

1.1.2 指示菌。金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、大腸桿菌（Escherichia coli）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）和白色念珠菌（Monilia albican）。

1.2 培養(yǎng)基 放線菌分離培養(yǎng)基：高氏一號改良培養(yǎng)基[11]。

1.3 潮間帶共附生微生物的分離純化 樣品勻漿處理，梯度稀釋，用涂布法將稀釋度為10-2～10-4的稀釋液涂布于高氏一號改良培養(yǎng)基上，重復3個平板，30 ℃培養(yǎng)，對菌株進行統(tǒng)計、編號，利用平板劃線分離法挑取單菌落，多次劃線分離純化。設(shè)置3個對照組，對照組培養(yǎng)基不涂布。

1.4 拮抗菌株的初篩 金黃色葡萄球菌作為指示菌，用點種法對樣品進行初篩。將分離純化單菌株點種于混合指示菌的培養(yǎng)基上，3個平行。30 ℃培養(yǎng)，3、5、7 d各觀察1次，篩選有抑菌圈的菌株并進行保種。

1.5 酶標法定量測定 以630 nm處吸光度為0.01的金黃色葡萄球菌指示菌培養(yǎng)液為對照，用酶標儀法[12]每隔2 h定量測定菌株的吸光度，以得到菌株的抑菌效果。

1.6 抑菌圈測量 將復篩菌株發(fā)酵培養(yǎng)6 d，發(fā)酵液低速離心，用濾紙片擴散法將發(fā)酵液和發(fā)酵上清液貼于金黃色葡萄球菌混勻板上，3個平行，30 ℃培養(yǎng)，測量并記錄抑菌圈大小。

1.7 高效抗菌活性菌株抗菌譜檢測 以大腸桿菌、白色念珠菌和枯草芽孢桿菌為指示菌，將待測菌株發(fā)酵液和發(fā)酵上清液用濾紙片擴散法和打孔法檢測，30 ℃培養(yǎng)，觀察記錄。

1.8 抗菌活性菌株的鑒定

1.8.1 形態(tài)學觀察。根據(jù)《微生物學實驗》[13]中的插片法和載片培養(yǎng)法觀察4株高效拮抗菌株的菌絲、孢子絲和孢子形態(tài)特征，并進行生理生化鑒定。

1.8.2 分子鑒定。用MP試劑盒提取4株待測菌株總DNA，然后通過16S rDNA序列分析，采用上游引物341F（5′CCTACGGGAGGCAGCAG3′）和下游引物907r（5′CCGTCAATTCCTTTRAGTTT3′）進行PCR擴增，用感受態(tài)細胞連接、轉(zhuǎn)化、挑克隆，經(jīng)質(zhì)粒提取驗證有正確外源插入片段的轉(zhuǎn)化子，以載體上的通用引物作為測序引物序列，委托上海美吉生物測序。根據(jù)測序結(jié)果用Blast 軟件與GenBank 數(shù)據(jù)庫中的16S rDNA 序列比對，用MEGA 5.0軟件進行序列分析并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 涂布菌落生長狀況

據(jù)觀察，高氏涂布情況良好，雖然平板中有一些水蒸氣影響了單菌落的生長，導致大片菌落形成菌苔，但菌落的總體生長情況較好，便于挑選（表1）。

2.2 分離菌株初步篩選及純化培養(yǎng)

經(jīng)分離純化，從樣品中共獲得海洋放線菌152株，其中樣品四齒大額蟹含有的放線菌數(shù)量最多（77株），樣品褐菖鲉和日本菊花螺中獲得的放線菌相對較少，近江牡蠣中獲得的最少（4株）。將菌株進行標號，G表示高氏一號改良培養(yǎng)基；P表示四齒大額蟹；H表示褐菖鲉；M表示近江牡蠣；T表示磷笠藤壺；J表示日本菊花螺，數(shù)字代表菌株號。

2.3 酶標儀法對初篩菌株復篩

酶標儀法定量測定菌株在添加指示菌后生長一段時間的吸光度，結(jié)果表明菌株吸光度均在0.2左右，具有較強的抑菌作用，對金黃色葡萄球菌的生長有較強的抑制作用（圖1）。經(jīng)過篩選，選出菌株GY11、GP17、GM2、GY7、GP48、GP6、GP57、GP71、GT16共9株吸光度在0.1左右的菌株。

2.4 復篩菌株抗菌活性檢測

將復篩后的菌株用點種法接種于混勻指示菌的培養(yǎng)基上，檢測其抑菌圈直徑，結(jié)果表明其中4株均有較強的抑菌作用。測量發(fā)現(xiàn)GY11菌株抑菌圈直徑為（9.590±0.001）mm，其余3株放線菌均為9 mm以下，不同菌株之間的抑菌效果不同（圖2）。

2.5 拮抗菌抗菌譜測定

抗菌譜測定結(jié)果發(fā)現(xiàn)菌株GP57對3種指示菌均有抗性，菌株GP71、GT16對白色念珠球菌和大腸桿菌具有抗性，GY11對白色念珠球菌和枯草芽孢桿菌具有抗性（表2）。

2.6 分類地位鑒定

2.6.1 菌株孢子鑒定。以GP57及GT16為例分析典型菌株的孢子形態(tài)特征，孢子形態(tài)呈鏈狀（圖3）。

2.6.2 生理生化鑒定。明膠液化：4株菌均能使明膠發(fā)生緩慢液化現(xiàn)象。

API試驗結(jié)果：API試驗中發(fā)現(xiàn)菌株GT16、GY11均能利用19種碳源，碳源利用率較好。

顯微下觀察氣生菌絲和基內(nèi)菌絲形態(tài)及其顏色，結(jié)果發(fā)現(xiàn)4株菌均顯示典型的放線菌菌落特征（表3）。

2.6.3 分子鑒定。根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育樹，GP57和GT16均與鏈霉菌屬同源性較高，其中菌株GT16與灰平鏈霉菌同源性最為相近，為100%。因此，將菌株GT16鑒定為灰平鏈霉菌（Streptomyces griseoplanus）；而菌株GP57游離于樹外，但距離較近，結(jié)合形態(tài)學特征和生理生化結(jié)果，鑒定為鏈霉菌屬（Streptomyces）。

3 結(jié)論與討論

筆者采集舟山巖灘潮間帶上5種樣品，分離純化出152株菌株，試驗樣品全部來源于巖灘。在對宿主樣品的選擇上可以更加豐富，不僅可在巖灘上采樣，而且可在泥灘和沙灘上采樣，以期獲得更豐富的共附生微生物資源。

在篩選拮抗菌株的過程中運用點種法、濾紙片法和酶標法，發(fā)現(xiàn)相同菌株在不同篩選方法下所顯示的抑菌作用不同，最后選出9株抑菌效果相對較好的菌株。而后用濾紙片法復篩時，原本有抑菌作用的菌株GP48、GP16、GY7、GP6和GM2沒有抑菌圈產(chǎn)生，最終篩選出4株抑菌效果較好的菌株為目的菌株。近年來，朱林江等[14]研究發(fā)現(xiàn)環(huán)境脅迫會誘導細胞發(fā)生適應(yīng)性突變，如病原菌的抗藥性、工業(yè)菌株的適應(yīng)性和人體細胞的癌變等。因此，在對拮抗菌株進行篩選時，要采用不同的方法進行多次篩選，盡量減少CO2等對微生物的影響。

試驗發(fā)現(xiàn)不同菌株的抗菌譜是不同的，其中菌株GP57對白色念珠球菌、大腸桿菌和枯草芽孢桿菌都有一定的抗性；而GY11對白色念珠球菌和枯草芽孢桿菌有抗性；GP71和GT16對白色念珠球菌和大腸桿菌有抗性，而對枯草芽孢桿菌無抗性。鄭忠輝等[15]早在1998年就提出微生物的抗菌活性表達與否與菌株的培養(yǎng)基成分和培養(yǎng)條件（如pH、溫度、鹽度等）有關(guān)。所以猜測，菌株抗菌效果不同可能與培養(yǎng)條件也有一定關(guān)系。據(jù)報道，Taechowisan 等[16]從姜中分離到內(nèi)生放線菌，其中3種菌株能強烈抑制刺盤孢（Colletotrichum musae），5種能夠抑制尖芽孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）， 而有2種能抑制這2種供試真菌。由此可以得出不同菌株的抗菌范圍存在一定差異。

4株菌菌落形態(tài)有所不同，但是不能簡單地從菌落形態(tài)判斷菌株的分類地位[17]。經(jīng)過形態(tài)學觀察、生理生化鑒定和16S rDNA分子鑒定，確定菌株GT16為灰平鏈霉菌；菌株GP57為鏈霉菌屬。Sun等[18]從海綿中分離得到多種共附生海洋放線菌，其中就包括鏈霉菌屬。Nithyanand 等[19-20]還從珊瑚的黏液中分離到多種活性放線菌，包括短小桿菌屬（Curtobacterium）、鏈霉菌屬等。2010年，Goodfellow等[21]統(tǒng)計了目前已從海洋環(huán)境中分離的放線菌有50個屬，可見海洋放線菌是一類具有很大開發(fā)潛力的微生物資源。海洋共附生微生物中，海洋放線菌可能是一類很好的產(chǎn)抗菌活性物的菌源，值得更進一步的研究。

參考文獻

[1]蔡超靖.海洋放線菌的研究概況[J].國外醫(yī)藥（抗生素分冊），2011，32（5）：219-222.

[2] 周穎.共附生海洋微生物抗菌活性物質(zhì)的研究[J].農(nóng)機化研究，2008（2）：227-230.

[3] HOLMSTRM C，KJELLEBERG S.Marine Pseudoalteromonas species are associated with higher organisms and produce biologically active extracellular agents[J].FEMS Microbiology Ecology，1999，30（4）：285-293.

[4] EL AMRAOUI B，EL AMRAOUI M，COHEN N，et al.Antifungal and antibacterial activity of marine microorganisms[J].Annales pharmaceutiques francaises，2014，72（2）： 107-111.

[5] SCOPEL M，DOS SANTOS O，F(xiàn)RASSON A P，et al.AntiTrichomonas vaginalis activity of marineassociated fungi from the South Brazilian Coast[J].Experimental parasitology，2013，133（2）：211-216.

[6] JARUCHOKTAWEECHAI C，SUWANBORIRUX K，TANASUPAWATT S，et al.New macrolactins from a marine Bacillus sp. Sc026[J].J Nat Prod，2000，63（12）：984-986.

[7] HEINDL H，WIESE J，THIEL V，et al.Phylogenetic diversity and antimicrobial activities of bryozoanassociated bacteria isolated from Mediterranean and Baltic Sea habitats[J].Systematic and applied microbiology，2010，33（2）：94-104.

[8] ROMANENKO L A，UCHINO M，KALINOVSKAYA N I，et al.Isolation phylogenetic analysis and screening of marine molluscassociated bacteria for antimicrobial，hemolytic and surface ativities[J].Microbiological research，2008，163（3）：633-644.

[9] SANTOS O C S，PONTES P V M L，SANTOS J F M，et al.Isolation，characterization and phylogeny of spongeassociated bacteria with antimicrobial activities from Brazil[J].Research in microbiology，2010，161（7）：604-612.

[10] 李越中，陳琦.海洋微生物資源及其產(chǎn)生生物活性代謝產(chǎn)物的研究[J].生物工程進展，2000，20（5）：28-31.

[11] 李影林.培養(yǎng)基手冊[M].長春：吉林科學技術(shù)出版社，1991：370.

[12] 孟慶龍，陳曉琳，張明.一種使用酶標儀快速測定細菌素效價的方法[J].中國微生態(tài)學雜志，2009，21（8）：685-687.

[13] 袁麗紅.微生物學實驗[M].北京：化學工業(yè)出版社，2010：77-86.

[14] 朱林江，李崎.環(huán)境脅迫誘導的細胞適應(yīng)性突變[J].遺傳，2014，36（4）：327-335.

[15] 鄭忠輝，陳連興，黃耀堅，等.廈門海區(qū)潮間帶海洋動植物共附生微生物的抗菌活性[J]. 臺灣海峽，1998，17（4）：439-444.

[16] TAECHOWISAN T，PEBERDY J F，LUNYONG S.Isolation of endophytic actinomycetes from selected plants and their antifungal activity[J].World journal of microbiology and biotechnology，2003，19（4）：381-385.

[17] BRASIER C M.Fungal species in practice：Identifying species units in fungi[M]//CLARIDGE M F，DAWAH H A，WILSON M R，et al.Species：The units of biodiversity.London：Chapman & Hall，1997：135.

[18] SUN W，DAI S K，JIANG S M，et al.Culturedependent and cultureindependent diversity of Actinobacteria associated with the marine sponge Hymeniacidon perleve from the South China Sea[J].Antonie van leeuwenhoek，2010，98（1）：65-75.

[19] NITHYANAND P，INDHUMATHI T，RAVI A V，et al.Culture independent characterization of bacteria associated with the mucus of the coral Acropora digitifera from the Gulf of Mannar[J].World journal of microbiology and biotechnology，2011，27（6）：1399-1406.

[20] NITHYANAND P，MANJU S，PANDIAN S K.Phylogenetic characterization of culturable Actinomycetes associated with the mucus of the coral Acropora digitifera from Gulf of Mannar[J].FEMS Microbiology Letters，2011，314（2）：112-118.

[21] GOODFELLOW M，F(xiàn)IEDLER H P.A guide to successful bioprospecting：Informed by actinobacterial systematics[J].Antonie van leeuwenhoek，2010，98（2）：119-142.