徐營莉 郭成金 呂紹生

摘要 以一株分離自天津七里海濕地野生葦蘑為研究對象，以其菌絲體生物量為主要測量指標(biāo)，對其菌絲體液體培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，首先采用不同碳源、氮源進(jìn)行單因素初選，再結(jié)合正交設(shè)計(jì)，最終得到其菌絲體最佳液體培養(yǎng)基配方為蔗糖20 g/L，蛋白胨4 g/L，MgSO4·7H2O 15 g/L，KH2PO4 3 g/L，VB1 0.004 g/L，pH值自然。29 ℃培養(yǎng)20 d，菌絲體生物量達(dá)到1.980 g/L。

關(guān)鍵詞 野生葦蘑；菌絲體；液體培養(yǎng)基；正交設(shè)計(jì)；生物量

中圖分類號 S646.9 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A 文章編號 0517-6611（2018）21-0012-03

Abstract A strain of wild weimo isolated from Tianjin Qilihai wetlands was studied in the experiment.The mycelial biomass was choosed as the main index to optimize liquid culture medium of wild weimo mycelium.Firstly，the single factor primary election was conducted with different carbon sources and nitrogen sources，then，in combination with orthogonal design.The optimum liquid nutrient medium was：20 g/L sucrose，4 g/L peptone，1.5 g/L MgSO·7H2O，3 g/L KH2PO4，0.004 g/L vitamin B1，pH natural.Under the condition of dark at 29 ℃，the biomass of mycelium could reach 1.980 g/L after culturing 20 days.

Key words Wild weimo；Mycelium；Liquid nutrient medium；Orthogonal design；Biomass

食用蕈菌的液體培養(yǎng)稱為液體發(fā)酵[1]，液體發(fā)酵法能大大縮短生長周期，實(shí)現(xiàn)菌種快速生長，普遍提前10～20 d，且菌齡一致，生長發(fā)育均勻一致，接種簡便，液體菌種便于接種工作的機(jī)械化，適合食用菌的工廠化、標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)[2]。目前研究主要集中在葦蘑的抗氧化活性、種屬鑒定，對葦蘑菌絲體液體培養(yǎng)基篩選的有關(guān)報(bào)道較少。以一株采自天津七里海地區(qū)的野生蕈菌為研究對象，通過碳氮源單因素初選，并結(jié)合L9（34）正交設(shè)計(jì)[3]，試圖篩選出其菌絲體最適液體培養(yǎng)基，實(shí)現(xiàn)天津七里海野生葦蘑的可持續(xù)合理有序開發(fā)利用，提高生物量，為其發(fā)酵生產(chǎn)、細(xì)胞學(xué)育種等進(jìn)一步研究開發(fā)提供物質(zhì)基礎(chǔ)、理論依據(jù)和技術(shù)支撐，為拯救和恢復(fù)該瀕危野生蕈菌種質(zhì)資源提供有力支持[4]。

1 材料與方法

1.1 供試菌種 供試菌株為一株野生葦蘑，采自天津市寧河縣七里海濕地保護(hù)區(qū)，現(xiàn)存于天津師范大學(xué)蕈菌研究所。

1.2 試劑

蔗糖、葡萄糖、麥芽糖、可溶性淀粉、蛋白胨（含氮量14.5%）、酵母粉（含氮量9%）、牛肉膏（含氮量117%）、硫酸銨（含氮量99%）、硝酸銨（含氮量99%）、KH2PO4、MgSO4·7H2O、VB1、瓊脂粉（上海藍(lán)季），以上均為分析純，馬鈴薯、豆粕（含氮量45.4%）。均為市售。

1.3 儀器

YXQ-LS-70A電熱壓力蒸汽滅菌器，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司；SW-CJ-1FD超凈工作臺(tái)，蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；Sartorius BS 224S電子天平，賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；SPX-250B-Z生化培養(yǎng)箱，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；THZ-D臺(tái)式恒溫振蕩器，大倉市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠；SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵，鄭州長城科工貿(mào)有限公司；DHG-9245A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司。

1.4 綜合培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯（浸提液）200 g/L、瓊脂粉20 g/L、葡萄糖20 g/L、KH2PO4 3 g/L、MgSO4·7H2O 1.5 g/L、VB1 0.01 g/L?，F(xiàn)將馬鈴薯加水煮沸30 min過濾，濾液加入其他藥品完全溶解后，121 ℃滅菌20 min，pH自然。

1.5 試驗(yàn)方法

1.5.1 菌種分離培養(yǎng)及活化。

采用組織分離方法獲取菌種，將野生葦蘑色澤正常、未受病蟲侵害的部分子實(shí)體表面雜物清除，并用手術(shù)刀將子實(shí)體根部切除，再用75%酒精擦拭2次，在無菌條件下，解剖刀、鑷子等紫外線消毒后，在酒精燈外焰進(jìn)行灼燒，冷卻后，把供分離部分子實(shí)體縱切一分為二，在菌柄與菌蓋交接處的組織上用解剖刀切成見方1 cm2小塊，用鑷子迅速將組織塊放在PDA平板內(nèi)培養(yǎng)7～8 d[5]。將制備的菌種提前4 d活化。無菌條件下接種于綜合培養(yǎng)基平板上，29 ℃培養(yǎng)3～4 d備用[6]。

1.5.2 菌絲體液體培養(yǎng)基制備。

從綜合培養(yǎng)基上用手術(shù)刀挑取約0.5 cm2大小的菌種塊，接種在液體培養(yǎng)基液面上（100 mL三角瓶裝50 mL液體培養(yǎng)基），每瓶3塊，每個(gè)水平重復(fù)5次，29 ℃恒溫培養(yǎng)20 d。

1.5.3 菌絲體干重測量。

濾紙編號（3次重復(fù)分別編號）后用電子天平稱重，將培養(yǎng)20 d的葦蘑菌絲體培養(yǎng)物抽濾，蒸餾水沖洗3次后，于60 ℃烘箱中烘干2 h至恒重，再次稱量。

1.5.4 碳源培養(yǎng)基初選。

在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中以蛋白胨4 g/L為氮源，C1、C2、C3、C4、C5碳源分別為葡萄糖20 g/L、蔗糖20 g/L、麥芽糖20 g/L、可溶性淀粉10 g/L、馬鈴薯（浸提液）200 g/L，其他培養(yǎng)基成分為：KH2PO4 3 g/L，MgSO4·7H2O 1.5 g/L，VB1 0.004 g/L[6-7]（表1）。

1.5.5 氮源培養(yǎng)基初選。葦蘑培養(yǎng)基配方見表2。

1.6 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)上述菌絲體干重結(jié)果，從中選取2個(gè)菌絲體生物量較高的碳源和氮源，以及不同濃度梯度的無機(jī)鹽和VB1，使用L9（34）四因素、三水平進(jìn)行正交試驗(yàn)，正交因素與水平如表3所示。

2 結(jié)果與分析

2.1 碳源差異性對葦蘑菌絲體生長的影響

碳源是蕈菌生長必不可少的營養(yǎng)物質(zhì)之一，其作用是供應(yīng)菌絲體生長所需的能量，參與各種代謝，組成菌體細(xì)胞的碳架結(jié)構(gòu)[8]。由表4可知，以蔗糖為供試碳源時(shí)生物量最多，以馬鈴薯浸提液為供試碳源時(shí)生物量最少。經(jīng)生物統(tǒng)計(jì)學(xué)[9]方差分析（表5）F值為3.490，小于F4，10，0.01=5.994，大于F4，10，0.05=3.478，表明在0.01水平上各個(gè)碳源對葦蘑菌絲體生物量影響不顯著，在0.05水平上其差異顯著。根據(jù)Duncan檢測法可知，在001水平上蔗糖和馬鈴薯浸提液差異不顯著，但和葡萄糖、麥芽糖、可溶性淀粉間差異性顯著。為獲得最終碳源配方，所以選用蔗糖為碳源進(jìn)行正交試驗(yàn)。

2.2 氮源差異性對野生蕈菌菌絲體生長的影響

氮源是野生蕈菌生長必需的組分之一，其介入合成生物大分子等[10]。由表6可知，有機(jī)氮源和無機(jī)氮源均可使其菌絲體生長，以酵母粉為供試氮源菌絲體的生物量最多，而以硝酸銨為供試氮源菌絲體生物量最少。同時(shí)，發(fā)現(xiàn)有機(jī)氮源比無機(jī)氮源更適合野生

蕈菌菌絲體生長。經(jīng)生物統(tǒng)計(jì)學(xué)方差分析（表7）F值為26.231，大于F5，12，0.01=9.888，表明在氮源不相同的情況下葦蘑菌絲體干重呈現(xiàn)顯著性差異。應(yīng)用Duncan檢測法檢驗(yàn)表明，在0.01水平上酵母粉和其他5種氮源有極顯著性差異，所以選取酵母粉做正交試驗(yàn)。

2.3 液體培養(yǎng)基正交試驗(yàn)及理論最佳組合驗(yàn)證

正交試驗(yàn)結(jié)果如表8所示，在4個(gè)因子中，相較于其他3個(gè)因子無機(jī)鹽的極差（R）最大，蔗糖的極差最小，而無機(jī)鹽極差越大，表示該因子的改變越能影響試驗(yàn)結(jié)果，即無機(jī)鹽濃度的變化對野生蕈菌菌絲體干重的影響程度最大，蔗糖影響最小[11-12]。同一因素下，K值越大，說明該處理越有利于蕈菌菌絲體生物量的累積，經(jīng)比較各因素不同的K值可知，蔗糖和無機(jī)鹽在第3個(gè)水平上，酵母粉與VB1分別在第1個(gè)水平上和第2個(gè)水平上[14]，使野生蕈菌菌絲體生物量最多，生長最佳，故理論最佳的液體培養(yǎng)基配方Z7（A3B1C3D2），即蔗糖20 g/L，酵母粉3 g/L，MgSO4·7H2O 2.5 g/L，KH2PO4 5 g/L，VB1 0008 g/L。

在正交試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，做驗(yàn)證試驗(yàn)，以菌絲體生物量為指標(biāo)，用正交試驗(yàn)所獲得的菌絲體生物量最高的配方Z7做驗(yàn)證試驗(yàn)（圖1），得到葦蘑菌絲體生物量為1.031 g/L，低于C2組合，結(jié)果顯示理論最佳配方并非菌絲體生物量最高的配方，形成此種結(jié)果的原因可能是培養(yǎng)基的成分不同，導(dǎo)致溶液的滲透壓和pH不同，從而使葦蘑的菌絲體生物量產(chǎn)生差異[13]。

經(jīng)過碳源、氮源篩選試驗(yàn)，正交試驗(yàn)及理論最佳組合驗(yàn)證試驗(yàn)共21組（表9，C1～C5表示碳源篩選試驗(yàn)，N1～N6表示氮源篩選試驗(yàn)，Z1～Z9表示正交試驗(yàn)，Y1表示理論最佳組合驗(yàn)證試驗(yàn)），并對21組試驗(yàn)做方差齊性分析（表10）可知，F(xiàn)=6.594，大于F20，42，0.05=1.831，表明各組合對葦蘑菌絲體生物量的影響具有顯著性差異。

3 結(jié)論與討論

試驗(yàn)結(jié)果表明，葦蘑菌絲體最佳液體培養(yǎng)基配方為C2組合，即：蔗糖20 g/L，蛋白胨4 g/L，MgSO4·7H2O 1.5 g/L，KH2PO4 3 g/L，VB1 0.004 g/L，pH自然，29 ℃，培養(yǎng)20 d，菌絲體生物量達(dá)到1.980 g/L。雖未從正交試驗(yàn)中篩選出最適配方，但從21組試驗(yàn)中優(yōu)化出最佳配方作為葦蘑菌絲體液體培養(yǎng)基配方[14]，為其發(fā)酵生產(chǎn)、細(xì)胞學(xué)育種等進(jìn)一步研究開發(fā)提供物質(zhì)基礎(chǔ)、理論依據(jù)和技術(shù)支撐，為拯救和恢復(fù)該瀕危野生蕈菌種質(zhì)資源提供有力支持。

參考文獻(xiàn)

[1]賈身茂.“蕈菌”之概念[J].食用菌，2015，37（3）：66-68.

[2] 聞毛紅，朱將偉.食用菌液體培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展與應(yīng)用[J].現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2008（19）：125-126.

[3] 張樹庭.蕈菌學(xué)[J].中國食用菌，1991，10（3）：3.

[4] 王祖?zhèn)?，劉明舵，李兆江，?七里海濕地環(huán)境生態(tài)系統(tǒng)退化與修復(fù)[J].水土保持研究，2005，12（5）：244-247.

[5] 劉進(jìn)杰，王淑芳，卜慶梅，等.四種食用菌子實(shí)體不同部位組織分離菌絲長勢對比[J].煙臺(tái)職業(yè)學(xué)院學(xué)報(bào)，2006，12（2）：62-65.

[6] 劉西周，郭成金.采用L9（34）正交設(shè)計(jì)方法篩選血耳菌絲體液體培養(yǎng)基[J].中國食用菌，2009，28（1）：36-38.

[7] 馬海燕，郭成金.云芝菌絲體液體培養(yǎng)基的篩選[J].中國食用菌，2007，26（4）：34-36.

[8] 賈素巧.碳氮營養(yǎng)對猴頭菌生長發(fā)育及胞外酶活性的影響[D].保定：河北農(nóng)業(yè)大學(xué)，2006.

[9] NORMAN G R，STREINER D L.生物統(tǒng)計(jì)學(xué)基礎(chǔ)[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，2010.

[10] 劉成榮.碳源、氮源及其比例對香菇液體深層培養(yǎng)的影響[J].德州學(xué)院學(xué)報(bào)，2007，23（6）：58-60.

[11] 楊子美，郭成金.正交設(shè)計(jì)法篩選槐耳菌絲體液體培養(yǎng)基的研究[J].天津師范大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2009，29（3）：66-68.

[12] 黃亮，王玉，胡炳旭，等.正交設(shè)計(jì)法篩選紫芝菌絲液體培養(yǎng)基的研究[J].天津農(nóng)學(xué)院學(xué)報(bào)，2010，17（2）：14-17.

[13] 趙潤，郭成金.冬蟲夏草菌絲體液體培養(yǎng)基的優(yōu)化[J].天津師范大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2008，28（1）：8-11.

[14] GANG J，LIU H，LIU Y.Optimization of liquid fermentation conditions and protein nutrition evaluation of mycelium from the caterpillar medicinal mushroom，Cordyceps militaris （Ascomycetes）[J].Int J Med Mushrooms， 2016，18（8）：745-752.