姜守松 唐慶權 陶敏慧 徐婷婷 毛穎睿 張子涵 魯子怡 樊慧敏 許曉牧 彭開松 朱若林 鮑傳和 薛貴勝 李明

摘要 [目的]探明泥鰍皮膚出血病的病原，并篩選有效的外用和內服藥物。[方法]進行了細菌分離鑒定、毒力基因檢測、人工感染、藥物篩選和治療試驗。[結果]分離的N-1、N-2和N-3株均為凡隆氣單胞菌，且攜帶氣溶素aerA、細胞毒性腸毒素Act、熱不穩(wěn)定性腸毒素Alt、絲氨酸蛋白酶Ser等毒力基因。N-1株注射泥鰍的半數(shù)致死濃度為2.2×106 CFU/尾，并復制出體表點狀出血癥狀。外用和內服藥分別優(yōu)先選擇優(yōu)力克和氟苯尼考。 [結論]凡隆氣單胞菌可引起泥鰍皮膚出血病，優(yōu)力克潑灑和氟苯尼考內服可治療該病。

關鍵詞 泥鰍；皮膚出血；凡隆氣單胞菌；優(yōu)力克；氟苯尼考

中圖分類號 S947 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2018）27-0088-03

Pathogen and Treatment of Skin Hemorrhage in Loach

JIANG Shousong1， TANG Qingquan2， TAO Minhui2 et al

（1. Dingyuan Water Bureau， Dingyuan， Anhui 233200；2. Laboratory of Aquatic Health and Public Health， School of Animal Science and Technology， Anhui Agricultural University， Hefei， Anhui 230036）

Abstract [Objective]To identify the pathogen of loach skin hemorrhagic disease and screen for effective external and internal medicine. [Method]Bacterial isolation and identification， virulence gene detection， artificial infection， drug screening and treatment tests were carried out. [Result]The isolated N1， N2 and N3 strains were Aeromonas veronii and carried virulent genes such as aerolysin， cytotoxic enterotoxin， thermal unstable enterotoxin and serine protease. The median lethal concentration of N1 strain injected into loach was 2.2×106 CFU/fish， and the body surface punctate bleeding was detected. Topical and internal medication were given priority to the selection of Youlike and florfenicol respectively. [Conclusion]Aeromonas veronii can cause loach cutaneous hemorrhage， Youlike and florfenicol can be used to treat this disease.

Key words Loach；Skin hemorrhage；Aeromonas veronii；Youlike；Florfenicol

基金項目 安徽省重點研究與開發(fā)計劃項目（1804g07020174）；安徽省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術體系（皖農(nóng)科〔2016〕84號）；定遠縣現(xiàn)代農(nóng)業(yè)推廣中心專項。

作者簡介 姜守松（1973—），男，安徽定遠人，工程師，從事水產(chǎn)技術推廣、水生動物疾病監(jiān)測與防控、水產(chǎn)品質量安全監(jiān)管工作。*通訊作者，副教授，博士，從事養(yǎng)殖健康與公共衛(wèi)生研究。

收稿日期 2018-08-23

泥鰍（Misgurnus anguillicaudatus），俗稱青鰍，是鯉形目鰍科泥鰍屬的小型食用和藥用淡水魚類，近年國內外市場需求年年攀升，是我國外貿出口的重要水產(chǎn)品之一 [1]。泥鰍耐低氧，適合高密度精養(yǎng)，但高密度養(yǎng)殖容易暴發(fā)細菌性疾病?，F(xiàn)有報道表明，可引起泥鰍疾病的細菌包括溫和氣單胞菌[2]、凡隆氣單胞菌[3]、泥鰍氣單胞菌[4]、霍亂弧菌和希瓦氏菌[5]，以氣單胞菌科成員最為常見。氣單胞菌科（Aeromonadaceae）氣單胞菌屬（Aeromonas）的成員廣泛分布于水體、土壤等自然環(huán)境中，可分為致病株和非致病株，前者可感染幾乎所有動物門類，是淡水水生動物的重要病原菌和重要新發(fā)人-獸-魚共患病[6-7]。

2017年8月安徽省定遠縣明源水產(chǎn)養(yǎng)殖專業(yè)合作社養(yǎng)殖基地的泥鰍發(fā)生零星死亡，臨床以體表點狀出血為特征。為探明該病的病因和尋找防治方法，進行了細菌的分離鑒定、毒力基因檢測、本動物回歸攻毒、藥物篩選和治療試驗，從而為泥鰍類似疾病的診斷和治療提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和藥物

瓊脂營養(yǎng)培養(yǎng)基、氧化酶試紙和細菌微量生化鑒定管、藥敏紙片由杭州微生物試劑有限公司生產(chǎn)。PCR kit由北京康為世紀生物科技有限公司生產(chǎn)。DNA膠回收試劑盒由愛思進生物技術（杭州）有限公司生產(chǎn)。3種含碘制劑：優(yōu)力克，由嘉興綠望生物科技有限公司生產(chǎn)；迪碘，由成都科宏達科技有限公司生產(chǎn)；蛋氨酸碘，由惠州市三寶生物化學科技有限公司生產(chǎn)。抗菌藥物標準品均購自中國獸藥監(jiān)察所。

1.2 臨床診斷

對該病例發(fā)病前后的養(yǎng)殖管理、水質情況和寄生蟲進行臨床診斷。

1.3 細菌純化鑒定和毒力基因檢測

3條患病泥鰍（全長16～20 cm）體表消毒后，在超凈臺內解剖，取肝胰臟截面涂布于營養(yǎng)瓊脂表面，接種環(huán)劃線純化細菌，28 ℃培養(yǎng)16 h，觀察菌落形態(tài)。按《弧菌科細菌生化鑒定編碼冊》，進行革蘭氏染色、氧化酶試驗和細菌微量生化鑒定。參照朱若林等[8]方法進行16S rDNA擴增、系統(tǒng)進化分析和毒力基因檢測。

1.4 注射攻毒試驗

將健康泥鰍體長[（8.5±1.1）cm]養(yǎng)在曝氣自來水中，水溫28～31 ℃，進行注射攻毒試驗。取凡隆氣單胞菌N-1株為代表，進行注射攻毒回歸試驗，簡化寇氏法計算LD50。設0、105、106、107、108和109 CFU/mL共6個劑量組，10尾/劑量組。試驗期間按泥鰍攝食狀況少量投餌，不排污。觀察14 d，取瀕死泥鰍或剛死泥鰍，重新進行細菌分離鑒定。

1.5 外用和內服藥物篩選

參考商業(yè)檢驗標準（SN/T 3229—2012）[9]，采用稀釋—中和法篩選外用消毒劑。參考歐盟標準[10]，采用紙片法和微量肉湯稀釋法進行內服抗菌藥物的藥敏試驗。

1.6 治療試驗

根據(jù)“1.5”中篩選出的有效外用和內服藥物，進行治療。

2 結果與分析

2.1 臨床診斷

發(fā)病池水溫28～30 ℃，水質分析各項指標良好。患鰍體表和鰭基部有紅色小點，鰭條末梢發(fā)白和腐蝕。剖檢見患鰍貧血，肝胰腺發(fā)白、脆爛如泥、脾臟暗紅，未發(fā)現(xiàn)寄生蟲。

2.2 細菌的純化鑒定和毒力基因檢測

從3尾患鰍肝胰臟分別分離純化得3株優(yōu)勢菌，并分別命名為N-1、N-2和N-3株。純化菌在營養(yǎng)瓊脂平板上，28 ℃培養(yǎng)16 h后，菌落圓形凸起、乳白色、表面光滑、邊緣整齊。3株分離菌均為革蘭氏陰性菌，且氧化酶、賴氨酸脫羧酶、精氨酸脫羧酶、鳥氨酸脫羧酶均為陽性，葡萄糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，發(fā)酵蔗糖、甘露醇、水楊苷、枸櫞酸鹽均為陽性，6% NaCl胨水陰性。根據(jù)編碼鑒定手冊可判定3株細菌均疑似為凡隆氣單胞菌，但鑒定值僅為57.08%。分子鑒定顯示，3株菌的16S rDNA與凡隆氣單胞菌的相似性最大，且均大于98%，系統(tǒng)進化樹如圖1。綜上，可確定N-1株、N-2株、N-3株均為凡隆氣單胞菌。從凡隆氣單胞菌N-2中可檢出氣溶素aerA、細胞毒性腸毒素Act、熱不穩(wěn)定性腸毒素Alt、絲氨酸蛋白酶Ser這4種毒力基因；凡隆氣單胞菌N-1株和N-3株還可檢出彈性蛋白酶ahyB（圖2）。從基因水平可知，分離株均為致病性氣單胞菌。

2.3 本動物注射攻毒試驗

試驗泥鰍在攻毒后3～7 d相繼發(fā)病，死亡泥鰍主要表現(xiàn)為皮膚點狀出血、鰭條腐蝕等癥狀。N-1株對試驗泥鰍的LD50為2.2×106 CFU/尾。人工感染發(fā)病泥鰍肝臟分離菌經(jīng)檢測為攻毒所用菌株。

2.4 有效藥物篩選

對市場上比較認可的3種含碘制劑（優(yōu)力克、迪碘和蛋氨酸碘）進行了非清潔條件和清潔條件下的最小抑菌濃度試驗。3種碘制劑效價比以優(yōu)力克最高，且考慮優(yōu)力克能促進創(chuàng)傷愈合，后續(xù)治療試驗中選擇優(yōu)力克。

紙片法測定的3株菌對14種抗菌藥物的敏感性結果如表1所示。微量肉湯稀釋法測定的最小抑菌濃度見表2。綜上結果，首選國標漁藥中的氟苯尼考。

2.5 治療效果

根據(jù)上述結果，采用優(yōu)力克（濃度為0.25～0.50 mL/m3）全池潑灑，2～3次，每次間隔1 d。氟苯尼考（5 mg/kg體重，相當于10倍的體外最小抑菌濃度）伴飼料內服，連續(xù)用7 d，2次/d，治療效果良好。內服拌料時，添加適量漁用多維、維生素C、清熱解毒類和疏肝利膽的中草藥，治療效果更好。

3 討論

在泥鰍養(yǎng)殖過程中，皮膚相關疾病是養(yǎng)殖泥鰍的多發(fā)病，一般最開始表現(xiàn)為多發(fā)性點狀出血病，如不及時治療會進一步發(fā)展為赤皮、腐皮、潰爛、爛鰭等。而引起這些癥狀的細菌以氣單胞菌科成員最為常見[2-4]。 氣單胞菌一般被認為是條件致病菌，環(huán)境不良、肝膽綜合征、應激等均可誘發(fā)氣單胞菌[6]。該案例中泥鰍有不同程度的肝臟綜合征（以貧血、肝胰腺蒼白和脆爛為特征），是凡隆氣單胞菌繼發(fā)感染的誘因。此次分離菌均檢測出氣溶素，其具有溶血活性，可引起出血癥狀[11]。氣溶素的檢出，可解釋臨床所見的出血癥狀。

凡隆氣單胞菌不僅可以感染水生和陸生動物，還可以引起人的腹瀉、筋膜潰爛、菌血癥、肺炎、腦膜炎[12]。因此，泥鰍的食品安全問題應引起重視。

國內外研究均顯示，氣單胞菌的耐藥性日益嚴重，因此處理臨床病例時，需要進行藥敏試驗，才能科學用藥[13]。在治療中務必要重視泥鰍的原發(fā)病，該研究分離的病原菌毒力并不強，是繼發(fā)的細菌感染，而原發(fā)病是多種原因引起的脂肪肝綜合征。該治療試驗也表明，根據(jù)藥敏試驗篩選有針對性的藥物，配合保肝清熱等中藥治療，療效良好。

參考文獻

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