胡櫻子 陰正源 肖桂娜

摘要：

以天然荷葉為襯底，結合真空磁控濺射法沉積銀薄膜，制備出了一種高效的表面增強拉曼散射（SERS）活性基底.研究發(fā)現銀/荷葉基底對嬰兒配方奶粉中摻雜的三聚氰胺（MA）表現出良好的識別能力，而不需作額外的樣品預處理.對摻雜不同濃度三聚氰胺的奶粉溶液進行定量分析，在5～50 mg/L質量濃度范圍內獲得了較好的線性關系（線性相關系數R2>0.99）.根據3σ準則，檢測極限估計為1 mg/L.此外，銀/荷葉基底具有良好的均勻性和重復性（相對標準偏差為7.64%和10.54%）.該方法對嬰兒配方奶粉中三聚氰胺的檢測具有簡單快速、成本低且無損等優(yōu)點.

關鍵詞：

真空磁控濺射; 荷葉; 銀薄膜; 表面增強拉曼散射（SERS）; 三聚氰胺; 嬰兒配方奶粉

中圖分類號： O 647文獻標志碼： A文章編號： 1000-5137（2018）01-0062-07

Direct detection of melamine in infant formula milk powder

based on SERS effect of silver thin film coated lotus-leaf

Hu Yingzi， Yin Zhengyuan， Xiao Guina*

（Mathematics and Sciences College，Shanghai Normal University，Shanghai 200234，China）

Abstract：

An efficient surface-enhanced Raman scattering （SERS） substrate has been developed by depositing silver thin film on natural lotus leaf （Ag/lotus-leaf） with vacuum magnetron sputtering method.It was found that the Ag/lotus-leaf substrate showed excellent ability to recognize melamine molecules in infant formula milk powder directly without any sample pretreatment.Quantitative analyses of melamine in milk powder solution at different concentrations were carried out.A good linear relationship was obtained at concentrations ranging from 5 mg/L to 50 mg/L，and the correlation coefficient （R2） of the curve was larger than 0.99.According to the rule of 3σ，the limit of detection is estimated to be 1 mg/L.Furthermore，the Ag/lotus-leaf substrate exhibited good uniformity and reproducibility with relative standard deviation （RSD） values of 7.64% and 10.54%.This method was

收稿日期： 2017-09-26

基金項目： 國家自然科學基金（61405116）;上海高校青年教師培養(yǎng)資助計劃

作者簡介： 胡櫻子（1997-），女，本科生，主要從事表面增強拉曼光譜方面的研究.E-mail：1755060260@qq.com

*通信作者： 肖桂娜（1983-），女，副教授，主要從事功能納米材料、表面增強拉曼光譜等方面的研究.E-mail：xiaoguina@shnu.edu.cn

引用格式： 胡櫻子，陰正源，肖桂娜.基于銀薄膜/荷葉SERS效應直接檢測嬰兒配方奶粉中三聚氰胺 [J].上海師范大學學報（自然科學版），2018，47（1）：62-68.

Citation format： Hu Y Z，Yin Z Y，Xiao G N.Direct detection of melamine in infant formula milk powder based on SERS effect of silver thin film coated lotus-leaf [J].Journal of Shanghai Normal University（Natural Sciences），2018，47（1）：62-68.

simple，fast，nondestructive，and inexpensive for the detection of melamine in infant formula milk powder.

Key words：

vacuum magnetron sputtering; lotus leaf; silver thin film; surface-enhanced Raman scattering （SERS）; melamine; infant formula milk powder

0引言

三聚氰胺（MA）是一種重要的工業(yè)材料，大量應用于塑料、涂料、紡織和建筑等行業(yè).作為一種含氮量高的分子，也被非法添加到牛奶、嬰兒配方奶粉、寵物食品等中，以增加蛋白質測試含量[1].我國規(guī)定嬰兒配方奶粉中三聚氰胺的質量濃度上限為1 mg/L，其他食品中的為2.5 mg/L.如果食品中三聚氰胺的含量超過安全標準，可能會導致人類和寵物腎功能衰竭，甚至死亡.

目前，檢測三聚氰胺的方法主要有高效液相色譜法[2]、氣相色譜質譜法[3]、毛細管電泳法[4]、酶聯免疫吸附試驗[5]等多種，各具特色.然而，這些方法一般需要復雜的樣品預處理，昂貴的實驗設備且耗時.為此，發(fā)展一種快速準確、實時靈敏的分析技術對食品中摻雜的三聚氰胺進行檢測將是非常有意義的.作為研究物質結構的重要手段之一，拉曼光譜技術具有快速、準確、無損、適用廣泛等特點，在食品非法添加劑、果蔬農藥殘留物等檢測中發(fā)揮著積極作用[6-7].然而，普通的拉曼光譜技術存在散射效率低、散射信號弱及散射截面小的缺點，故很難獲得高質量的譜圖.

表面增強拉曼散射（SERS）技術是一種先進的表面分析技術，可以極大地增強吸附在某些金屬（如金、銀、銅等）表面物質的拉曼散射信號，并能提供吸附分子豐富的結構信息[8].由于具有無損、快速、靈敏度高、選擇性強等特點，SERS技術被認為將在材料科學和生命科學領域得到廣泛運用.近年來，國內外在利用SERS技術對三聚氰胺進行檢測方面開展了一系列研究工作[9-14].Betz等[10]通過電位移反應在金屬銅帶或銅幣上制備了一種簡單、低廉和便攜的銀微米/納米結構SERS基底，該基底可以直接檢測嬰幼兒配方奶粉中摻雜的三聚氰胺，而不需對樣品進行提取、分離、凈化或使用其他附加設備，檢測限達5 mg/L.Li等[11]基于聚集Au@SiO2納米粒子的SERS效應，對液態(tài)奶中三聚氰胺進行了簡單快速探測，但仍需對奶粉樣品進行預處理，如鹽酸處理和兩次離心分離.

本文作者以荷葉為襯底，利用真空磁控濺射法沉積銀薄膜，該方法操作簡便、成本低廉、重復性好且可批量生產.以銀/荷葉為拉曼活性基底，對嬰兒配方奶粉中摻雜的三聚氰胺進行直接檢測.對比了三聚氰胺標準品的正常拉曼散射光譜（NRS）和奶粉中三聚氰胺的SERS光譜.對奶粉中摻雜不同濃度三聚氰胺的SERS光譜進行定量分析測試.對銀/荷葉基底的均勻性和重復性也進行了研究.

1實驗部分

1.1實驗材料

使用的荷葉襯底為山東省微山湖純野生荷葉，經人工采摘、充分陽光晾曬而成;三聚氰胺購于上海國藥集團化學試劑有限公司;惠氏嬰兒配方奶粉（灌裝），產地新西蘭;高純銀濺射圓形靶材，直徑為10.16 cm，純度為99.99%，購于北京中諾新材科技有限公司.稱取三聚氰胺固體粉末10 mg和惠氏嬰兒配方奶粉500 mg，分別加入去離子水定容至100 mL，得到質量濃度為100 mg/L的三聚氰胺標準溶液和質量濃度為5 g/L的奶粉標準溶液.將兩者按一定的比例混合，分別得到三聚氰胺質量濃度為50，20，10，和5 mg/L的奶粉混合溶液.

1.2荷葉襯底上銀薄膜的制備

在購買的干燥荷葉表面選取若干處平整無裂縫部位，剪裁成適當尺寸若干片，用去離子水洗凈.用雙面膠將洗凈的干燥荷葉片平整地粘貼在紙基上.采用日本城南工業(yè)株式會社生產的SSP3-4型磁控濺射系統鍍銀薄膜.沉積室的本底壓強為5×10-4 Pa，靶和襯底間的距離為5 cm，以氬氣作為等離子生成氣體.在磁控濺射過程中，濺射功率為50 W，工作壓強為1 Pa，鍍膜時間30 min.

1.3儀器和表征

采用日立公司生產的S4800場發(fā)射掃描電子顯微鏡（SEM）表征樣品的表面形貌，加速電壓為5 kV.拉曼散射光譜通過Horiba Jobin-Yvon公司生產的XploRATM精巧型全自動顯微共焦拉曼光譜儀進行檢測.拉曼光譜儀配有激發(fā)波長分別為532，638，和785 nm的三個激光器，可以自動切換激光波長.測試前，采用單晶硅520 cm-1特征峰對拉曼光譜儀進行校準.測試時，采用Olympus光學顯微鏡 （數值孔徑為0.5，放大倍率為50倍）觀察樣品形貌.在檢測SERS前，取含不同濃度三聚氰胺的奶粉混合溶液5 μL滴在荷葉/銀基底表面.待液滴在基底表面自然干燥后，可進行SERS檢測.為了獲取最佳拉曼檢測信號，且不損傷探針分子，入射在樣品表面上的激光功率為0.1 mW，數據采集時間都小于10 s.測三聚氰胺標準水溶液的NRS光譜時，以規(guī)格為10 mm×10 mm×4.5 mm的石英比色皿作為樣品池，不使用顯微物鏡，激光功率10 mW，積分時間10 s.

2結果與討論

2.1形貌分析

眾所周知，荷葉由于其微米級乳突和納米級表皮蠟質結構，具有非常好的超疏水性和自清潔功能[15].為研究荷葉的微觀結構，用光學顯微鏡（OM）和SEM研究購買的干燥荷葉的表面形貌，如圖1（a）和（c）所示.荷葉表面隨機分布了非常多微小的乳突.從SEM照片可以看出，微米級乳突上還覆蓋有絨毛狀蠟結構.微乳突結構和二級納米結構是荷葉超疏水性的源點，構成荷葉表面的分層粗糙度.荷葉干燥過程中，微乳突寬度隨著荷葉自身水分蒸發(fā)而增加，干燥的荷葉也保持超疏水性能.圖1（b）和（d）為在荷葉襯底上沉積銀薄膜的OM和SEM照片，可以明顯觀察到兩種結構：微乳突結構和交叉銀膜.由放大的SEM照片可知，銀膜呈現不規(guī)則的棒狀結構.獨特的交叉結構能形成增強熱點，納米棒的聚集能促進電磁場的場強，以及微乳突結構的疏水性可以有效富集吸附分子，這都將有利于提高待測物的表面增強拉曼散射信號[16].

圖1荷葉襯底銀薄膜沉積前后的OM和SEM圖.（a） 沉積前OM圖;（b） 沉積后OM圖;（c） 沉積前SEM圖;

（d） 沉積后SEM圖

2.2銀/荷葉基底對奶粉中三聚氰胺的檢測

圖2三聚氰胺粉末和100 mg/L三聚氰胺標準

水溶液的NRS

圖2為三聚氰胺粉末和水溶液的NRS.三聚氰胺典型的拉曼特征峰位于381，581，676，776，和984 cm-1處.其中，676 cm-1處的最強特征峰歸屬于分子環(huán)呼吸振動模式II，包含了三嗪環(huán)的環(huán)面內變形和氨基氮原子振動[17].位于984 cm-1處的第二最強峰歸屬于三嗪環(huán)的面內環(huán)呼吸振動模式I.而質量濃度為100 mg/L的三聚氰胺標準水溶液的NRS中，只觀察到位于673 cm-1處較弱的特征峰.

圖3不同激發(fā)波長下，吸附在銀/荷葉上質量濃度為

50 mg/L三聚氰胺奶粉水溶液的SERS光譜

圖3為吸附在銀/荷葉基底上，質量濃度為50 mg/L的三聚氰胺奶粉水溶液的SERS光譜.比較研究同一檢測位置上，激發(fā)波長分別為532，638，和785 nm的情況.三者的拉曼測試條件除了積分時間不同之外，其余均相同：激光功率為0.1 mW，積分次數為1次，三者的積分時間依次為：10，5，和10 s.由圖3可知，在532 nm和785 nm激發(fā)波長下，三聚氰胺的特征峰均能被觀察到，分別位于410，594，703，997 cm-1和390，581，690，987 cm-1.與固體三聚氰胺的NRS相比，532 nm激發(fā)比785 nm激發(fā)得到的特征峰發(fā)生了更大的位移，且峰值更高.例如，676 cm-1處的特征峰分別紅移至703 cm-1和690 cm-1處.文獻報道了吸附在空心金芯片[18]和金納米粒子[19]基底上的三聚氰胺特征峰也發(fā)生了較明顯的偏移，偏移量分別達36 cm-1和39 cm-1.在638 nm激發(fā)波長下，可以明顯觀察到位于683 cm-1處的特征峰，但在1 000 cm-1附近出現了很強的寬熒光帶.

為了驗證通過銀/荷葉基底來檢測未經任何預處理的三聚氰胺奶粉溶液的方案可行性，在嬰兒配方奶粉溶液中摻雜不同濃度的三聚氰胺并滴在銀/荷葉基底上直接進行測試，如圖4（a）和4（c）所示.測試條件為：激光功率0.1 mW，積分時間10 s，而圖4（a）和4（c）中激光的激發(fā)波長分別為532 nm和785 nm.通過對比兩者的SERS光譜發(fā)現，即使在三聚氰胺濃度較低（5 mg/L）情況下，仍能在703 cm-1和690 cm-1處清晰地分辨出主要的三聚氰胺特征峰.在較高濃度（20 mg/L和50 mg/L）時，除主要的特征峰外，還能清晰地觀察到其他三個峰.拉曼特征峰的強度隨著三聚氰胺的質量濃度從50 mg/L降低至5 mg/L而同時減弱.

圖4（b）和4（d）給出了703和690 cm-1處特征峰強度與奶粉溶液中三聚氰胺濃度間具有良好的線性關系，關系式分別為：I703=1 269.3+676.4 C，I690=-622.9+165.1 C，式中I703、I690分別為703 cm-1和690 cm-1處特征峰強度，C為三聚氰胺質量濃度，相關系數（R2）分別達到0.9983和0.9925.根據3σ規(guī)則（CLOD=3σ/K），檢測限（LOD）估計為1 mg/L，符合2008年由美國食品藥品監(jiān)督管理局頒發(fā)的標準（2.5 mg/L），其中σ為標準偏差，K為線性擬合直線的斜率.

圖4激發(fā)波長為（a） 532 nm和（c） 785 nm時，不同濃度三聚氰胺奶粉溶液的SERS光譜;特征峰

（b） 703 cm-1和（d） 690 cm-1處的強度與三聚氰胺濃度的函數關系及其線性擬合直線

2.3銀/荷葉基底的均勻性和重復性

眾所周知，SERS技術作為一種常規(guī)分析工具的主要瓶頸是制備均勻、可重復和穩(wěn)定的SERS活性基底，常用拉曼譜帶強度的相對標準偏差（RSD）來評估基底的性能.為了研究銀/荷葉基底的重復性，在相同的實驗條件下，制備了6個不同的銀/荷葉基底.圖5（a）給出了吸附在不同銀/荷葉基底上奶粉水溶液中三聚氰胺的SERS光譜.可以看出，各個基底上三聚氰胺的SERS光譜均被大大增強，由不同基底得到的譜線峰的位置幾乎是一致的，6條譜線基本重合.為探討銀/荷葉基底的均勻性，圖5（c）給出了在相同的測量條件下，同一襯底上隨機選取11個三聚氰胺奶粉溶液點測得的SERS光譜.經計算，特征峰703 cm-1和690 cm-1的RSD值分別為10.54%和7.64%，如圖5（b）和5（d）所示.可見銀/荷葉基底具有較好的重復性和均勻性.

3結論

通過真空磁控濺射法在天然荷葉上沉積銀薄膜，制備了銀/荷葉基底.基于銀/荷葉的SERS效應，提出了一種靈敏、快速、便宜且直接的嬰兒配方奶粉中三聚氰胺的檢測方法.該基底對奶粉中摻雜的三聚氰胺分子檢測限約為1 mg/L，且在5～50 mg/L質量濃度范圍內獲得了較好的線性關系，其線性相關系數高于 0.99.結果表明該方法的檢測速度快，檢測效果良好，且不需對檢測物作額外的分離或提純處理.除此之外，銀/荷葉基底還具有制備方法簡便，可單次批量制備，重復性好等優(yōu)點，具有較好的應用前景.

圖5（a） 6個不同的銀/荷葉基底上三聚氰胺奶粉溶液的SERS光譜;（c） 同一銀/荷葉基底上隨機

選擇的11個三聚氰胺奶粉溶液點的SERS光譜;在（b） 703 cm-1和（d） 690 cm-1處

拉曼峰相應的峰值強度和相對標準偏差值

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