吉訓志 李煥苓 王果 王家保

摘 要 以‘新球蜜荔和‘大丁香2個荔枝品種胚性愈傷組織為材料，研究了‘新球蜜荔（XQTD）和‘大丁香（DDXTD）接種在TD（MS+0.1 mg/L NAA+0.5 mg/L TDZ+0.1 g/L肌醇+0.4 g/L水解乳蛋白（LH）+100 mL/L 椰汁+60 g/L 蔗糖+10 g/L 瓊脂）培養(yǎng)基與‘新球蜜荔接種在TX（MS+0.1 mg/L NAA+5 mg/L ZT+0.1 g/L肌醇+0.4 g/L水解乳蛋白（LH）+100 ml/L椰汁+60 g/L蔗糖+10 g/L瓊脂）培養(yǎng)基（XQTX）上各培養(yǎng)物體胚發(fā)生過程中抗氧化酶與多胺氧化酶活性變化。結果表明：體胚發(fā)生過程中，三者的可溶性蛋白含量變化都呈單峰曲線，峰值出現(xiàn)在第6天，在前12 d的培養(yǎng)中，XQTD高于XQTX，僅在第9天，DDXTD高于XQTD。三者的丙二醛（MDA）含量和超氧化物歧化酶（SOD）活性都變化平緩且差異不大。三者的過氧化物酶（POD）活性變化都呈單峰曲線，XQTD的峰值出現(xiàn)在第9天，其余出現(xiàn)在第12天，體胚發(fā)生過程中DDXTD最高。XQTD和XQTX的過氧化氫酶（CAT）活性都呈先降后升趨勢，而DDXTD只是后期下降。三者的多胺氧化酶（PAO）活性變化都呈先降后升趨勢，在前15 d的培養(yǎng)中，XQTX和DDXTD都低于XQTD，且DDXTD在前6 d里基本無變化。培養(yǎng)物中可溶性蛋白含量、POD和PAO活性變化可能與‘新球蜜荔及‘大丁香的體胚發(fā)生效率差異有關。

關鍵詞 荔枝；體胚發(fā)生；抗氧化物酶；多胺氧化酶

中圖分類號 S667.1 文獻標識碼 A

Abstract Changes of several antioxidant enzymes and polyamine oxidase activity in embryonic callus of litchi cultivars ‘Xinqiumili and ‘Dadingxiang were studied during the somatic embryogenesis induced on different induction media.The results showed that there was one peak curve of soluble protein content in both the embryonic callus of ‘Dadingxaing （DDXTD） and ‘Xingqiumili（XQTD）inoculated on TD medium （MS + 0.1 mg/L NAA + 0.5 mg/L TDZ + 0.1 g/L inositol + 0.4 g/L LH + 100 ml/L coconut juice + 60 g/L sucrose + 10 g/L agar）， and the embryonic callus of ‘Xingqiumili（XQTX）inoculated on TX medium （MS + 0.1 mg/L NAA + 5 mg/L ZT + 0.1 g/L inositol + 0.4 g/L LH + 100 ml/L coconut juice + 60 g/L sucrose + 10 g/L agar）， with the peak occurring on the 6th day after inoculation （th day）. The content of soluble protein in XQTD was higher than that in XQTX from 6th to 12th day， while DDXTD had higher soluble protein content on 9th day than XQTD. The malondialdehyde （MDA） content and the superoxide dismutase （SOD） activity in XQTX， XQTD and DDXTD had gentle variations and little differences. During the process of somatic embryogenesis， the changes of peroxidase （POD） activity in XQTX， XQTD and DDXTD showed a single peak curve， with the peak of XQTD appeared on the 9th day， the rest appeared on the 12th day. The highest POD activity was in DDXTD， and the lowest was on XQTD. The catalase （CAT） activity in XQTD and XQTX increased after decrease during somatic embryogenesis， while the catalase （CAT） activity in DDXTD only decreased in the later period. The polyamine oxidase （PAO） activity in XQTD， XQTX and DDXTD all increased after a slight decrease in the early 6 days. PAO activity in XQTD was higher both than that in XQTX from the 6th to 15th day， and than that in DDXTD from the 0 to 15th day. The soluble protein content， POD activity and PAO activity may be related to the different frequency of the somatic embryogenesis of 'Xinqiumili' and 'Dadingxiang'.

Key words litchi （Litchi chinensis Sonn.）； somatic embryogenesis； antioxidant enzyme； polyamine oxidase

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2018.04.011

荔枝離體再生技術的研究已獲得一定的進展，在少數(shù)品種上已獲得再生植株[1]，但體胚誘導困難、成苗率低仍是制約荔枝再生技術發(fā)展的瓶頸[2-3]，其機制尚不清楚。植物細胞在正常的生命代謝過程中都會產(chǎn)生活性氧自由基，其對植物細胞具有破壞作用，為保證正常的生命活動，必須保持活性氧自由基在低水平。抗氧化相關酶類與消除活性氧作用相關，活性酶大部分本質(zhì)上是蛋白質(zhì)，丙二醛與細胞損傷有關，而多胺含量與體胚發(fā)生密切相關，多胺氧化酶與多胺代謝又具有聯(lián)系[4]，了解這些生化活性的變化將為揭示體胚發(fā)生的分子機制奠定基礎[5]。前人對橡膠樹體胚發(fā)生的研究中發(fā)現(xiàn)超氧化物歧化酶（SOD）活性和可溶性蛋白含量變化與體胚發(fā)生密切相關，丙二醛含量（MDA）與體胚發(fā)生關系不大[6]；在對石刁柏體胚發(fā)生的研究中發(fā)現(xiàn)，多胺氧化酶（PAO）在體胚發(fā)生過程中酶活性下降，過氧化氫酶（CAT）呈相反的變化趨勢[7]；在對荔枝轉基因原生質(zhì)體再生的胚性愈傷組織細胞系[8]、楸樹[9]和櫻桃番茄葉[10]的體胚發(fā)生研究中發(fā)現(xiàn)，過氧化物酶（POD）活性在愈傷組織旺盛生長到球形胚期間不斷上升，達到最高點后開始下降，表明POD對體胚的分化有促進作用。對于荔枝體胚發(fā)生中生理生化變化的報道尚少，未見有關荔枝品種間體胚誘導效率差異生理生化機制的報道。筆者們在前期對2個荔枝品種利用胚性愈傷組織進行體胚誘導的研究中發(fā)現(xiàn)，‘新球蜜荔荔枝品種在TD培養(yǎng)基（MS+0.1 mg/L NAA+0.5 mg/L TDZ+0.1 g/L肌醇+0.4 g/L水解乳蛋白（LH）+100 mL/L椰汁+60 g/L蔗糖+10 g/L瓊脂）上培養(yǎng)第9 d開始出現(xiàn)體胚，在TX培養(yǎng)基（MS+0.1 mg/L NAA+5 mg/L ZT+0.1 g/L肌醇+0.4 g/L水解乳蛋白（LH）+100 mL/L椰汁+60 g/L蔗糖+10 g/L瓊脂）上培養(yǎng)第12天開始出現(xiàn)體胚，兩者都在培養(yǎng)15 d以后體胚大量出現(xiàn)，而‘大丁香荔枝品種在TD培養(yǎng)基上培養(yǎng)第15天后少量出現(xiàn)體胚。本研究擬對比2個荔枝品種上述體胚發(fā)生過程中培養(yǎng)物的抗氧化物酶與多胺氧化酶變化，探討這些變化與體胚發(fā)生的關系，為提高不同荔枝品種的體胚發(fā)生效率提供一定依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

挑取‘新球蜜荔和‘大丁香2個荔枝品種的胚性愈傷組織接種在TD培養(yǎng)基（MS+0.1 mg/L NAA+0.5 mg/L TDZ+0.1 g/L肌醇+0.4 g/L水解乳蛋白（LH）+100 mL/L椰汁+60 g/L蔗糖+10 g/L瓊脂）上，同時取上述相同的‘新球蜜荔胚性愈傷組織接種在TX培養(yǎng)基（MS+0.1 mg/L NAA+5 mg/L ZT+0.1 g/L肌醇+0.4 g/L水解乳蛋白（LH）+100 mL/L椰汁+60 g/L蔗糖+10 g/L瓊脂）上，接種當天記為0 d，每3 d取1次樣，3次重復，取樣時間為0、3、6、9、12、15、18 d，每次取樣后立即將樣品放置-80 ℃下進行冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 粗提液的制備 分別選取-80 ℃下保存‘新球蜜荔和‘大丁香2個荔枝品種0、6、9、12、15、18 d不同取樣時間的培養(yǎng)材料各0.1 g（0 d與3 d的培養(yǎng)材料無差異，未選?。尤?.0 mL的含0.2 g聚乙烯吡咯烷酮（polyvinyl pyrrolidone，PVPP）磷酸緩沖液（0.05 mol/L，pH7.8，PBS）和2顆直徑為0.2 cm的小鋼球在高通量樣品研磨儀（TissuelyserⅡ），20 Hz，60 s進行粉碎，10 000 r/min，4 ℃離心10 min取上清液，上清液即粗酶液，用于酶活性和可溶性蛋白含量的測定。

取上述同樣材料加入1.0 mL的100 g/L三氯乙酸（TCA）溶液，研磨粉碎，10 000 r/min，4 ℃離心10 min取上清液，上清液用于丙二醛含量的測定。

1.2.2 生理指標的測定 參照曹建康等[11]的測定方法，采用考馬斯亮藍比色法測定可溶性蛋白含量；硫代巴比妥酸（TBA）比色法測定丙二醛（MDA）含量；愈創(chuàng)木酚法測定過氧化物酶（POD）活性；過氧化氫還原法測定過氧化氫酶（CAT）活性；NBT光還原法測定超氧化物歧化酶（SOD）活性；通過測定多胺氧化生成過氧化氫的含量來測定多胺氧化酶（PAO）活性[12-14]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

將得到的數(shù)據(jù)結果用 WPS office 2016軟件進行處理，生成圖表并分析。

2 結果與分析

2.1 可溶性蛋白含量變化

在培養(yǎng)過程中，‘新球蜜荔在TD和TX上培養(yǎng)物的可溶性蛋白含量變化規(guī)律相似，都呈單峰曲線，峰值出現(xiàn)在第6天，在TD上可溶性蛋白峰值高于在TX上。在第9～12天，在TD和TX上可溶性蛋白含量都是先下降再稍微上升，在TD上高于在TX上。在第15～18天，兩者可溶性蛋白含量都不斷下降，2種培養(yǎng)基上培養(yǎng)物的可溶性蛋白含量差異不大（圖1-A）。

在TD培養(yǎng)基上，‘大丁香和‘新球蜜荔培養(yǎng)物的可溶性蛋白含量也都呈單峰曲線，都在第6天上升達到最高點，隨后下降。第9天‘大丁香高于‘新球蜜荔，其余時間點二者無明顯差異（圖1-B）。

2.2 MDA含量和POD、SOD、CAT活性變化

2.2.1 丙二醛含量的變化 在培養(yǎng)過程中，‘新球蜜荔在TD和TX上培養(yǎng)物的丙二醛含量變化平緩，且?guī)缀鯚o差異（圖2-A）。在TD培養(yǎng)基上，‘大丁香和‘新球蜜荔培養(yǎng)物的丙二醛含量也變化平緩，且無差異（圖2-B）。

2.2.2 POD活性的變化 在培養(yǎng)過程中，‘新球蜜荔在TD和TX上培養(yǎng)物的POD活性變化規(guī)律相似，都呈單峰曲線，在TD上，峰值出現(xiàn)在第9天，且變化幅度較小，在TX上，峰值出現(xiàn)在第12天，變化幅度較大。從第6～15天，接種在TX上培養(yǎng)物的POD活性均高于接種在TD培養(yǎng)基上的（圖3-A）。

在TD培養(yǎng)基上，‘大丁香培養(yǎng)物在培養(yǎng)過程中POD活性都高于‘新球蜜荔?！蠖∠闩囵B(yǎng)物POD活性峰值出現(xiàn)在第12天，而‘新球蜜荔出現(xiàn)在第9天?！蠖∠闩囵B(yǎng)物POD活性變化幅度遠大于‘新球蜜荔（圖3-B）。

2.2.3 SOD活性的變化 在培養(yǎng)過程中，‘新球蜜荔在TD和TX上培養(yǎng)物SOD活性都變化不大，但都保持著較高的活性。在第6～12天，‘新球蜜荔在TX上SOD活性高于在TD上，在第15～18天，在TD上SOD活性上升，在TX上SOD活性基本不變（圖4-A）。

在TD培養(yǎng)基上，‘大丁香和‘新球蜜荔培養(yǎng)物SOD活性基本相當?！蠖∠鉙OD活性從0 d培養(yǎng)到第9天時上升達到最高點。隨后下降，在第15～18天期間略有上升，但變動不大，與‘新球蜜荔無明顯差異（圖4-B）。

2.2.4 CAT活性的變化 在培養(yǎng)過程中，‘新球蜜荔在TD和TX上培養(yǎng)物CAT活性變化相似（圖5-A）。在第0～6天，‘新球蜜荔在TD和TX上CAT活性都從最高點下降；第9天，在TD和TX上CAT活性都上升，但在TX上CAT活性高于在TD上；第12天，兩者的CAT活性相當；第15天，在TX上CAT活性上升，而在TD上CAT活性下降達到最低點；第18天，在TX和TD上CAT活性都上升，但是前者高于后者。

在TD培養(yǎng)基上，‘大丁香培養(yǎng)物CAT活性變化整體呈下降趨勢（圖5-B）。在第0～6天，‘大丁香CAT活性基本無變化；第9天，‘大丁香CAT活性下降；第12天，‘大丁香與‘新球蜜荔CAT活性相似；第15天，‘大丁香CAT酶活性稍微上升；第18天，‘大丁香CAT活性急劇下降達到最低點，并低于‘新球蜜荔。

2.3 PAO活性的變化

在培養(yǎng)過程中，‘新球蜜荔在TD和TX上培養(yǎng)物的PAO活性變化都呈先降后上的趨勢。在第0～6天，‘新球蜜荔在TD和TX上PAO活性都下降達到最低點，在TD上PAO活性高于在TX上，在第9～18天，在TD上PAO活性不斷上升，在第18天達到最高點，在TX上PAO活性在第9～12天期間出現(xiàn)下降后也不斷上升，也在第18天達到最高點（圖6-A）。

在TD培養(yǎng)基上，‘大丁香培養(yǎng)物的初始PAO活性低于‘新球蜜荔，且在第18天以前，‘大丁香培養(yǎng)物的PAO活性都低于‘新球蜜荔。在第0～6天，‘大丁香與‘新球蜜荔PAO活性都下降，但‘大丁香的下降幅度低于‘新球蜜荔（圖6-B）。

3 討論

體細胞胚胎發(fā)生不僅是細胞形態(tài)建成，還涉及到生物大分子與酶化學等生理變化的過程[15-17]。在對‘新球蜜荔和‘大丁香2個荔枝品種的體胚發(fā)生過程中細胞學研究發(fā)現(xiàn)，‘新球蜜荔在TD培養(yǎng)基上培養(yǎng)9 d出現(xiàn)球形胚結構，第12天‘新球蜜荔在TD和TX培養(yǎng)基上都出現(xiàn)心形胚結構，在第15天和第18天都出現(xiàn)魚雷形胚結構，且體胚大量出現(xiàn)。而‘大丁香在TD培養(yǎng)基上第15天時出現(xiàn)心形胚結構，第18天出現(xiàn)畸形胚結構，未出現(xiàn)大量體胚（待發(fā)表）。

在對這2個荔枝品種體胚發(fā)生過程中可溶性蛋白含量變化的研究中發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)前期可溶性蛋白大量生成，‘新球蜜荔在TD培養(yǎng)基上體胚發(fā)生較早，并高于在TX培養(yǎng)基上的可溶性蛋白含量，兩者隨后開始下降。‘新球蜜荔在體胚開始出現(xiàn)的時間段，第9～12天期間的可溶性蛋白有一個積累回升的過程。這可能為體胚分化提供物質(zhì)基礎有關，與大蒜[18]在球形胚時期可溶性蛋白積累回升的研究結果相似。‘大丁香的可溶性蛋白在大量生成后不斷下降流失，而可溶性蛋白未積累回升可能是導致體胚發(fā)生效率低的緣故。

培養(yǎng)過程中丙二醛含量（MDA）在2個荔枝品種中都處于很低的水平，表明在體胚發(fā)生過程中細胞受到活性氧的損傷較小。邢更妹等[19]研究發(fā)現(xiàn)植物體胚發(fā)生往往伴隨著大量的活性氧產(chǎn)生，而一套高效的抗氧化系統(tǒng)能夠保證體胚發(fā)生的正常進行，而使愈傷組織不會褐化死亡。過氧化物酶（POD）、過氧化氫酶（CAT）和超氧化物歧化酶（SOD）這3種抗氧化物酶具有較強清除活性氧的活性。在對‘新球蜜荔和‘大丁香體胚發(fā)生過程中這3種抗氧化物酶的研究中發(fā)現(xiàn)，POD在2個體胚發(fā)生效率不同的荔枝品種中酶活性差異較大，‘大丁香的POD活性遠大于‘新球蜜荔，但‘新球蜜荔在體胚出現(xiàn)時間點，第9天與第12天都有POD活性峰值，而‘新球蜜荔和‘大丁香的SOD活性和CAT活性的變化規(guī)律與酶活性都差異不大，表明POD可能在體胚誘導過程中的作用更大。前人在對櫻桃番茄[10]、人參[20]和大蒜[18]等的體胚發(fā)生的研究中發(fā)現(xiàn)，POD在體胚發(fā)生初期酶活性較高，POD在愈傷組織形成和體胚發(fā)育過程中酶活性升高，與本文研究結果一致。枸杞[21]、橡膠[6]和楸樹[9]等的體胚發(fā)生研究顯示，SOD在體胚發(fā)生過程中酶活性上升，在心形胚時期達到最高，與本文研究結果不一致，在本研究中SOD在體胚發(fā)生過程中都保持著較高的活性，表明SOD可能起基礎保障作用。

在對‘新球蜜荔和‘大丁香的多胺氧化酶（PAO）活性變化規(guī)律研究中發(fā)現(xiàn)，‘新球蜜荔在第6天體胚發(fā)生時期，PAO活性大幅度降低，而‘大丁香無明顯變化。多胺具有調(diào)節(jié)細胞生長和分化的作用，而PAO主要參與多胺分解代謝的調(diào)節(jié)活動[4]。前人在對石刁柏體胚發(fā)生的研究中發(fā)現(xiàn)PAO在體胚發(fā)生時期酶活性下降，與本文研究結果一致。在對荔枝合子胚發(fā)育的研究中發(fā)現(xiàn)，正常發(fā)育的胚珠在胚胎發(fā)育各個階段的多胺含量都高于敗育胚珠[22]。多胺可能在荔枝體胚發(fā)生過程中也起到重要作用，而這尚待進一步研究。

綜上所述，可溶性蛋白含量、POD活性與PAO活性的變化，可能與不同培養(yǎng)條件誘導‘新球蜜荔的體胚發(fā)生早晚有關，也與‘新球蜜荔和‘大丁香的體胚發(fā)生效率差異相關。這為進一步研究荔枝體胚發(fā)生機制奠定了一定基礎。

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