陳源 姜翠翠 謝鴻根 郭龍 余文權(quán) 楊道富

摘 要 以柑橘雜交品種葡萄柚、茂谷橘橙果皮為材料，研究超聲波和微波對(duì)柑橘果皮提取物中酚類(lèi)物質(zhì)及其抗氧化活性的影響。結(jié)果表明：葡萄柚果皮中含有豐富的柚皮苷、蘆丁、橙皮素等酚類(lèi)物質(zhì)，茂谷橘橙果皮中含有豐富的槲皮素、川陳皮素、橙皮素等酚類(lèi)物質(zhì)。葡萄柚果皮提取液的抗氧化活性高于茂谷橘橙。葡萄柚果皮超聲波提取液中酚類(lèi)物質(zhì)的含量和抗氧化活性高于微波提取液。柑橘果皮提取物中酚類(lèi)物質(zhì)的含量與其DPPH自由基和羥自由基清除能力呈正相關(guān)。此結(jié)果說(shuō)明超聲波提取法可提高葡萄柚果皮中酚類(lèi)物質(zhì)的提取率和提取液抗氧化能力。

關(guān)鍵詞 柑橘果皮；微波提取；超聲波提取；酚類(lèi)物質(zhì)；抗氧化活性

中圖分類(lèi)號(hào) S666 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

Abstract With scavenging rate of DPPH and hydroxyl radical as the index， we studied the effects of microwave and ultrasonic treatment on the extraction， chemical structure and antioxidation properties of citrus phenolics from grapefruit and Murcott peel. Results showed that naringin， rutin and hesperedin were the predominant phenolics in grapefruit peel. Quercetin， nobiletin， hesperidin were the predominant phenolics in Murcott peel. The content of phenolic compounds and antioxidant activity of ultrasonic extraction was higher than that of microwave extraction. The phenolic content of extraction showed a significantly positive correlation with antioxidant abilities. Ultrasonic treatment obviously improved the phenolic content and antioxidant activity of the grapefruit peel. Grapefruit and Murcott may be used as good natural antioxidants as well as important basic materials of functional foods and biomedicinals.

Key words citrus peels； microwave extraction； ultrasonic extraction； phenolic compounds； antioxidant activity

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2018.04.030

柑橘是全世界第一大類(lèi)水果，也是世界第三大貿(mào)易農(nóng)產(chǎn)品。2015年，我國(guó)柑橘栽培面積位居世界第一，產(chǎn)量居第三位[1]。2015年，全國(guó)柑橘面積251.30萬(wàn)hm2，產(chǎn)量3 660.08萬(wàn)t。在柑橘的鮮食過(guò)程中，占鮮質(zhì)量近一半的果皮大部分被直接丟棄，不僅造成了資源浪費(fèi)，而且污染了環(huán)境。近年來(lái)，柑橘果皮的綜合加工利用漸漸引人注目[2]。酚類(lèi)物質(zhì)是柑橘果皮中主要的活性物質(zhì)，具有強(qiáng)抗氧化性，是活性物質(zhì)及功能性食品領(lǐng)域重要的研究對(duì)象。國(guó)內(nèi)外對(duì)柑橘酚類(lèi)物質(zhì)的研究多集中在甜橙、蜜橘、寬皮橘、葡萄柚、柚、檸檬、酸橙等品種中酚類(lèi)物質(zhì)含量及其抗氧化性的研究上[3-7]。微波、超聲波提取是近年常見(jiàn)的提取方式，具有時(shí)間短、產(chǎn)率高等優(yōu)點(diǎn)，目前廣泛應(yīng)用于植物多酚的浸提[8-9]。葡萄柚和茂谷橘橙是我國(guó)近年來(lái)推廣的柑橘雜交品種。其中，葡萄柚是柚和橙的雜交種，茂谷橘橙是寬皮橘和橙的雜交種。本試驗(yàn)以這2種雜交柑橘的果皮為研究對(duì)象，分析微波和超聲波法提取對(duì)柑橘果皮中酚類(lèi)物質(zhì)浸提效果及其抗氧化活性的影響，旨在為柑橘果皮酚類(lèi)物質(zhì)的高效利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料 本試驗(yàn)所用的材料為葡萄柚（產(chǎn)自福建建甌）和茂谷橘橙（產(chǎn)自福建平和）。先將新鮮的柑橘手工剝皮，再將果皮置于-30 ℃條件下冷凍24 h，冷凍抽真空干燥48 h。將凍干的柑橘果皮用小型的粉碎機(jī)粉碎，過(guò)篩得到60目的干樣粉末。

1.1.2 試劑 標(biāo)準(zhǔn)品沒(méi)食子酸、綠原酸、咖啡酸、丁香酸、香豆酸、蘆丁、阿魏酸、橙皮苷、柚皮苷、水楊酸、槲皮素、川陳皮素、桔皮素、兒茶素、表兒茶素、苯甲酸、白藜蘆醇等均購(gòu)自Sigma公司；無(wú)水乙醇、二苯代苦味?；杂苫―PPH）、鄰苯三酚等試劑均為分析純。

1.1.3 儀器 紫外分光光度計(jì)：TU-1810（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）；L-2000高效液相色譜儀（日本日立公司）；高速萬(wàn)能粉碎機(jī)：FW100（天津泰斯特儀器有限公司）；分析天平：Sartorius BS224S（德國(guó)賽多利斯）；微波爐：G80L20SCL-DG（廣州Galanz公司）；高速冷凍離心機(jī)：ALLEGRATM64R（美國(guó)BECKMAN公司）；FDU-1200冷凍干燥機(jī)（日本EYELA公司）；艾柯超純水系統(tǒng)：AKWL-IV-50（成都康氏康寧科技發(fā)展有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 微波提取 優(yōu)化后的條件：準(zhǔn)確稱取0.5 g柑橘皮粉末，放入100 mL的三角錐瓶中。茂谷橘橙微波條件：加入23.5 mL 80%的乙醇，微波功率640 W，提取時(shí)間35 s，9 000 r/min離心5 min，重復(fù)提取3次[3]。葡萄柚微波提取條件：加入35 mL 80%的乙醇，微波功率160 W，提取時(shí)間50 s，9 000 r/min離心5 min，重復(fù)提取3次。合并上清液，定容[3，10]。用0.22 ?m膜過(guò)濾提取液，收集濾液進(jìn)行抗氧化活性和酚類(lèi)物質(zhì)含量的測(cè)定。

1.2.2 超聲提取 優(yōu)化后的條件：準(zhǔn)確稱取0.5 g柑橘皮粉，放入100 mL的三角錐瓶中。茂谷橘橙超聲波提取的條件：加入35.0 mL 80%的乙醇，提取時(shí)間20 min，9 000 r/min離心5 min，重復(fù)提取3次[11]。葡萄柚超聲波提取的條件：加入19 mL 80%的乙醇，提取時(shí)間21 min，9 000 r/min離心5 min，重復(fù)提取3次。合并上清液，定容。用0.22 ?m膜過(guò)濾提取液，收集濾液進(jìn)行抗氧化活性和酚類(lèi)物質(zhì)含量的測(cè)定[12]。

1.2.3 酚類(lèi)物質(zhì)高效液相色譜（HPLC）分析 根據(jù)液相色譜條件對(duì)柑橘中常見(jiàn)酚類(lèi)物質(zhì)進(jìn)行上樣分析，經(jīng)過(guò)二極管陣列檢測(cè)器測(cè)定，通過(guò)與標(biāo)準(zhǔn)品的比較定性、定量。其中的11種酚類(lèi)物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品分別為綠原酸、香豆酸、阿魏酸、苯甲酸、水楊酸、蘆丁、柚皮苷、橙皮苷、槲皮素、川陳皮素、橘皮素。

色譜條件如下：色譜柱：Merck LiChrospher_100RP18e（250 mm×4.0 mm 5 ?m）；流動(dòng)相：A：2%乙酸-水，B：乙腈；洗脫程序：0～100 min，（A）：84%～30%，（B）：16%～70%；柱溫：30 ℃；流速：0.8 mL/min；進(jìn)樣量：10 ?L；檢測(cè)波長(zhǎng)：0～20 min：230 nm；20～35 min：280 nm；35～42 min：309 nm；42～60 min：280 nm。

1.2.4 DPPH自由基清除能力測(cè)定 參照蔣超等的方法[13]并略作修改。將樣品適當(dāng)稀釋，取3 mL樣品與3 mL 0.1 mg/L DPPH溶液混合，置暗處反應(yīng)30 min，于517 nm處測(cè)定吸光度Ai。同時(shí)測(cè)定0.1 mg/L DPPH溶液與等體積無(wú)水乙醇混合液的吸光度Ac，以及待測(cè)液與等體積無(wú)水乙醇混合液的吸光度Aj。DPPH清除率=[ Ac-（Ai-Aj）/Ac]×100%。試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.5 羥自由基（·OH）清除能力的測(cè)定 利用H2O2和Fe2+發(fā)生Fenton反應(yīng)生成的羥自由基，測(cè)定柑橘果皮提取液對(duì)羥自由基的清除率。參考李維新等的方法[14]，反應(yīng)體系中包含2 mL 2 mol/L 的FeSO4溶液和2 mL 6 mmol/L水楊酸溶液，向其中加入待測(cè)提取液1 mL，再加入2 mL 6 mmol/L 的H2O2，在37 ℃條件下反應(yīng)30 min，以蒸餾水作對(duì)照，在510 nm下測(cè)吸光度，試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理 所有試驗(yàn)均重復(fù)3次，結(jié)果所列數(shù)據(jù)取3次重復(fù)的平均值。采用SPSS 19. 0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用ANOVA進(jìn)行鄧肯氏多重差異分析（p<0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 超聲波和微波對(duì)葡萄柚、茂谷橘橙果皮中酚類(lèi)物質(zhì)含量的影響

由表1可知，葡萄柚果皮超聲波提取液中含量較高的酚類(lèi)物質(zhì)依次為：柚皮苷>蘆丁> 水楊酸>橙皮苷；茂谷橘橙果皮超聲波提取液中酚類(lèi)物質(zhì)的含量依次為：槲皮素>水楊酸>川陳皮素>橘皮素>柚皮苷>蘆丁>阿魏酸>苯甲酸>橙皮苷。微波法測(cè)得的葡萄柚果皮總酚含量和總黃酮含量顯著高于超聲波法（p<0.05），而微波法測(cè)得的茂谷橘橙果皮總酚含量和總黃酮含量與超聲波法相比差異不顯著（p<0.05）。此外，超聲波法提取的葡萄柚果皮中綠原酸、香豆酸、水楊酸、蘆丁、柚皮苷、橙皮苷、槲皮素、川陳皮素、橘皮素等酚類(lèi)物質(zhì)的含量顯著高于微波法（p<0.05）。超聲波法和微波法提取的茂谷桔橙果皮中多數(shù)酚類(lèi)物質(zhì)的含量差異不明顯（p<0.05）。

2.2 DPPH自由基清除率

分別采用超聲波法和微波法得到柑橘果皮提取液中酚類(lèi)物質(zhì)對(duì)DPPH自由基的清除率結(jié)果見(jiàn)圖1。對(duì)DPPH自由基清除能力的順序?yàn)椋浩咸谚殖暡ㄌ崛?茂谷橘橙超聲波提取>葡萄柚微波提取>茂谷橘橙微波提取。超聲波和微波提取物的多酚濃度在20～150 ?g/mL時(shí)，隨著濃度的增大，對(duì)DPPH自由基的清除能力明顯增強(qiáng)，DPPH自由基清除率在一定范圍內(nèi)與樣品的濃度呈劑量效應(yīng)關(guān)系。當(dāng)濃度為150～400 ?g/mL時(shí)，超聲波提取物的DPPH自由基清除率增加速度放緩，同一品種不同提取方法之間清除DPPH自由基能力差異顯著（p<0.05）。

2.3 羥自由基清除率

采用超聲波和微波的方法得到的柑橘果皮提取液對(duì)羥自由基的清除率見(jiàn)圖2。葡萄柚2種方法提取的清除羥自由基能力差異較明顯，超聲波提取法得到的柑橘果皮提取液對(duì)羥自由基的清除率顯著高于微波提取法，提取液中多酚濃度在20～150 ?g/mL時(shí)，隨著濃度的增大，對(duì)羥自由基清除能力明顯增強(qiáng)，對(duì)羥自由基的清除能力在一定范圍內(nèi)與提取物的總酚濃度呈劑量效應(yīng)關(guān)系。當(dāng)濃度為150～400 ?g/mL時(shí)，超聲波提取物的DPPH清除率增加速度放緩。超聲波法和微波法得到的茂谷橘橙果皮提取液對(duì)羥自由基的清除率差異不顯著（p<0.05）。

2.4 酚類(lèi)物質(zhì)含量與抗氧化活性之間的相關(guān)性

葡萄柚和茂谷橘橙超聲波微波提取中總酚、總黃酮和清除DPPH能力、清除羥自由基能力的相關(guān)系數(shù)（R）見(jiàn)表2。葡萄柚和茂谷橘橙果皮中總酚和總黃酮含量呈極顯著正相關(guān)關(guān)系（p<0.01）， 總酚和總黃酮含量與羥自由基清除率呈顯著正相關(guān)關(guān)系（p<0.05）。這表明柑橘果皮中總酚和總黃酮含量和羥自由基清除能力基本趨于一致，清除羥自由基能力強(qiáng)的其總酚和總黃酮含量也高，能力弱的其總酚和總黃酮含量也較低。

3 討論

3.1 葡萄柚和茂谷橘橙果皮中酚類(lèi)物質(zhì)的組成和含量

酚類(lèi)物質(zhì)是柑橘果實(shí)中主要的生物活性物質(zhì)，主要包括類(lèi)黃酮、酚酸和多甲氧基類(lèi)黃酮等。研究表明，不同品種的柑橘果實(shí)中酚類(lèi)物質(zhì)組成和含量有較大差異[15-16]。寬皮橘中類(lèi)黃酮以柚皮苷、蘆丁、橙皮苷為主，大翼橙類(lèi)和柚類(lèi)中類(lèi)黃酮以柚皮苷為主，葡萄柚中類(lèi)黃酮以新橙皮苷、柚皮苷、圣次草苷為主[17-21]。酚酸主要以肉桂酸型酚酸為主。寬皮橘中酚酸含量排列順序?yàn)椋喊⑽核?香豆酸和咖啡酸>芥子酸[22]。柚果實(shí)中以阿魏酸含量最高，其次是香豆素、咖啡酸和芥子酸[23]。多甲氧基黃酮是柑橘特有的高度甲基化的黃酮類(lèi)化合物，具有良好的抗氧化、抗炎、治療心血管疾病、降血脂和改善胰島素分泌等多種功能[24]。甜橙果皮中多甲氧基黃酮主要是川陳皮素，其次是橙黃酮和橘皮素[25]。葡萄柚果實(shí)中多甲氧基黃酮主要以橘皮素為主[7]。

本研究結(jié)果表明，葡萄柚果皮中類(lèi)黃酮以柚皮苷、蘆丁、橙皮苷和槲皮素為主，茂谷橘橙果皮主要以槲皮素、柚皮苷、蘆丁和橙皮苷為主。葡萄柚果皮中酚酸含量排列順序?yàn)樗畻钏?綠原酸>苯甲酸。兩個(gè)品種果皮中多甲氧基黃酮均以川陳皮素和橘皮素為主。果皮酚類(lèi)物質(zhì)的組成和含量測(cè)定結(jié)果表明，茂谷橘橙兼有橙類(lèi)和寬皮橘類(lèi)品種的特點(diǎn)，葡萄柚兼有橙類(lèi)和柚類(lèi)品種的特點(diǎn)。

3.2 超聲波法和微波法對(duì)酚類(lèi)物質(zhì)和其抗氧化活性的影響

不同的提取方式得到的提取液，其酚類(lèi)物質(zhì)含量不同，因此適當(dāng)?shù)奶崛l件是獲得高含量酚類(lèi)物質(zhì)的重要因素之一[27]。微波法主要通過(guò)加熱使細(xì)胞內(nèi)的極性物質(zhì)尤其是水分子發(fā)生偶極旋轉(zhuǎn)，液態(tài)水汽化產(chǎn)生的壓力沖破細(xì)胞膜和細(xì)胞壁，從而使胞外溶劑更容易進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，增加了與目標(biāo)物的可及性，提高了傳質(zhì)的推動(dòng)力[28]。超聲波提取法不僅具有微波的熱效應(yīng)，同時(shí)還具有機(jī)械和空化效應(yīng)，通過(guò)增大介質(zhì)分子的運(yùn)動(dòng)速度、穿透力，使有效成分呈游離狀態(tài)并溶入提取介質(zhì)中。研究表明低超聲輻射面和超聲能量能顯著影響咖啡酸的穩(wěn)定性，增加其抗氧化性，同時(shí)低頻超聲波處理能增加溫州蜜柑、琯溪蜜柚等柑橘果皮中酚類(lèi)物質(zhì)的析出[28-32]。溫州蜜柑、琯溪蜜柚果皮提取物的抗氧化性可能與總酚有關(guān)[31-32]。聶超等人利用加熱浸提法對(duì)甜橙果皮中黃烷酮和多甲氧基黃酮的影響及其抗氧化活性進(jìn)行研究，結(jié)果表明甜橙果皮抗氧化性與提取物中總黃酮含量呈極相關(guān)[33]。秦艷利用傳統(tǒng)溶劑法提取臍橙果皮中多酚物質(zhì)，結(jié)果表明光照強(qiáng)度、溫度、pH值等不同的處理因素會(huì)影響臍橙果皮中多酚的含量，臍橙果皮中多酚含量與其抗氧化性相關(guān)性較強(qiáng)，臍橙果皮的抗氧化性會(huì)隨著多酚含量的改變而發(fā)生較大的變化[34]。前人的研究集中在不同方法對(duì)寬皮橘、柚和橙類(lèi)品種的果皮或皮渣中總酚、總黃酮、咖啡酸和酚酸等物質(zhì)提取的影響。雜交種果皮中含有更為多樣的酚類(lèi)物質(zhì)，因此本研究比較超聲波和微波提取方法對(duì)葡萄柚與茂谷橘橙果皮中酚類(lèi)物質(zhì)的提取及抗氧化活性的影響，結(jié)果表明：葡萄柚果皮超聲波提取液中總黃酮、總酚、11種酚類(lèi)物質(zhì)得率和羥自由基清除率顯著高于微波提取得率，超聲波提取較微波提取能更有效提取葡萄柚果皮中的酚類(lèi)物質(zhì)，而茂谷橘橙果皮超聲提取和微波提取酚類(lèi)物質(zhì)得率、DPPH和羥自由基清除率差異不顯著。酚類(lèi)物質(zhì)提取的最佳條件與獲得最高抗氧化活性的提取條件一致，葡萄柚和茂谷橘橙果皮酚類(lèi)物質(zhì)的組成和抗氧化活性呈正相關(guān)。

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