郝向陽 孫雪麗 王天池 呂科良 賴鐘雄 程春振

摘 要 苯丙氨酸解氨酶（phenylalanine ammonia lyase，PAL）是苯丙烷類代謝途徑的關(guān)鍵酶和限速酶。苯丙烷類代謝與植物生長發(fā)育密切相關(guān)，其產(chǎn)物如木質(zhì)素、植保素、黃酮類物質(zhì)等是植物抗逆防御反應(yīng)所不可或缺的，因此PAL又常被用作衡量植物抗逆性強(qiáng)弱的重要指標(biāo)。本文就植物PAL基因和蛋白結(jié)構(gòu)特征、分布情況及其在植物生長發(fā)育與抗逆性防御中的作用等方面的研究進(jìn)行了綜述，以期為今后植物苯丙氨酸解氨酶的研究及應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞 苯丙氨酸解氨酶；特征；生長發(fā)育；抗逆防御

中圖分類號 S184； Q71 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A

Abstract Phenylalanine ammonia lyase （PAL） catalyzes the first and committed reaction of plant growth and development indispensable phenylpropanoid pathway. The products of phenylpropanoid pathway， such as lignin， phytoalexin and flavonoids were all identified to be crucial for plant defense and resistance. Therefore， PAL activity is often used as one of the important indices for plant resistance evaluation. In the present review， we summarized the studies on the characteristics of PAL genes and the encoded proteins， and the roles in plant growth， development and resistance responses， which could provide a theoretical basis for the future researches and utilization of plant PALs.

Keywords phenylalanine ammonialyase； characteristics； growth and development； defense and resistance

DOI 10.3969/j.issn.1000-2561.2018.07.028

苯丙烷類代謝是植物次生代謝的一條重要途徑，其直接或間接產(chǎn)生了植物所有的含苯丙烷骨架的物質(zhì)，如木質(zhì)素、植保素、黃酮類物質(zhì)等[1-2]。其中，由肉桂醛的氧化聚合而形成的木質(zhì)素占木質(zhì)部干重的1/3左右，是植物細(xì)胞壁的重要組成成分和植物的重要結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)物質(zhì)、在植物生長發(fā)育和抗逆防御反應(yīng)過程中發(fā)揮著重要作用；植保素是植物重要的化學(xué)防御物質(zhì)，其在植物中以黃酮類、雙苯類、倍半萜類、吲哚類、香豆素類、環(huán)二酮類、生物堿類等多種類型存在，是植物維持正常生長發(fā)育和響應(yīng)脅迫的重要物質(zhì)；黃酮類物質(zhì)是一類重要的酚類物質(zhì)，在調(diào)節(jié)植物生長、豐富植物顏色、清除活性氧、提高植物抗氧化能力等方面發(fā)揮著重要作用[3]。

苯丙氨酸解氨酶（phenylalanine ammonia lyase，PAL）是苯丙烷類代謝途徑的第一種酶[4]，并能催化L-苯丙氨酸（L-Phe）脫氨生成反式肉桂酸，是許多次級代謝產(chǎn)物的直接或間接前體[5]。大量研究表明PAL活性與木質(zhì)素、花青素、黃酮、類黃酮等的積累呈顯著正相關(guān)，說明其在調(diào)節(jié)次級代謝產(chǎn)物的生成、維持植物正常生長發(fā)育及提高植物抗逆能力方面發(fā)揮著重要作用[6-9]。因此，系統(tǒng)而全面地了解植物PAL的功能及作用機(jī)制意義重大。

本文對植物PAL基因結(jié)構(gòu)特征、PAL蛋白序列和分布特征以及它們在植物生長發(fā)育與抗逆性防御方面的作用等方面的研究進(jìn)行了系統(tǒng)綜述。

1 植物PAL基因結(jié)構(gòu)特征

植物PAL基因CDS長度一般為2 100 bp，編碼約含700 aa的蛋白質(zhì)。植物PAL gDNA序列大多包含1個內(nèi)含子和2個外顯子，其中2個外顯子長度相對保守，分別約為400 bp和1 700 bp。不同植物PAL內(nèi)含子長度差異較大，比如，甜菜的PAL基因內(nèi)含子長度達(dá)2 986 bp，而豌豆的PAL2基因內(nèi)含子長度則僅為90 bp（表1）。一些裸子植物如馬尾松和火炬松PAL gDNA則不含內(nèi)含子。微生物的PAL基因結(jié)構(gòu)與植物差異較大，有些含有多個內(nèi)含子，如粘紅酵母（Rhodotorula toruloides）PAL基因含有6個內(nèi)含子[10]。不同植物PAL gDNA內(nèi)含子的位置和兩端堿基大致相同，大多插入于編碼精氨酸三連密碼子的第2個和第3個堿基間[11-12]。植物PAL基因啟動子大多包含在苯丙烷類代謝途徑相關(guān)基因的啟動子中廣泛存在的、決定基因木質(zhì)部特異性表達(dá)的關(guān)鍵作用元件Box L、Box A和Box P等[11， 13]。此外，能夠被一些MYB轉(zhuǎn)錄因子識別并結(jié)合的AC元件也廣泛存在于PAL基因的啟動子中，在調(diào)控木質(zhì)素合成過程中發(fā)揮著重要作用[14-16]，且MYB還參與調(diào)控苯丙烷代謝途徑及PAL的組織特異性表達(dá)[17-18]。

2 植物PAL蛋白特征

2.1 植物PAL蛋白序列特征

植物PAL蛋白在植物中數(shù)量差異較大，但分子量卻相差不大，大多介于275～330 ku之間[19-21]。植物PAL蛋白保守性極高，不同物種間PAL的相似度甚至可高達(dá)80%[11]。以不同植物PAL蛋白序列構(gòu)建進(jìn)化樹，可以將植物PAL大致分為雙子葉植物、單子葉植物、裸子植物、蕨類植物四類（圖1）。除少數(shù)特例外（如萵苣是單子葉植物但其PAL卻與雙子葉植物聚在一起，而白樺是雙子葉植物其PAL卻與蕨類植物聚為一類），聚類結(jié)果基本與植物分類結(jié)果相符[22]，暗示PAL具有用于植物進(jìn)化和分類研究的潛力。

植物PAL一般都包含保守的PLN02457、phe_ am_lyase、Lyase_aromatic和PAL-HAL結(jié)構(gòu)域，此外，有些植物的PAL還含有特異或非特異性HutH結(jié)構(gòu)域。PAL酶活性位點(diǎn)存在于PAL-HAL結(jié)構(gòu)域上，且大都含有GTITASGDLVPLSYIAG酶活性中心序列，其中ASG是植物PAL最典型的保守區(qū)域（圖2）。ASG氨基酸三聯(lián)體可以通過自身環(huán)化脫水而自動轉(zhuǎn)化為MIO作為PAL的一個重要輔助因子發(fā)揮作用[11]。

2.2 植物PAL蛋白分布特征

植物PAL的含量隨著細(xì)胞壁中木質(zhì)素含量的積累而升高。Rubery和Nothcote[23]的研究發(fā)現(xiàn)在木質(zhì)化組織中PAL活性較高，而在非木質(zhì)化組織中則幾乎檢測不到PAL活性。PAL在木質(zhì)素含量高的組織器官中的高活性除了與PAL參與木質(zhì)素的合成有關(guān)外，還可能與PAL基因啟動子有關(guān)[24]。

PAL的分布與細(xì)胞分化程度有關(guān)。在愈傷組織分化的過程中PAL活性增強(qiáng)，隨著分化程度的加深PAL活性有所降低，在老化的愈傷組織中PAL基本失活。

PAL基因的表達(dá)具有組織器官特異性。大多數(shù)植物PAL基因在成熟的花中和根部表達(dá)量較高，莖中表達(dá)水平中等，而在成熟的葉片中幾乎不表達(dá)。但一些植物中也存在不同的表達(dá)模式，如鼠尾草PAL1基因在葉中的表達(dá)量最高，而在莖和根中的表達(dá)量較低[11]。

PAL是一種胞內(nèi)酶。在細(xì)胞水平上，PAL主要分布在植物微管組織細(xì)胞以及表皮下的細(xì)胞中[25]。Razzaque等[26]發(fā)現(xiàn)，PAL定位于高爾基體囊泡和次生壁加厚層中。研究發(fā)現(xiàn)草本植物PAL還具有酪氨酸解氨酶（TAL）活性，Barros等[27]通過13C同位素標(biāo)記發(fā)現(xiàn)二穗短柄草PAL通過其TAL活性參與了近一半木質(zhì)素的合成，說明PAL在木質(zhì)素合成和細(xì)胞壁代謝過程中發(fā)揮著重要作用。巧合的是草本植物細(xì)胞壁中紫丁香基木質(zhì)素和酯化香豆酸含量顯著高于PAL不具TAL活性的雙子葉植物，暗示PAL活性影響細(xì)胞壁組成[28]。在亞細(xì)胞水平上，植物PAL主要分布于細(xì)胞質(zhì)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)以及葉綠體等中（表2）。然而，不同的PAL異構(gòu)酶亞細(xì)胞定位的結(jié)果也不同，如煙草NtPAL1主要定位于細(xì)胞內(nèi)膜，負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)肉桂酸的累積；而NtPAL2則主要定位于細(xì)胞質(zhì)，負(fù)責(zé)將積累的肉桂酸擴(kuò)散到細(xì)胞質(zhì)中[28]。

3 PAL在植物生長發(fā)育與抗逆防御反應(yīng)中的作用

在雙子葉植物中，PAL可以催化L-Phe非氧化脫氨形成反式肉桂酸。在單子葉植物中，PAL除了催化L-Phe脫氨外，還具有TAL活性，可催化L-酪氨酸轉(zhuǎn)化成對香豆酸[27， 34-35]。眾多研究表明PAL在植物生長發(fā)育和抗逆防御過程中發(fā)揮著重要作用。

3.1 PAL在植物生長發(fā)育過程中的作用

植物PAL可通過調(diào)控苯丙烷類代謝途徑產(chǎn)生木質(zhì)素。木質(zhì)素是植物維管束的結(jié)構(gòu)成分，可為植物提供機(jī)械支持和產(chǎn)生疏水環(huán)境，在水和營養(yǎng)物質(zhì)運(yùn)輸過程中起重要作用[36]。

眾多研究表明PAL過表達(dá)或不表達(dá)都會對植物的生長發(fā)育產(chǎn)生不良的影響，其對植物生長發(fā)育的影響主要與PAL參與木質(zhì)素的合成有關(guān)。Shadle等[37]發(fā)現(xiàn)PAL的過表達(dá)除了會使木質(zhì)素含量明顯增加外，還會使植物表現(xiàn)出生長速率降低和開花延遲等癥狀。而PAL基因的沉默或破壞，會導(dǎo)致植物木質(zhì)素含量下降，木質(zhì)素單體發(fā)生變化，植物表現(xiàn)異常，例如局部熒光病變、葉片形狀和紋理變化、植物發(fā)育遲緩、花粉活力下降、花的形態(tài)變化和色素沉著等。在擬南芥中，PAL1和PAL2單突變體沒有明顯的表型變化，而PAL1/PAL2雙基因突變體植物則表現(xiàn)為高度不育，木質(zhì)素積累顯著減少和次生壁超微結(jié)構(gòu)的改變[38]。蓮藕PAL1基因的過表達(dá)和抑制表達(dá)會導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因植株P(guān)AL活性、根和結(jié)節(jié)中木質(zhì)素含量和細(xì)胞壁厚度的變化，引起根和結(jié)節(jié)的結(jié)構(gòu)變化[39]。劉佳等[8]的研究指出裸仁美洲南瓜不具種皮可能與其較低的PAL活性引起的木質(zhì)素含量降低有關(guān)。

3.2 PAL在植物抗逆防御反應(yīng)中的作用

PAL影響植物木質(zhì)素、植保素、黃酮類物質(zhì)等物質(zhì)的合成，這些物質(zhì)在植物響應(yīng)生物和非生物脅迫過程中發(fā)揮著重要作用[40]。研究發(fā)現(xiàn)植物PAL活性受水楊酸（SA）和茉莉酸甲酯（MeJA）等誘導(dǎo)[41-42]。SA是植物抗逆反應(yīng)中的關(guān)鍵物質(zhì)，而MeJA則能促使細(xì)胞從初級代謝向次級代謝轉(zhuǎn)變，提高植物抗逆性[43-44]。SA和MeJA等物質(zhì)對PAL的誘導(dǎo)作用暗示它們對植物抗性的影響在一定程度上是依賴PAL實(shí)現(xiàn)的。

3.2.1 PAL參與植物抗病防御反應(yīng) PAL常被用作評價(jià)植物抗病能力的重要生化指標(biāo)，在植物抗病防御反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用。Shadle等[37]發(fā)現(xiàn)過表達(dá)PAL的轉(zhuǎn)基因煙草對煙草尾孢病原菌抗性顯著高于非轉(zhuǎn)基因?qū)φ?。過表達(dá)PAL的蓮藕轉(zhuǎn)基因植株根瘤菌侵染速度延緩，結(jié)節(jié)數(shù)減少[39]。此外，研究發(fā)現(xiàn)PAL活性與香蕉枯萎病抗性[22]、蘋果灰霉病抗性[45]及棉花黃萎病抗性等[46]正相關(guān)，與玉米小斑病抗性[47]、小麥赤霉病抗性[48]負(fù)相關(guān)，而與大麥對粉狀霉菌的抗性相關(guān)性不大。

植物感病后PAL活性變化也因植物抗病能力和病害種類而異。大多數(shù)植物感病后PAL活性多呈“初級緩慢上升、隨后急劇上升、之后急劇下降”的趨勢，例如，油菜感染黑脛病、小麥感染白粉病和赤霉病、甘蔗感染黑穗病后PAL活性變化均具有以上特點(diǎn)。部分植物感染病原菌后PAL會呈現(xiàn)多個活性高峰，如于洪久等[49]發(fā)現(xiàn)不同抗、感品種的大豆感染腐霉菌后，均會出現(xiàn)PAL活性升高、次生代謝物（木質(zhì)素等）含量升高及細(xì)胞壞死現(xiàn)象，其中PAL活性均會呈現(xiàn)出“升-降”趨勢，但抗性品種PAL活性會出現(xiàn)兩個峰值，且高于感病品種。此外，研究還發(fā)現(xiàn)植物染病后PAL活性變化還與病原菌致病性有關(guān)。如：Loschke等[50]指出致病的茄病鐮刀菌（Fusarium solanig. pisi）引起的豌豆PAL活性的升高比非致病菌高50%。

3.2.2 PAL參與植物抗蟲反應(yīng) 當(dāng)植物遭受蟲害時，會刺激植物啟動或加強(qiáng)苯丙烷類代謝，使受害部位PAL活性增強(qiáng)，導(dǎo)致木質(zhì)素在細(xì)胞壁內(nèi)大量累積、細(xì)胞壁增厚，進(jìn)而阻止蟲害蔓延，同時PAL活性的增強(qiáng)還可以提高植保素含量進(jìn)而趨避和毒害食草性昆蟲，減輕蟲害。還有研究指出植株被昆蟲取食后不僅誘導(dǎo)自身PAL基因表達(dá)水平和PAL活性增強(qiáng)，還能誘導(dǎo)鄰近植株P(guān)AL活性增加，使自身和鄰近植株抗性增強(qiáng)[51-52]。此外，昆蟲取食對PAL活性的影響還與物種抗性水平有關(guān)，且植株體內(nèi)的PAL活性與蚜量及受害面積呈顯著負(fù)相關(guān)，與物種抗性水平呈正相關(guān)[53-54]。

3.2.3 PAL可通過調(diào)節(jié)類黃酮類物質(zhì)代謝參與植物抗UV反應(yīng) PAL是植物黃酮類化合物和酚類物質(zhì)合成代謝的起始酶，研究發(fā)現(xiàn)UV-B輻射誘導(dǎo)PAL活性增加，促進(jìn)相關(guān)次生代謝物的合成，使植物葉表皮產(chǎn)生大量黃酮類化合物、酚類物質(zhì)和一些酸類物質(zhì)[55]。其中，黃酮類化合物在植物形成了一道理想的天然屏障可以保護(hù)植物組織并減少UV對植物的損害[55]，酚類物質(zhì)則可有效地過濾UV輻射，減少UV輻射對植物的損害[56]。研究表明，較低劑量UV輻射可以提高植物PAL活性及黃酮類化合物和類黃酮含量，而長時間大劑量的UV-B輻射則會引起包括PAL在內(nèi)的保護(hù)酶活性的降低甚至失活，從而影響植物正常的生長發(fā)育[57-58]。

3.2.4 PAL在植物響應(yīng)機(jī)械損傷過程中起重要作用 植物遭受機(jī)械損傷后，PAL基因表達(dá)量和PAL活性升高，并能迅速合成酚類、黃酮類等次生代謝物質(zhì)，參與傷口愈合反應(yīng)，同時還能夠起到抵抗昆蟲或病菌入侵的作用[59]。Peiser等[60]的研究發(fā)現(xiàn)生菜切割部位PAL活性的增加、酚類物質(zhì)的積累、切口褐化，而使用PAL抑制劑AIP和AOPP則可以減輕褐化，因此指出切口的褐變是由多酚氧化酶與PAL誘導(dǎo)產(chǎn)生的酚類物質(zhì)反應(yīng)引起的。劉盟盟等[61]的研究發(fā)現(xiàn)冷蒿受到機(jī)械損傷后PAL活性升高，且PAL活性與機(jī)械損傷程度正相關(guān)，同時還伴隨著阿魏酸和肉桂酸等含量的增加、枝葉的硬度的升高，說明機(jī)械損傷促進(jìn)了抗氧化物質(zhì)酚酸的積累，為木質(zhì)素和單寧的合成提供了原料從而提高了冷蒿抗機(jī)械損傷的能力。

3.2.5 PAL在植物響應(yīng)重金屬脅迫過程中發(fā)揮著重要作用 植物在較低濃度重金屬脅迫條件下PAL活性增加，合成較多的木質(zhì)素、植保素等次生代謝產(chǎn)物來抵御傷害，但當(dāng)金屬濃度過高或次級代謝產(chǎn)物積累到一定量后會抑制植物PAL活性[62]。不同的金屬對PAL活性產(chǎn)生的影響不同，如丁薪源等[63]發(fā)現(xiàn)Cu2+對冬棗果實(shí)PAL激活作用最強(qiáng)，而Na+的激活作用最弱；Al3+對PAL抑制作用最強(qiáng)，K+的抑制作用最弱，且離子濃度越高，抑制能力越強(qiáng)；孫紅梅等[64]的研究發(fā)現(xiàn)Cu2+、Fe2+、Fe3+對百合鱗莖的PAL活性有不同程度的促進(jìn)作用，隨著金屬濃度的升高，Na+對百合鱗莖PAL活性的影響由抑制變?yōu)榇龠M(jìn)，而Mg2+則由促進(jìn)變?yōu)橐种疲环厄v等[65]的研究指出Na+、Mg2+、Ca2+可同時對胡蘿卜PAL活性有抑制作用。此外，金屬濃度也會影響PAL活性，如低濃度 Hg2+（≤0.1 mmol/L）對小麥幼苗的PAL活性有短暫的促進(jìn)作用，而高濃度Hg2+（≥0.2 mmol/L）則顯著抑制PAL活性[62]。

3.2.6 PAL參與植物營養(yǎng)脅迫應(yīng)答 營養(yǎng)狀況會影響植物PAL活性以及木質(zhì)素、花青素、異黃酮的含量。郭世乾等[66]的研究發(fā)現(xiàn)氮磷肥施用過多會抑制南果梨PAL活性、降低花青素含量，同時他們還指出施鉀、鐵肥，不施氮磷肥有利于PAL活性和花青素含量的提高。冷平生等[67]的研究發(fā)現(xiàn)PAL活性與異黃酮含量呈正相關(guān)，不同時期施用不同劑量的氮、磷肥能促進(jìn)銀杏萜類內(nèi)脂的合成與積累。李衛(wèi)東等[68]的研究則指出中量施用磷肥對紅三葉PAL活性具有較好的調(diào)控效果并且有利于異黃酮的積累。

3.2.7 PAL參與植物溫度脅迫應(yīng)答 低溫脅迫下PAL表達(dá)量和酶活呈現(xiàn)出相同的變化趨勢[69-70]。低溫不僅可以誘導(dǎo)PAL活性升高，提高查爾酮合成酶（CHS）活性、促進(jìn)花青素大量合成，還能提高胞內(nèi)抗氧化酶活性、維持AsA氧化還原狀態(tài)，進(jìn)而緩解低溫引起的光損傷和氧化損傷[71-72]。周玉嬋等[73]發(fā)現(xiàn)，低溫脅迫能促進(jìn)菠蘿綠原酸、咖啡酸的合成積累，加速了果實(shí)褐變和黑心病的出現(xiàn)。Shang等[24]的研究發(fā)現(xiàn)黃瓜CsPALs基因受不同程度低溫的誘導(dǎo)，各成員間在低溫脅迫應(yīng)答中存在高度的功能冗余。低溫脅迫下PAL基因突變或使用抑制劑會抑制PAL活性，會導(dǎo)致植物體內(nèi)木質(zhì)素、類黃酮等次生代謝產(chǎn)物合成受阻，含量降低[74]。

PAL在植物響應(yīng)高溫脅迫過程中也發(fā)揮著重要作用。Pan等[75]的研究表明，熱脅迫能夠誘導(dǎo)PAL活性增加，再通過苯丙烷類代謝途徑合成SA進(jìn)而保護(hù)許多植物免受熱應(yīng)激損傷。

3.2.8 其他 在干旱條件下，植物PAL活性變化較大，暗示PAL在植物抵御干旱脅迫過程中發(fā)揮著作用。王改利等[76]的研究發(fā)現(xiàn)酸棗葉片中PAL活性在中度和重度干旱條件下均高于對照，同時還指出中度干旱可以促進(jìn)黃酮類物質(zhì)的積累。

很多研究指出一定程度的鹽脅迫可以誘導(dǎo)植物PAL活性增強(qiáng)和類黃酮等次級代謝產(chǎn)物的積累[77]。郭偉等[3]的研究發(fā)現(xiàn)鹽堿脅迫能夠增加小麥PAL的活性和根系活躍吸收面積，因而增大根系活力、提高了小麥抗鹽堿脅迫的能力。

此外，研究發(fā)現(xiàn)植物PAL基因表達(dá)和PAL活性受激素影響較大，其中乙烯的誘導(dǎo)效果最好，而GA誘導(dǎo)效果不明顯甚至使酶活性降低[78]。外源乙烯不僅可以誘導(dǎo)PAL酶活性增加以及促進(jìn)次生代謝產(chǎn)物的積累，而且還能顯著提高PAL基因的表達(dá)，而乙烯抑制劑1-MCP則可以抑制PAL活性、而且能夠延緩果實(shí)衰老[79-80]。

4 問題與展望

綜上所述，PAL是一個多基因編碼的蛋白家族，進(jìn)化上相對保守，其表達(dá)具有組織特異性。同時，PAL作為連接初級代謝和苯丙烷類代謝、催化苯丙烷類代謝第一步反應(yīng)的限速酶，對植物的正常生長發(fā)育至關(guān)重要[20]。植物PAL活性的高低與次生代謝產(chǎn)物如木質(zhì)素、植保素、黃酮類物質(zhì)等的含量密切相關(guān)，這些次生代謝產(chǎn)物是植物生長發(fā)育和抗逆防御過程所不可或缺的。眾多研究指出PAL基因及其蛋白的表達(dá)水平受多種因素影響[81-82]，說明可以通過合理利用現(xiàn)有知識和技術(shù)手段調(diào)節(jié)PAL活性來維持或促進(jìn)植物生長發(fā)育、提高植物抗性。本文可為理解PAL功能和今后合理利用PAL提供理論依據(jù)。

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