馬若影 李幼梅 鄧志勇 陳逸婷 邢燕妮 白新鵬

摘 要 為了提高紅心火龍果莖多糖的純度，并了解大孔樹脂處理對多糖抗氧化活性的影響，本研究以多糖脫色除蛋白的效果和多糖保留率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，從6種大孔樹脂中篩選出最佳脫色效果的樹脂，以單因素試驗(yàn)為基礎(chǔ)通過正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)對大孔樹脂脫色除蛋白工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，并進(jìn)行抗氧化活性研究。結(jié)果表明，AB-8樹脂效果最佳，最佳工藝條件為：樹脂用量0.6 g/mL，溫度60 ℃，pH為5，時(shí)間2 h。此條件下得到的脫色率、蛋白去除率和多糖保留率分別為76.51%、88.29%和83.47%?？寡趸钚詫?shí)驗(yàn)結(jié)果表明，火龍果莖多糖具有一定的抗氧化能力，大孔樹脂處理后其抗氧化活性有所提高。

關(guān)鍵詞 紅心火龍果莖；多糖；大孔樹脂；脫色；除蛋白；抗氧化活性

中圖分類號(hào) TQ281 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

Abstract In order to improve the purity of polysaccharide， six kinds of resins were uesd in this study. Based on the decolorization and deproteinization rate， a suitable resin was selected and process parameters were optimized. The effect of macroporous resin on the antioxidant activity of polysaccharides was studied. AB-8 was better than the other five resins. Decolorization and deproteinization experiments were carried out by single factor and orthogonal experiments. The optimum technological conditions are as follows： liquid/solid ratio 0.6 g/mL， temperature 60℃， pH 5.0 ， and time 2.0 h . Under the conditions the polysaccharide retention， the decolorization rate and the deproteinization rate was 86.46%， 93.39% and 98.32%， respectively. The antioxidant activity of polysaccharide was enhanced after decoloring by macroporous resin.

Keywords red pitaya stem； polysaccharide； macroporous resin； decolorization； deproteinization； antioxidative activity

DOI 10.3969/j.issn.1000-2561.2018.07.006

火龍果（Hylocereus undatus）又稱紅龍果、仙蜜果等，屬仙人掌科，起源于美洲，富含糖、有機(jī)酸、蛋白質(zhì)、維生素等營養(yǎng)物質(zhì)，是一種具有高營養(yǎng)保健價(jià)值的熱帶水果[1-3]。因此，火龍果作為功能成分的來源，提供可能預(yù)防相關(guān)疾病的營養(yǎng)素，有利于改善消費(fèi)者的身心健康[4]。目前我國關(guān)于紅心火龍果的研究屢見不鮮，但火龍果莖的研究較少，其產(chǎn)業(yè)仍處于起步階段，有著廣闊的發(fā)展前景。據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，火龍果莖中含豐富的植物性多糖，具有美白、保濕、抗氧化等多種活性作用[5-6]。

火龍果莖經(jīng)提取后，獲得的粗多糖仍含有少量雜質(zhì)，如蛋白質(zhì)、色素等。傳統(tǒng)的除蛋白脫色的方法有鹽析法、等電點(diǎn)沉淀法、有機(jī)溶劑法、酶解法等；脫色方法有活性炭吸附、過氧化氫脫色和透析等，這些方法各具特點(diǎn)，但易破壞多糖結(jié)構(gòu)，影響其活性，且不可應(yīng)用于食品級(jí)多糖的生產(chǎn)[7]。大孔樹脂擁有穩(wěn)定的理化性質(zhì)和良好的吸附效果，操作和再生簡易，價(jià)格便宜，且保留多糖基本性質(zhì)，因此被廣泛應(yīng)用于天然產(chǎn)物的分離純化[8-9]。大孔樹脂已被應(yīng)用于木糖等單糖的生產(chǎn)純化過程[10]。藍(lán)海波等[11]關(guān)于龍眼多糖脫色除蛋白的研究中，采用D301-R樹脂進(jìn)行優(yōu)化試驗(yàn)獲得較高的多糖保留率（93.37%）。趙肖通等[12]篩選出D3520樹脂對姬松茸多糖脫色，脫色率可高達(dá)88.5%。古靜燕等[13]篩選出LS-46D樹脂去除金針菇粗多糖中的蛋白，使多糖純度從22.4%提高到58.3%。本研究篩選出火龍果莖多糖純化的理想大孔樹脂，以單因素試驗(yàn)為基礎(chǔ)，通過正交試驗(yàn)優(yōu)化得到最佳脫色除蛋白工藝條件，并比較大孔樹脂處理前后火龍果莖多糖的抗氧化活性，既有助于進(jìn)一步研究火龍果莖多糖，也給工業(yè)化生產(chǎn)提供一定技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料

火龍果莖（凍干粉）是由海南省東方市北緯十八度果業(yè)有限公司提供的大紅二號(hào)果實(shí)果莖；大孔樹脂：南開大學(xué)化工廠、滄州寶恩化工有限公司，試驗(yàn)中用到的其他常規(guī)試劑均為分析純。

GL-20G-II型高速冷凍離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；85-1恒溫磁力攪拌器，常州澳華儀器有限公司；SHZ-B水浴恒溫震蕩器，上海龍躍儀器設(shè)備有限公司；FDU-2100冷凍干燥機(jī)，埃朗科技國際貿(mào)易（上海）有限公司；RE52CS旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；723PC可見分光光度計(jì)，上海奧普勒儀器有限公司；EL204型電子天平，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；亞臨界裝置，實(shí)驗(yàn)室自主研制。

1.2 方法

1.2.1 多糖的提取 采用亞臨界裝置提取火龍果莖多糖[14]：火龍果莖凍干粉按料液比1：50加入蒸餾水復(fù)水20 min，140 ℃提取25 min，離心后取上清液旋蒸濃縮并加入無水乙醇至乙醇體積分?jǐn)?shù)為80%，4 ℃靜置沉淀12 h，然后于6 000 r/min的條件下離心5 min，保留沉淀，凍干后按實(shí)驗(yàn)需要進(jìn)行復(fù)溶備用。

1.2.2 大孔樹脂的預(yù)處理 用去離子水溶脹后去除浮在水表的大孔樹脂，將篩選出的大孔樹脂浸泡于5%HCl 24 h，水洗至pH為7后置于70%乙醇中24 h，去離子水洗至無白色渾濁現(xiàn)象后轉(zhuǎn)移到濃度為700 mg/L的NaOH中靜置24 h，水洗至中性后室溫下干燥，備用[15]。

1.2.3 分析方法 多糖保留率：計(jì)算公式為多糖保留率=（CT1–CR1）/（CT0–CR0）×100%，式中，CT0、CT1分別為吸附前后的總糖含量（mg/g）；CR0、CR1分別為吸附前后的還原糖含量（mg/g）。采用苯酚硫酸法測總糖含量[16]，采用3，5-二硝基水楊酸法測還原糖含量[17]。

蛋白質(zhì)去除率：采用考馬斯亮藍(lán)法測定蛋白質(zhì)含量[18]。蛋白質(zhì)去除率=（No1–No2）/No1×100%，式中，No1和No2分別為吸附前后的蛋白質(zhì)含量（mg/g）。

脫色率測定：多糖溶液pH調(diào)節(jié)至6.5±0.1，8 000 r/min離心15 min后抽濾，420 nm處測定OD值。脫色率=（OD前–OD后）/OD前×100%，式中，OD前和OD后分別為吸附前后溶液的光密度值。

1.2.4 大孔樹脂效果評(píng)價(jià) 以多糖保留率、蛋白質(zhì)去除率、脫色率3項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行加權(quán)求和[19]。得到公式：u=0.4x+0.3y+0.3z，式中，x表示多糖保留率（%），y表示蛋白質(zhì)去除率（%），z表示脫色率（%）。

1.2.5 篩選最佳大孔樹脂 稱量20.0 g樹脂與40 mL粗多糖加入100 mL錐形瓶混勻，放置在38 ℃、150 r/min條件下的搖床中2 h，抽濾，蒸餾水洗滌，濾液收集在一起，50 mL容量瓶定容。測多糖保留率、蛋白質(zhì)去除率和脫色率，參照第1.2.4節(jié)進(jìn)行評(píng)分。

1.2.6 單因素試驗(yàn)

1.2.6.1 吸附溫度的確定 稱取經(jīng)預(yù)處理干燥后的樹脂6 g于100 mL三角瓶中，加入10 mL火龍果莖多糖提取液，調(diào)節(jié)pH為5，分別在30、40、50、60、70 ℃振搖2 h，采用第1.2.3節(jié)方法測定多糖保留率、蛋白質(zhì)去除率、脫色率。

1.2.6.2 pH的確定 稱取經(jīng)預(yù)處理干燥后的樹脂6 g于100 mL三角瓶中，加入10 mL火龍果莖多糖提取液，分別調(diào)節(jié)pH為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0，40 ℃振搖2 h，采用第1.2.3節(jié)方法測定多糖保留率、蛋白質(zhì)去除率、脫色率。

1.2.6.3 樹脂用量的確定 分別稱取經(jīng)預(yù)處理干燥后的樹脂2 、4 、6 、8 、10 g 于100 mL三角瓶中，加入10 mL火龍果莖多糖提取液，調(diào)節(jié)pH值為5，40 ℃振搖2 h，采用第1.2.3節(jié)方法測定多糖保留率、蛋白質(zhì)去除率、脫色率。

1.2.6.4 吸附時(shí)間的確定 稱取經(jīng)預(yù)處理干燥后的樹脂6 g于100 mL三角瓶中，加入10 mL火龍果莖多糖提取液，調(diào)節(jié)pH為5，40 ℃分別振搖1.0 、2.0 、3.0 、4.0 、5.0 h，采用第1.2.3節(jié)方法測定多糖保留率、蛋白質(zhì)去除率、脫色率。

1.2.7 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì) 以單因素試驗(yàn)結(jié)果為基礎(chǔ)，選擇吸附溫度、pH值、樹脂用量、吸附時(shí)間4個(gè)因素，如表1所示，進(jìn)行L9（34）正交試驗(yàn)，每組試驗(yàn)做3次平行。

1.2.8 火龍果莖多糖大孔樹脂處理前后抗氧化活性的測定

1.2.8.1 清除DPPH自由基的能力測定 參考李莉[20]的方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，DPPH自由基清除率計(jì)算式如下：

式中，Ai為1 mL待測液+1 mL DPPH工作液的吸光度值；Aj為1 mL待測液+1 mL甲醇的吸光度值；A0為1 mL DPPH工作液+1 mL甲醇的吸光度值。

1.2.8.2 清除羥自由基（OH）的能力測定 參考封燕[21]的方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，羥自由基清除率計(jì)算式如下：

式中，Ai為多糖待測液的吸光度值；Aj為蒸餾水作空白試驗(yàn)的吸光度值；A0為蒸餾水代替過氧化氫溶液的吸光度值。

1.2.8.3 總抗氧化能力和還原力的測定 參考Smirnoff等[22]和劉曉鵬等[23]的方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3 數(shù)據(jù)分析

每組數(shù)據(jù)至少進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn)和2次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，取平均值。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用DPS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)，正交試驗(yàn)結(jié)果采用正交助手進(jìn)行分析，用Origin 9.0作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 篩選最佳大孔樹脂

火龍果莖多糖提取液中的主要雜質(zhì)是色素與蛋白質(zhì)，雜質(zhì)含量過高會(huì)影響下一步的分離純化及性質(zhì)測定。不同型號(hào)大孔樹脂的吸附性能對火龍果莖多糖純化過程中脫色除蛋白效果影響很大，樹脂的極性、比表面積和空間結(jié)構(gòu)是影響吸附性能的重要因素[24]。試驗(yàn)選取NKA-9、DM301、D101、HPD700、S-8、AB-8這6種分子極性和顆粒理化性質(zhì)不同的大孔樹脂進(jìn)行比較。其中，極性樹脂：NKA-9和S-8；弱極性樹脂：AB-8；中極性樹脂：HPD700和DM301；非極性樹脂：D101。這6種樹脂吸附后結(jié)果如表2所示。由表2可知，樹脂NKA-9、DM30、HPD700脫色效果較好，AB-8、HPD700蛋白質(zhì)去除率較高，AB-8蛋白質(zhì)去除率最高，且其多糖保留率也相對較高，綜合評(píng)分最高為（79.72±0.04）%。綜上所述，篩選AB-8樹脂作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的樹脂。

2.2 單因素試驗(yàn)

選擇吸附溫度、pH值、樹脂用量、吸附時(shí)間四個(gè)因素對火龍果莖多糖脫色除蛋白效果的影響進(jìn)行單因素試驗(yàn)，結(jié)果如圖1～4所示。

2.2.1 時(shí)間 由圖1可知，多糖保留率隨著吸附時(shí)間的延長而逐漸降低，蛋白去除率和脫色率逐漸升高。當(dāng)吸附時(shí)間超過2.0 h時(shí)，蛋白去除率和脫色率增加不顯著，但對多糖的吸附明顯增多。綜合上述因素，確定AB-8脫色除蛋白的最佳吸附時(shí)間為2.0 h。

2.2.2 pH值 由圖2可知，pH值的變化對脫色除蛋白效果有明顯的影響。在一定pH值范圍內(nèi)，隨著pH值的增大，蛋白去除率和脫色率逐漸降低。然而低pH值條件下容易導(dǎo)致多糖性質(zhì)發(fā)生變化，使得多糖保留率急劇降低。綜合上述因素，確定AB-8脫色除蛋白的適宜pH值為5。

2.2.3 樹脂用量 如圖3所示，隨著樹脂用量的增加，蛋白去除率和脫色率逐漸升高，當(dāng)樹脂用量超過0.6 g/mL時(shí)，蛋白質(zhì)去除率和脫色率增加緩慢，但增加了對多糖的吸附。綜合上述因素，確定AB-8脫色除蛋白的樹脂適宜用量為0.6 g/mL。

2.2.4 溫度 如圖4所示，吸附溫度在30～50 ℃時(shí)，多糖保留率、蛋白去除率和脫色率隨著溫度的增加而逐漸提高，當(dāng)溫度高于50 ℃時(shí)，三者增長趨勢均趨于平緩。綜合上述因素，確定AB-8脫色除蛋白的溫度為50 ℃。

2.3 正交試驗(yàn)結(jié)果

由表3直觀分析表明，以多糖保留率、蛋白去除率和脫色率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，按照第1.2.4節(jié)的評(píng)價(jià)方法綜合評(píng)分，大孔樹脂脫色除蛋白的最佳工藝組合為A2B2C2D3，即吸附時(shí)間1 h，吸附pH值為5，樹脂用量0.6 g/mL，吸附溫度60 ℃，各個(gè)因素對大孔樹脂脫色除蛋白的影響程度依次是樹脂用量>吸附時(shí)間>吸附溫度>pH值。

2.4 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

在正交試驗(yàn)確定的最佳提取條件下，進(jìn)行多次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，多糖保留率為（83.47±1.21）%，蛋白去除率為（88.29±1.56）%，脫色率為（76.51±1.63）%，綜合評(píng)分為（82.83±1.14）%，有較佳的脫色除蛋白效果，由此證明該工藝具有可行性。

2.5 抗氧化活性

由于不同抗氧化劑測定的理論基礎(chǔ)不同，單一的抗氧化活性研究難以真正反映樣品的抗氧化能力。因此，本研究采用4種方法來反映火龍果莖多糖的抗氧化活性，結(jié)果如圖5～8所示。

2.5.1 DPPH自由基清除能力 DPPH自由基是一種穩(wěn)定的自由基，能接受電子或氫自由基，形成穩(wěn)定的反磁性分子，抗氧化劑對DPPH自由基的清除原理，是基于它的供氫能力[25]。如圖5所示，在一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，火龍果莖多糖的質(zhì)量濃度與DPPH自由基清除率成量效關(guān)系。純化前后火龍果莖多糖對DPPH自由基清除能力的IC50值分別為4.20 mg/mL和3.81 mg/mL，說明經(jīng)樹脂純化后的多糖較純化前對DPPH自由基的清除能力增強(qiáng)，這可能是因?yàn)榻?jīng)大孔樹脂處理后的火龍果莖多糖得到了純化和富集。

2.5.2 OH清除能力 如圖6所示，在一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，火龍果莖多糖質(zhì)量濃度與其OH清除率成量效關(guān)系。純化前后火龍果莖多糖對OH清除能力的IC50值分別為3.80 mg/mL和3.51 mg/mL，說明經(jīng)樹脂純化后的多糖較純化前對OH的清除能力略有增強(qiáng)。

2.5.3 總還原能力 如圖7所示，在一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，火龍果莖多糖的質(zhì)量濃度與總還原能力成量效關(guān)系。純化前后火龍果莖多糖均有較好的還原能力，且純化后較純化前略有提高。

2.5.4 總抗氧化能力 如圖8所示，在一定的火龍果莖多糖的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，其總抗氧化能力與質(zhì)量濃度成量效關(guān)系。純化前后火龍果莖多糖均有較好的總抗氧化能力，且純化后較純化前略有提高。

3 討論

大孔樹脂具有可再生、吸附快、選擇性好等特點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于多糖脫色除蛋白中[26]。方婷等[27]通過研究豬肚菇粗多糖脫色除蛋白工藝，表明采用酶法和sevag及大孔樹脂聯(lián)合的方法可以有效脫色除蛋白，羅璽等[28]采用D303樹脂對靈芝多糖進(jìn)行脫色除蛋白，脫色率高達(dá)91.89%。綜上所述，采用大孔樹脂對紅心火龍果莖多糖脫色除蛋白的方法具有可行性。本研究將脫色除蛋白前后的多糖性質(zhì)進(jìn)行比較，初步證實(shí)了粗多糖的抗氧化活性是多糖的性質(zhì)，不受其他雜質(zhì)的影響，能在原來的基礎(chǔ)上適當(dāng)提高其抗氧化活性。

本研究通過比較6種樹脂對火龍果莖多糖靜態(tài)吸附后的脫色除蛋白效果，確定AB-8為理想樹脂。通過單因素和正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以多糖保留率、蛋白去除率和脫色率為評(píng)價(jià)指標(biāo)篩選出最佳脫色除蛋白條件：樹脂用量0.6 g/mL，溫度60 ℃，pH為5，時(shí)間2 h，此條件下得到的脫色率、蛋白去除率和多糖保留率分別為76.51%、88.29%和83.47%。

對火龍果莖多糖進(jìn)行純化前后抗氧化對比實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，純化前的粗多糖本身具有較好的抗氧化活性，且抗氧化能力與它們的濃度有明顯的量效關(guān)系。經(jīng)過AB-8樹脂處理后，其抗氧化活性有所提高，為火龍果莖多糖的純化奠定基礎(chǔ)。

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