付影 于旭東 蔡澤坪 吳繁花 羅佳佳

摘 要 在野外考察中發(fā)現(xiàn)了菠蘿蜜白化突變體，并對(duì)其形態(tài)和生理方面進(jìn)行了研究。通過(guò)分光光度計(jì)法、離體稱(chēng)量法、比色法等比較研究菠蘿蜜實(shí)生白化苗與正常苗在形態(tài)指標(biāo)和生理指標(biāo)方面的差異。結(jié)果表明：菠蘿蜜白化突變體的株高、側(cè)根密度、莖粗、葉柄長(zhǎng)、葉片長(zhǎng)、葉片寬、葉面積、葉周長(zhǎng)、葉綠素含量均低于正常苗，而含水量、蒸騰速率、脯氨酸含量均高于正常苗。菠蘿蜜白化突變體和正常苗無(wú)論在形態(tài)還是生理上都有很大的差別。本研究不僅為木本經(jīng)濟(jì)作物白化突變體的研究提供材料，而且為進(jìn)一步研究菠蘿蜜白化苗的形成機(jī)制提供參考依據(jù)。

關(guān)鍵詞 菠蘿蜜；白化突變體；形態(tài)指標(biāo)；生理指標(biāo)

中圖分類(lèi)號(hào) S667.8 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

Characters of Albino Mutant of Artocarpus heterophyllus Lam.

FU Ying1， YU Xudong1， CAI Zeping1*， WU Fanhua1， LUO Jiajia1，2

1 Institute of Tropical Agriculture and Forestry， Hainan University， Danzhou， Hainan 571737， China

2 Tropical Crops Genetic Resources Institute， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences / Key Laboratory of Crop Gene Resources and Germplasm Enhancement in Southern China， Ministry of Agriculture， Danzhou， Hainan 571737， China

Abstract An albino mutant of Artocarpus heterophyllus Lam. was discovered in field investigation， and its morphological and physiological aspects were studied. The differences between the morphological indexes and physiological indexes of A. heterophyllus were studied by spectrophotometry， vitro weighing method and colorimetric method. The results showed that plant height， lateral root density， stem diameter， petiole length， leaf length， leaf width， leaf area， leaf perimeter， chlorophyll content and of the albino mutants were lower than those of normal seedlings. However， the transpiration rate and proline content of the mutant were higher than those of the normal seedlings. There were big differences in morphology and physiology of the albino mutants and normal seedlings. This experiment not only provides materials for the study of albino mutant of woody economic cro ps， but also provides reference for further study on the formation mechanism of albino seedlings of A. heterophyllus.

Key words Artocarpus heterophyllus Lam.； albino mutant； morphological index； physiological index

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2018.06.007

菠蘿蜜（Artocarpus heterophyllus Lam.）又稱(chēng)木菠蘿、樹(shù)菠蘿，桑科（Moraceae）木菠蘿屬（Artocarpus）常綠喬木。菠蘿蜜是集水果鮮食、木本糧食和珍貴木材于一體的經(jīng)濟(jì)作物，是世界著名的熱帶果樹(shù)[1]。近年來(lái)對(duì)菠蘿蜜果實(shí)加工研究較多，但生理和形態(tài)方面的研究較少，且白化突變體的形態(tài)、生理和分子生物學(xué)研究均未見(jiàn)報(bào)道。白化苗是一種植物的變異，是科學(xué)研究的特殊材料，但白化現(xiàn)象會(huì)造成農(nóng)林生產(chǎn)上的損失[2]。因此白化苗的形成機(jī)理及分子機(jī)制受到了國(guó)內(nèi)外科研人員的廣泛關(guān)注和研究。已有報(bào)道在許多植物的實(shí)生苗以及組培苗中發(fā)現(xiàn)白化現(xiàn)象，比如版納省藤（Calamus nambariensis Becc. var. xishuangbannaenis S.J.Pei et S.Y.Chen）、苦瓜（Momordica charantia L.）、水稻（Oryza sativa L.）、花生（Arachis hypogaea L.）、玉米（Zea mays L. Sp.）、豌豆（Pisum sativum L.）、椰子（Cocos nucifera L.）、蘇鐵（Cycas revoluta Thunb.）、楨楠（Cycas revoluta Thunb.）、斐濟(jì)貝殼杉[Agathis macrophylla （Lindl.） Mast.]、印度八角楓（Alangium lamarckii Thwaites）等植物[2-12]。

與草本植物相比，木本植物生長(zhǎng)周期長(zhǎng)，突變體研究較為困難，白化突變體的研究更少。此次筆者在野外首次發(fā)現(xiàn)菠蘿蜜白化突變體，并對(duì)比分析其與正常苗形態(tài)和生理指標(biāo)的差異，為進(jìn)一步研究菠蘿蜜白化苗的形成機(jī)制提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料為白化和正常的菠蘿蜜幼苗，均采自海南省儋州市，每株苗帶有完整的根、莖、葉，保濕帶回實(shí)驗(yàn)室，進(jìn)行指標(biāo)測(cè)量。儀器主要有光學(xué)顯微鏡、電子分析天平、電熱恒溫干燥箱和分光光度計(jì)等。

1.2 方法

1.2.1 形態(tài)學(xué)觀察 根、莖、葉形態(tài)測(cè)量：測(cè)量以下指標(biāo)：主根長(zhǎng)、側(cè)根密度、株高、莖粗、葉柄長(zhǎng)、葉片長(zhǎng)、葉片寬、葉面積、葉周長(zhǎng)等，重復(fù)3次，計(jì)算各指標(biāo)的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差。葉各項(xiàng)指標(biāo)測(cè)量均選擇幼苗中最大的一枚葉。

葉表皮的顯微結(jié)構(gòu)觀察：分別剝?nèi)∪~的上、下表皮放在清潔的載玻片上，制成水封臨時(shí)裝片， 進(jìn)行顯微觀察，選擇清晰的圖像，顯微攝影。測(cè)量并記錄的指標(biāo)包括上下表皮扁平細(xì)胞（pavement cell）面積與數(shù)量、突出（Lobe）數(shù)、Lobe長(zhǎng)、頸（neck）寬、氣孔器密度（stomatal density）、氣孔器數(shù)量、氣孔器指數(shù)（stomatal index）等，氣孔密度=單位面積內(nèi)氣孔數(shù)量/面積（mm2）。氣孔指數(shù)=單位面積內(nèi)氣孔數(shù)量/（單位面積內(nèi)氣孔數(shù)量+單位面積內(nèi)表皮扁平細(xì)胞數(shù)）×100%。重復(fù)6次，數(shù)值以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

1.2.2 生理指標(biāo)測(cè)定 葉綠素含量測(cè)定：取新鮮葉片，參照張志良[13]的方法提取葉綠素。將葉綠素提取液在波長(zhǎng)663、645 nm下測(cè)定吸光度，每個(gè)樣品重復(fù)3次。利用Arnon法公式計(jì)算葉綠素含量[14]。

含水量測(cè)定：剪下根、莖、葉和子葉后立即稱(chēng)鮮重；分別裝入潔凈干燥的自封袋，放入烘箱，恒溫60 ℃烘至恒重。烘干后立即稱(chēng)重，得到根、莖、葉和子葉的干重，每個(gè)樣品重復(fù)3次。相對(duì)含水量（relative water content，RWC）的計(jì)算公式：

RWC=（鮮重-干重）/鮮重×100%。

蒸騰速率測(cè)定：取新鮮葉片，參照劉萍等[15]提出的離體測(cè)量法測(cè)定蒸騰速率，每個(gè)樣品重復(fù)3次。

脯氨酸和可溶性糖含量測(cè)定：取新鮮植株，參照李合生[16]提出的比色法分別測(cè)定脯氨酸含量和可溶性糖含量，每個(gè)樣品重復(fù)3次。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)和分析均采用SPSS 19.0和Excel 2010軟件，采用LSD檢驗(yàn)和Duncan法進(jìn)行數(shù)據(jù)差異顯著性多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 白化突變體自然生長(zhǎng)情況

對(duì)發(fā)現(xiàn)白化苗的母樹(shù)（正常）下的幼苗進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，總共發(fā)現(xiàn)39株幼苗，其中白化苗10株，占全部苗的25.6%（圖1）。將白化苗移栽到含有營(yíng)養(yǎng)土的花盆中放入溫室大棚培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)白化現(xiàn)象并無(wú)改變，說(shuō)明白化現(xiàn)象的產(chǎn)生不是環(huán)境造成的，可能是由于基因突變或葉綠素合成受阻等造成的。

2.2 形態(tài)學(xué)分析

2.2.1 根、莖和株高的形態(tài)學(xué)比較 菠蘿蜜白化突變體幼苗的株高[（364.67±62.20） mm]比正常苗[（457.36±18.56） mm]矮（圖2-A）。雖然其主根長(zhǎng)[（176.45±41.23） mm]與正常苗[（196.23±26.71） mm]相當(dāng)，但側(cè)根密度[（2.40±0.29）個(gè)/mm]小于正常苗[（3.75±0.63）個(gè)/mm]，差異極顯著（圖2-A、B）。同時(shí)，突變體的莖較為瘦弱（圖2-C）。

2.2.2 葉的形態(tài)學(xué)比較 菠蘿蜜白化突變體葉柄長(zhǎng)、葉片長(zhǎng)和葉片寬均小于正常苗，分別是正常苗的47.2%、45.7%和41.2%，差異極顯著；突變體葉面積和葉周長(zhǎng)均小于正常苗，但葉周長(zhǎng)/葉面積大于正常苗，是正常苗的近3倍，差異極顯著；在葉片長(zhǎng)/葉柄長(zhǎng)與葉片長(zhǎng)/葉片寬中，突變體（11.45±1.12與2.00±0.17）與正常苗（12.08±1.88與1.79±0.23）相比差異不顯著；由此可見(jiàn)，葉形差異不大，但尺寸顯著縮小了（表1，圖1）。

2.2.3 葉表皮扁平細(xì)胞和氣孔器的形態(tài)學(xué)分析 葉表皮扁平細(xì)胞比較：突變體表皮扁平細(xì)胞較小，上、下表皮扁平細(xì)胞面積均約為正常苗的1/3，而其密度分別是正常苗的4倍和2.5倍，差異極顯著（圖3-B、D，表2）。突變體表皮扁平細(xì)胞邊緣彎曲較少，Lobe數(shù)目減少而且Lobe的長(zhǎng)度變短，上、下表皮扁平細(xì)胞的Lobe數(shù)分別是正常苗的78.3%和63.8%，Lobe長(zhǎng)度分別為正常苗的53.2%和74.5%，差異均極顯著；上下表皮扁平細(xì)胞Neck寬度分別為正常苗的60.9%和81.8%，差異極顯著（圖3，表2）。

氣孔器比較：菠蘿蜜氣孔器由2個(gè)腎形的保衛(wèi)細(xì)胞（guard cells）組成，沒(méi)有副衛(wèi)細(xì)胞（accessory cells）。突變體與正常苗上表皮均沒(méi)有氣孔的分布，氣孔器只存在于下表皮。突變體氣孔面積發(fā)生變化，氣孔的長(zhǎng)寬減小，氣孔指數(shù)減小，氣孔面積（stomatal area）是正常苗的67.7%，氣孔的長(zhǎng)和寬分別為正常苗的78.0%和89.4%，氣孔長(zhǎng)寬比為正常苗的82.9%，差異極顯著。氣孔指數(shù)是正常苗67.1%，差異極顯著。而氣孔密度大于正常苗，是正常苗的1.6倍（圖3-B、D，表3）。

2.3 生理指標(biāo)分析

2.3.1 含水量比較 從表4可知，突變體整個(gè)植株的含水量高于正常苗，葉片、莖和子葉的含水量均大于正常苗，差異極顯著；而根含水量與正常苗相當(dāng)，無(wú)明顯差異。

2.3.2 葉蒸騰速率（Tr）和葉綠素含量（Chl）比較 白化突變體葉綠素含量發(fā)生變化，葉綠素a、葉綠素b和總?cè)~綠素含量接近0，遠(yuǎn)小于正常苗（表5）；蒸騰速率[（77.51±7.81） g.m-2.h-1]比正常苗[（48.15±7.95） g.m-2.h-1]高60%，差異極顯著（圖4-A）。

A：正常苗葉片上表皮細(xì)胞；B：正常苗葉片下表皮細(xì)胞；C：突變體葉片上表皮細(xì)胞；D：突變體葉片下表皮細(xì)胞；標(biāo)尺為50 μm。

A： Upper epidermis cells of normal leaves； B： Lower epidermis cells of normal leaves； C： Upper epidermis cells of mutant leaves； D： Lower epidermis cells of mutant leaves； The scale is 50 μm.

2.3.3 可溶性糖和脯氨酸（Pro）含量比較 突變體脯氨酸含量[（145.75±6） μg/g]極顯著高于正常苗[（38.38±5） μg/g]，是正常苗的近4倍（圖4-B）；但突變體可溶性糖含量[（0.240±0.014） g/hg]與正常綠苗相比[（0.255±0.021） g/hg]無(wú)明顯差異（圖4-C）。

3 討論

葉表皮主要由表皮扁平細(xì)胞、氣孔保衛(wèi)細(xì)胞（Stomatal guard cell）和表皮毛（Trichrome）3類(lèi)細(xì)胞構(gòu)成[17]。表皮原始細(xì)胞沿葉長(zhǎng)軸擴(kuò)展，形成變長(zhǎng)的多邊形細(xì)胞；細(xì)胞開(kāi)始產(chǎn)生向外的生長(zhǎng)點(diǎn)（Outgrowths），或沿著細(xì)胞壁的背斜面向相鄰細(xì)胞側(cè)面延伸形成多處Lobes，Lobes和Necks進(jìn)一步的延伸，最終形成相互交錯(cuò)的表皮扁平細(xì)胞[18]。菠蘿蜜白化突變體與正常苗相比，整體長(zhǎng)勢(shì)較弱。其側(cè)根密度、株高、莖粗、葉柄長(zhǎng)、葉片長(zhǎng)、葉片寬、葉面積、葉周長(zhǎng)、葉綠素含量等都低于正常苗。葉綠素是植物進(jìn)行光合作用的重要色素，葉綠素含量大小直接決定葉片光合能力的強(qiáng)弱[19]。白化苗中含有微量的葉綠素，而不是人們普遍認(rèn)為的白化苗不含葉綠素，但是其葉綠素含量遠(yuǎn)低于正常苗，含量近乎0。Bae等[20]在煙草白化苗中檢測(cè)出微量葉綠素，與本研究結(jié)果一致。白化苗葉綠素含量非常低，光合作用極弱，只能依靠子葉提供營(yíng)養(yǎng)。突變體不能進(jìn)行正常的光合作用，可能是導(dǎo)致突變體生長(zhǎng)勢(shì)（growth vigor）弱的重要原因。

植物一方面從土壤中吸收水分，另一方面又向大氣中蒸騰散失水分。蒸騰作用在響應(yīng)土壤水分脅迫時(shí)是判斷植物抗旱性強(qiáng)弱的一項(xiàng)重要參數(shù)[21]。葉片是植物進(jìn)行同化與蒸騰作用的主要器官，也是植物對(duì)干旱脅迫最敏感的器官。葉片上的氣孔是植物與外界環(huán)境之間水、氣交換的主要通道，直接控制蒸騰強(qiáng)度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，突變體葉片的水分散失速率比正常苗高60%。這與突變體葉片氣孔密度比正常苗高60%相互印證。然而突變體植株含水量明顯高于正常苗，這可能與植物體內(nèi)脯氨酸、可溶性糖等溶質(zhì)的含量有關(guān)。

脯氨酸在動(dòng)物、植物、真菌、藻類(lèi)中均有積累，是已知的在植物中分布最廣的滲透保護(hù)物質(zhì)。在非生物脅迫條件下，植物的生長(zhǎng)發(fā)育受到不同程度的影響。許多實(shí)驗(yàn)證明脯氨酸的累積能夠提高植物對(duì)環(huán)境脅迫的耐受力[22-23]。菠蘿蜜白化突變體脯氨酸的含量明顯高于正常苗，是正常苗的近4倍。說(shuō)明突變體受環(huán)境脅迫程度深，可能與白化苗的生長(zhǎng)發(fā)育不良有關(guān)，而長(zhǎng)勢(shì)較好的正常苗脯氨酸含量較低。脯氨酸含量還與植物體內(nèi)水分狀況的變化關(guān)系十分密切[24]。脯氨酸與細(xì)胞內(nèi)的一些化合物形成聚合物，類(lèi)似親水膠體，有一定的保水作用，可能也是植株含水量高于正常苗的重要原因。

糖是代謝的中間產(chǎn)物或終產(chǎn)物，調(diào)節(jié)植物的生長(zhǎng)、發(fā)育等多個(gè)生理過(guò)程，參與胞內(nèi)信號(hào)調(diào)節(jié)和轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程，在植物生長(zhǎng)、發(fā)育、成熟和衰老等過(guò)程中發(fā)揮調(diào)控作用[25]。可溶性糖是光合作用的產(chǎn)物，在一定程度上反映光合產(chǎn)物的積累和運(yùn)轉(zhuǎn)情況[26]。由于突變體不能進(jìn)行正常的光合作用，主要依靠從種子中吸收的營(yíng)養(yǎng)維持生命活動(dòng)。突變體的可溶性糖含量與正常苗差別不大，說(shuō)明此時(shí)的菠蘿蜜白化苗還能通過(guò)子葉提供的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)繼續(xù)生長(zhǎng)。

本研究結(jié)果表明，白化苗的整體長(zhǎng)勢(shì)弱于正常苗，可能與白化突變體葉綠素含量低，不能進(jìn)行正常的光合作用有關(guān)。白化突變體生長(zhǎng)發(fā)育不正常導(dǎo)致脯氨酸含量高于正常苗。菠蘿蜜白化突變體的形成機(jī)制還需要進(jìn)一步的研究，研究白化突變體的成因進(jìn)而控制其形成也是當(dāng)前作物育種中亟待解決的一個(gè)問(wèn)題。

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