李蓉 謝析穎 王雪晶 蘇立遙 林玉玲 郭容芳 陳裕坤 賴鐘雄 徐涵

摘 要 為揭示蘭科植物FNR基因的特性和密碼子偏好性，采用DNAMAN、CodonW和SPSS軟件及 EMBOSS、SWISS-MODEL在線網(wǎng)站對17種蘭科植物的FNR基因序列、氨基酸序列、同源區(qū)域及蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。結(jié)果表明：蘭科植物FNR基因普遍具有在A/T（U）與G/C之間較弱的密碼子偏好性；密碼子的末位在A和T（U）之間存在顯著的T（U）偏好性，在C和G之間存在顯著的C偏好性；NADP結(jié)合域比非結(jié)合域有較小的密碼子偏好性；基于CDS和氨基酸聚類結(jié)果比基于RSCU聚類更接近于植物的進(jìn)化分類；自然選擇的作用是導(dǎo)致蘭科植物FNR基因的密碼子使用偏好性的主要成因。

關(guān)鍵詞 蘭科；FNR基因；密碼子偏好性

中圖分類號 S682.31 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A

Codon Usage Bias of Ferredoxin-NADP+ Oxidoreductase （FNR）

in Orchidaceae

LI Rong1， XIE Xiying1， WANG Xuejing1， SU Liyao1， LIN Yuling1， GUO Rongfang1，

CHEN Yukun1， LAI Zhongxiong1*， XUHAN Xu1，2*

1 Institute of Horticulture of Biotechnology， Fujian Agriculture and Forestry University， Fuzhou， Fujian 350002， China

2 Institut de la Recherche Interdisciplinaire de Toulouse， Toulouse 313008， France

Abstract For a good understanding of the codon usage bias of ferredoxin-NADP+ oxidoreductase （FNR） in Orchidaceae， the gene sequence， amino acid sequence， homologous region and three-dimensional protein structure of 17 FNR genes in Orchidaceae were analyzed by DNAMAN， CodonW， SPSS softwares， and EMBOSS， SWISS-MODEL online programs. The results showed that there was a low-level codon usage bias in FNR genes between A/T（U） and G/C； there existed a significant T（U） bias between A and T（U） and a significant C bias between C and G in the codons； NADP binding domain showed less codon bias than that of the non-binding domain； the cluster tree based on coding sequence （CDS） as well as amino acid sequences matched better with the plant evolution classification； the codon usage bias of FNR was mainly influenced by the natural selection in Orchidaceae.

Key words orchidaceae； FNR gene； codon usage bias

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2018.06.015

基因表達(dá)是細(xì)胞在生命活動過程中將儲存在DNA雙鏈中的遺傳信息轉(zhuǎn)錄、翻譯為具有生物活性的蛋白質(zhì)的過程。其中，翻譯階段通過三聯(lián)體密碼子進(jìn)行遺傳信息的傳遞。密碼子編碼的氨基酸中，除甲硫氨酸和色氨酸之外，其它氨基酸均由2種或2種以上的密碼子編碼，這種編碼同一種氨基酸的密碼子稱為同義密碼子（synonymous codon），其在不同物種、不同基因中的出現(xiàn)具有一定的偏好性，即密碼子選用偏好性（codon usage bias，CUB）。密碼子選用偏好性的評價(jià)參數(shù)主要有有效密碼子數(shù)（Effective number of codons，ENC）、同義密碼子相對使用度（Relative synonymous codon usage，RSCU）、不同位置的G+C含量、密碼子適應(yīng)指數(shù)（Codon adaptation index，CAI）等[1]。ENC能夠表示指定密碼子偏離同義密碼子的平均使用頻率的高低，能同時(shí)反映基因的表達(dá)水平及對密碼子的偏好性[2]。RSCU描述了指定密碼子在同義密碼子中的相對概率，直觀地表示了基因?qū)δ骋幻艽a子的使用偏好性。不同位置的G+C含量可用于分析密碼子偏好性的原因。CAI是反映編碼區(qū)同義密碼子與密碼子最佳使用相符合程度的指數(shù)。

鐵氧還蛋白-NADP+氧化還原酶（Ferredoxin-NADP+ oxidoreductase，F(xiàn)NR）在藻類、光合細(xì)菌及高等植物中均廣泛存在[3]。FNR是以非共價(jià)鍵結(jié)合的黃素腺嘌呤二核苷酸（FAD）為輔基的單體

酶[4-5]。第一個(gè)FNR基因是從豌豆類囊體中分離到的，F(xiàn)NR有多種同源蛋白[6-9]。研究發(fā)現(xiàn)FNR主要負(fù)責(zé)Fd（ferredoxin）與NADP+之間的電子傳遞，用于卡爾文循環(huán)中CO2的固定和葉綠體的其他代謝過程。近年來，已有研究表明植物中FNR基因不僅參與光合作用中電子傳遞的過程，而且作用于生長發(fā)育密切相關(guān)的環(huán)式電子傳遞過程及抵御氧化脅迫[10]，因此挖掘該基因的功能具有重要意義。在基因的功能研究中遺傳轉(zhuǎn)化是一種重要的手段[11-12]。已有研究表明，被導(dǎo)入基因功能的體現(xiàn)與植物類群、物種甚至組織特異性的密碼子偏好性相關(guān)[13-15]。在植物生長發(fā)育中發(fā)揮重要作用的FNR基因的密碼子使用情況尚未見報(bào)道。本研究在已完成的文心蘭FNR基因表達(dá)及表型鑒定的基礎(chǔ)上，結(jié)合蘭科植物FNR的基因序列、氨基酸序列、蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行密碼子偏性及形成原因分析，旨在為蘭科植物FNR基因的功能挖掘提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

以文心蘭的FNR基因序列（GenBank登錄號為KX461908）為探針，在NCBI的數(shù)據(jù)庫及2個(gè)蘭科植物生物信息數(shù)據(jù)庫Orchidbase和Orchidstra中，通過blastn查找同源的FNR基因，去除冗余序列后，選擇蘭科11個(gè)屬具有完整ORF的17條FNR基因序列用于本研究（表1）。

1.2 方法

將獲得的序列整理后，在CodonW軟件運(yùn)行獲得ENC、CAI及RSCU值，運(yùn)用EMBOSS網(wǎng)站（http：//www.bioinformatics.nl/emboss-explorer/）運(yùn)算獲得ENC、不同位置G+C含量，在EXCEL中進(jìn)行整理，運(yùn)用SPSS19.0、MEGA5.1及ORIGIN8.5軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和繪圖分析。由于本研究17條FNR基因分別屬于蘭科11個(gè)屬，其中蝴蝶蘭屬植物（Phalaenopsis spp.）占7個(gè)。因此，對蝴蝶蘭屬FNR基因的同義密碼子相對使用度（RSCU）及具有偏好性氨基酸在不同區(qū)域比例進(jìn)行單獨(dú)分析。

1.2.1 同義密碼子相對使用度（RSCU）分析 同義密碼子相對使用度表示指定密碼子偏離同義密碼子的程度，當(dāng)RSCU>1時(shí)，表明該密碼子使用頻率高于其他同義密碼子；當(dāng)RSCU<1時(shí)，表明該密碼子使用頻率低于其他同義密碼子；當(dāng)RSCU=1時(shí)，表明該密碼子無偏好性。

1.2.2 主要偏好密碼子分析 ENC值能夠同時(shí)反映基因的表達(dá)水平及其對密碼子使用的偏好性，取值范圍在20～61內(nèi)，該值越小，表明該基因表達(dá)水平越高，對指定密碼子的選擇偏好性較強(qiáng)；反之，表達(dá)量越低且選擇偏好性弱[16]。根據(jù)所研究基因的ENC值進(jìn)行排序，選擇前后10%作為高低表達(dá)樣本，計(jì)算其平均RSCU值，然后計(jì)算高低表達(dá)樣本的ΔRSCU值，選擇高表達(dá)樣本中平均RSCU>1且ΔRSCU>0.2，低表達(dá)樣本中平均RSCU<1且ΔRSCU>0.2的作為主要偏好密碼子[17]。

1.2.3 不同區(qū)域FNR基因密碼子偏好性分析 運(yùn)用NCBI網(wǎng)站的Conserved Domain Search 分析預(yù)測FNR基因的結(jié)合域，分析其蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)及與同源區(qū)域的關(guān)系，并統(tǒng)計(jì)該結(jié)合域及結(jié)合域外具有密碼子使用偏好性的氨基酸所占的比例。

1.2.4 系統(tǒng)聚類分析 以本研究中17條蘭科植物FNR基因的RSCU值作為變量，基于歐式平方距離采用SPSS19.0離差平方和法（ward法）進(jìn)行密碼子使用偏好性聚類分析[18]；同時(shí)采用MEGA5.1的組間鄰接法（Neighbour-Joining，NJ）構(gòu)建FNR基因CDS序列、氨基酸序列系統(tǒng)進(jìn)化樹，并比較3種聚類結(jié)果。

1.2.5 中性繪圖分析 根據(jù)已獲得密碼子不同位置的G+C含量，計(jì)算GC1（密碼子第一位的G+C含量）與GC2（密碼子第2位的G+C含量）的平均值，記為GC12。以GC3（密碼子第三位的G+C含量）為橫坐標(biāo)，GC12為縱坐標(biāo)作圖，通過分析密碼子第3位與第1～2位堿基組成的關(guān)系，分析密碼子偏好性的影響因素。

1.2.6 ENC繪圖分析 以本研究中17條FNR基因的GC3為橫坐標(biāo)，ENC為縱坐標(biāo)繪制散點(diǎn)圖，如果指定密碼子的使用頻率只是由于堿基突變引起，則：

ENC=2+GC3+29/（2伊GC32-2伊GC3+1）[17， 19]

以此公式繪制ENC的期望曲線，分析影響密碼子偏好性的因素。

1.2.7 PR2分析 PR2分析（ PR2-bias plot analysis）是為了研究密碼子第3位堿基A與T和 C與G之間是否有突變不平衡現(xiàn)象。根據(jù)偏倚規(guī)則（ parity rule 2，PR2），如果2條互補(bǔ)鏈間不存在任何突變或選擇效應(yīng)上的偏倚，那么堿基含量上應(yīng)該有A=T和C=G。因此，以本研究中17條基因的A3/（A3+T3）為縱坐標(biāo)，G3/（G3+C3）為橫坐標(biāo)，繪制散點(diǎn)圖進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 蘭科植物FNR基因有效密碼子數(shù)和GC含量

通過EMBOSS在線網(wǎng)站分析編碼區(qū)序列不同位置的G+C含量、ENC值和CAI值（表2）。結(jié)果顯示，GC1、GC2變化幅度較小，GC3變化范圍較大，分布在42%～64%；在17條FNR基因序列的GC1、GC2、GC3和GCall均值中，GC3值為53%，略大于50%，GCall小于50%，表明密碼子第一和第二堿基偏好A/T（U），第三堿基偏好使用G/C；ENC值均大于46，表明蘭科植物FNR基因的表達(dá)水平較低，且在編碼氨基酸時(shí)對密碼子的選擇偏好性較弱；CAI指數(shù)均在0.1～0.3之間，遠(yuǎn)小于1。此結(jié)果進(jìn)一步表明蘭科植物FNR基因?qū)γ艽a子的選擇偏好性較弱。

2.2 蘭科植物FNR基因同義密碼子相對使用度

利用CodonW軟件計(jì)算17條FNR基因序列的RSCU值（表3）。結(jié)果顯示，RSCU>1的密碼子有28個(gè)（占全部密碼子的43.75%），其中以T（U）結(jié)尾的有10個(gè)，以A結(jié)尾的有3個(gè)，C結(jié)尾的有8個(gè)，G結(jié)尾的有7個(gè)。Met和Trp各只有一個(gè)密碼子編碼，Gln有2個(gè)使用度相同的同義密碼子，其他編碼FNR基因的氨基酸及終止密碼子均呈現(xiàn)偏好性，可見密碼子偏好性涉及幾乎所有的具有同義密碼子的氨基酸，呈現(xiàn)普遍的密碼子選用偏好性，其中以G/C結(jié)尾的密碼子占53.6%。

單獨(dú)計(jì)算蝴蝶蘭屬7個(gè)FNR基因的密碼子發(fā)現(xiàn)，其中有26個(gè)具有偏好性的密碼子，分別以7個(gè)C結(jié)尾、8個(gè)G結(jié)尾、9個(gè)U結(jié)尾、2個(gè)A結(jié)尾。因此，蝴蝶蘭屬末位密碼子沒有在CG之間的偏好，但末位密碼子在A和T（U）之間存在顯著的T（U）偏好性。

去除蝴蝶蘭屬計(jì)算蘭科其他屬共10個(gè)FNR基因的密碼子，共有29個(gè)具有偏好性的密碼子，分別有10個(gè)C結(jié)尾、5個(gè)G結(jié)尾、10個(gè)U結(jié)尾、4個(gè)A結(jié)尾。因此，蘭科植物除了蝴蝶蘭屬之外的其他屬植物，末位密碼子在C和G之間存在顯著的C偏好性，且末位密碼子在A和T（U）之間同樣具有顯著的T（U）偏好性。

2.3 主要偏好密碼子分析

根據(jù)17個(gè)FNR基因的ENC值計(jì)算得到的ΔRSCU值進(jìn)行評價(jià)排序，共鑒定出1個(gè)主要偏好密碼子AAU，其RSCU=0.465>0.4，編碼氨基酸是天冬酰胺（Asn）。針對蝴蝶蘭屬的樣本進(jìn)行分析鑒定出1個(gè)編碼亮氨酸（Leu）的CUU密碼子；當(dāng)去除蝴蝶蘭屬植物進(jìn)行分析可得到編碼5種氨基酸的6個(gè)主要偏好密碼子（表4）。

2.4 不同區(qū)域FNR基因密碼子偏好性分析

NCBI在線預(yù)測結(jié)果表明，本研究中17條已知蘭科植物FNR基因均有NADP結(jié)合域，且該區(qū)域與DNAMAN中比對的同源區(qū)域高度重合（圖1），并且位于該基因蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)中保守性極高的亞基2（圖2）。此外，分析其保守結(jié)構(gòu)域、非保守結(jié)構(gòu)域及CDS序列，呈現(xiàn)密碼子使用偏好性氨基酸所占的比例（圖3），這表明具有密碼子選用偏好性的氨基酸在各個(gè)區(qū)域均表現(xiàn)出較高的比例，說明蘭科植物FNR基因都表現(xiàn)出較普遍的密碼子選用偏好性，其中NAD/NADP結(jié)合域比非結(jié)合域有較小的密碼子偏好性。

2.5 基于密碼子使用偏好性和CDS序列的系統(tǒng)聚類

對本研究中的17條FNR基因序列（圖4）、氨基酸序列（圖5）和同義密碼子偏好性相對使用度（圖6）進(jìn)行了聚類分析。結(jié)果顯示，核酸序列與氨基酸序列聚類之間大致相同，而同義密碼子相對使用度的聚類結(jié)果與前兩者差異較大，主要分為兩大類，第一類是蝴蝶蘭屬，第二類是其他蘭花，且第二類又分出3個(gè)分支。

2.6 中性繪圖分析

同義密碼子通常只有第3位堿基不同，因而可減少有害突變；反之，發(fā)生在密碼子前2位堿基的突變是非同義且有害的。中性繪圖分析通過研究GC3與GC12（GC1與GC2的平均值記為GC12）之間的關(guān)系，從而確定堿基突變與自然選擇對密碼子偏好性的影響程度。因此，以GC3與GC12為橫縱坐標(biāo)進(jìn)行中性繪圖，結(jié)果顯示，所有基因都分布在對角線較遠(yuǎn)的方位（圖7），表明蘭科植物FNR基因編碼氨基酸時(shí)對密碼子選擇的偏愛性主要受自然選擇壓力的影響，突變的作用較弱。

2.7 ENC繪圖分析

ENC繪圖結(jié)果顯示，17條FNR基因?qū)?yīng)的點(diǎn)均分布在ENC期望曲線下較遠(yuǎn)的方位（圖8），表明該基因ENC值偏小。其中，蝴蝶蘭屬的7條FNR基因的點(diǎn)集中在距離期望曲線最遠(yuǎn)的地方，表明蘭科植物中蝴蝶蘭屬的FNR基因的ENC值普遍偏小。

該圖表示突變壓力與自然選擇對FNR基因密碼子偏好性的作用程度。三角框內(nèi)的點(diǎn)包括了蝴蝶蘭屬及其他兩屬的數(shù)據(jù)。

The figure shows the effect of mutation pressure and natural selection on the codon usage bias of FNR in Orchidaceae. The boxed corresponds to the data including Phalaenopsis and two other generic data.

ENC和GC3值之間的對應(yīng)關(guān)系表示密碼子偏好性與基因表達(dá)水平和選擇壓力的關(guān)系。三角框內(nèi)數(shù)據(jù)對應(yīng)蝴蝶蘭屬。

ENC and GC3 show codon bias in relation to gene expression level and selection pressure. The boxed corresponds to the Phalaenopsis data.

2.8 PR2偏差分析

在PR2分析中，當(dāng)G3/（G3+C3）或者A3/（A3+T3）的值偏離0.5時(shí)，表明該基因密碼子偏好性受到除堿基突變之外因素的影響。以本研究中17條FNR基因的PR2偏好分析，結(jié)果顯示，蘭科植物FNR基因?qū)?yīng)的數(shù)集呈均勻?qū)ΨQ分布在橫坐標(biāo)軸0.5位置的兩側(cè)（圖6），表明密碼子在G和C之間沒有顯著的偏好性。同時(shí)，該數(shù)集均分布在縱坐標(biāo)0.4附近的位置，顯示密碼子在A和T（U）之間具有一定的偏好性。

該圖表示蘭科植物FNR基因同義密碼子中嘌呤和嘧啶之間的選用偏好性。三角框內(nèi)數(shù)據(jù)對應(yīng)蝴蝶蘭屬。

The pattern shows codon bias between purings and pyrimidines in FNR genes in Orchidaceae. The boxed corresponds to the Phalaenopsis data.

3 討論

3.1 蘭科植物FNR基因密碼子偏好性分析

在禾本科基因組序列的研究中，竹類植物（竹屬）與水稻（稻屬）的密碼子選用偏好性相近，但與玉米（玉蜀黍?qū)伲┖望滎悾ㄐ←湆伲┐嬖诓町?，表明單子葉植物的同一科內(nèi)各屬間存在密碼子選用的偏性差異[20]。本研究中蘭科17條FNR基因的整體分析表明，蘭科植物FNR基因在編碼氨基酸時(shí)，末位密碼子在A和T（U）之間存在顯著的T（U）偏好性，G和C之間無較大差異；而去除蝴蝶蘭屬植物的分析結(jié)果表明蘭科植物具有顯著的C偏好性，說明單子葉植物蘭科屬間在密碼子偏好性上可有各自的特性，也說明蘭科植物FNR基因的密碼子偏好性不強(qiáng)的原因是出現(xiàn)偏好性嵌合的狀態(tài)，這一方面表現(xiàn)在密碼子第一、二位偏好A/T（U）和結(jié)尾位偏好C之間的偏好性鑲嵌，另一方面表現(xiàn)在蘭科FNR基因與蝴蝶蘭屬FNR基因之間偏好性差異，推測蘭科不同屬間FNR基因在進(jìn)化過程中產(chǎn)生的差異可通過密碼子偏性顯示出來。NADP結(jié)合域是FNR基因發(fā)揮功能的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)[21]，本研究的分析結(jié)果表明，該基因在NADP結(jié)合域中偏好性氨基酸比例較低，推測蘭科不同屬間FNR基因在進(jìn)化過程中產(chǎn)生的差異首先是通過非核心功能區(qū)的密碼子偏性開始的。

近年來，密碼子偏好性的研究在模式植物、農(nóng)作物及園藝作物的研究結(jié)果表明，G/C結(jié)尾的密碼子在單子葉植物中使用得更多，A/T（U）結(jié)尾的密碼子則在雙子葉植物中應(yīng)用更廣[22-27]。相關(guān)研究中鐵皮石斛（蘭科）尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因、霍山石斛MYB1R1轉(zhuǎn)錄因子及蝴蝶蘭、文心蘭葉綠體基因組密碼子偏好使用A/T（U）結(jié)尾的密碼子，蘭科植物FT基因則偏好G/C結(jié)尾的密碼子[28-32]。本研究揭示的不同屬、不同密碼子位點(diǎn)和不同結(jié)構(gòu)域等3個(gè)層次的密碼子偏好鑲嵌性首次展示了蘭科植物基因密碼子偏好性的多樣性，其中不同結(jié)構(gòu)域的保守性在密碼子偏好性的差異，也為研究基因的功能和演化提供了不同的視角。

3.2 蘭科植物FNR基因聚類分析比較

根據(jù)蘭科植物FNR基因功能的穩(wěn)定及氨基酸序列最終保持蛋白質(zhì)的功能，氨基酸的聚類分析表明17條FNR基因目前的狀態(tài)，F(xiàn)NR密碼子選用偏好性是核酸序列由于堿基突變產(chǎn)生的同義密碼子選用的轉(zhuǎn)換，從而表現(xiàn)為區(qū)別于氨基酸聚類和CDS序列的聚類結(jié)果，其聚類位置的差異表現(xiàn)出所在物種的FNR基因的保守程度，而核酸序列與氨基酸序列的差異表現(xiàn)出所研究蘭科各種類的變異程度。

通常認(rèn)為親緣關(guān)系較近的物種密碼子偏好性較為一致，因此密碼子偏好性聚類也常常作為物種遺傳結(jié)構(gòu)分析的重要參考標(biāo)準(zhǔn)[33]。本研究中的17條蘭科植物基于CDS、氨基酸序列的聚類結(jié)果與蘭科植物基因組復(fù)制事件聚類結(jié)果相似[34]，而FNR基因基于RSCU聚類結(jié)果與基于CDS、氨基酸序列的聚類結(jié)果有明顯差異，表明基于CDS、氨基酸序列聚類方法更符合植物進(jìn)化規(guī)律，而對于RSCU聚類產(chǎn)生的差異，推測其原因是密碼子選用偏好性聚類在較小的分類單元中具有較高準(zhǔn)確性，在較大樣本分類中，只能作為傳統(tǒng)分類的補(bǔ)充[28， 35]。

3.3 蘭科植物FNR基因密碼子偏好性影響因素

基因長度、GC含量、tRNA豐度、mRNA二級結(jié)構(gòu)、蛋白疏水性、氨基酸保守性、基因表達(dá)水平及遺傳密碼修復(fù)等基因組特征均與密碼子的偏好性有關(guān)[30]。自然選擇和堿基突變也是密碼子偏好性不可忽略的影響因素。本研究中蘭科植物FNR基因的密碼子中性繪圖、ENC繪圖及PR2偏好性綜合分析表明，該基因的密碼子偏好性是以選擇壓力的影響為主，與該基因表達(dá)水平有較強(qiáng)關(guān)系。該分析結(jié)果與蘭科植物FT基因[17]及文心蘭葉綠體基因組[31]密碼子偏好性的影響因素一致，而蝴蝶蘭葉綠體密碼子的偏向性主要受堿基差異和自然選擇，兩者影響程度相差不大，且堿基組成大于基因表達(dá)水平對它的影響，表明蘭科植物之間密碼子偏好性的影響因素存在差異。

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