張燕梅 李棟梁 李俊峰 趙艷龍 鹿志偉 楊子平 陸軍迎 周文釗

摘 要 斑馬紋病是劍麻的主要病害之一，本研究以劍麻斑馬紋病高感品種H.11648為材料，分別在接種煙草疫霉0、24、36、48、72 h取樣，用電鏡觀察H.11648葉片細胞超微結(jié)構(gòu)變化，同時分析過氧化氫酶（CAT）、過氧化物酶（POD）、苯丙氨酸解氨酶（PAL）、多酚氧化酶（PPO）、抗壞血酸過氧化物酶（APX）和超氧化物歧化酶（SOD）等防御酶活性變化情況。結(jié)果表明：H.11648在接種24 h，可見大量休止孢，葉綠體結(jié)構(gòu)被破壞，植物組織開始降解，隨著時間延長，附著孢出現(xiàn)，吸器形成，植物組織解體更嚴重，接種72 h，可見大量菌絲。在整個接種過程中，CAT、PAL和PPO活性顯著增強，72 h達到最高，分別為501.44、25.73、1 742.67 U/（g.min）。SOD和APX活性顯著下降，72 h達到最低，分別為2 888.62 U/g和841.96 ?mol/（g.min）。POD活性先下降72 h又上升，但均顯著低于接種前POD活性。本研究從細胞學(xué)和生理水平為探討劍麻與煙草疫霉互作關(guān)系提供了理論基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞 劍麻；煙草疫霉；超微細胞結(jié)構(gòu)；防御酶

中圖分類號 S563.8 文獻標識碼 A

Changes in Ultrastructure and Activities of Defense-related Enzymes in Leaves of Sisal H.11648 after Phytophthora nicotianae Breda Infection

ZHANG Yanmei， LI Dongliang， LI Junfeng， ZHAO Yanlong， LU Zhiwei， YANG Ziping，

LU Junying， ZHOU Wenzhao*

South Subtropical Crops Research Institute， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences /Zhanjiang Key Laboratory for Tropical Crops genetic improvement， Zhanjiang， Guangdong 524091， China

Abstract Zebra disease that caused by Phytophthora nicotianae Breda， is a major disease of sisal. In the present study， ultrastructural changes were examined by transmission and scanning microscopies and the activities of some defense-related enzymes （superoxide dismutase （SOD）， catalase （CAT）， peroxidase （POX）， ascorbate peroxidase （APX）， phenylalanine ammonia-lyase （PAL） and polyphenol oxidase （PPO）） were investigated in the leaves of susceptible sisal H.11648 at 0， 24， 36， 48， 72 h after they were inoculated with P. nicotianae breda. Many cysts were observed at 24 h after inoculation， and the chloroplast structure was destroyed and the plant tissue began to be degraded. With the prolongation of infection time， the appressorium appeared， haustoria formated，and plant tissue was seriously degraded. Many hypha were observed at 72 h after inoculation. The activity of CAT， PAL， PPO significantly increased during the infection process and reached the maximum value at 72 h after inoculation. The activity of CAT， PAL， PPO was 501.44， 25.73， 1 742.67 U/（g.min）， respectively. The activity of SOD and APX significantly decreased during the infection process and reached the minimum value at 72 h after inoculation. The activity of SOD and APX was 2 888.62 U/g and 841.96 ?mol/（g.min）， respectively. The activity of POD showed a decline at the beginning and then increased at 72 h after inoculation， but was lower than that of POD at 0 h after inoculation. The results would provide a cytological and physiological reference for revealing the interaction between sisal and P. nicotianae Breda.

Key words sisal； Phytophthora nicotianae Breda； ultrastructure； defense-related enzyme

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2018.06.018

劍麻不僅是一種極具特色的熱帶纖維作物，同時也是一種重要的生物質(zhì)能源作物[1-2]，劍麻莖心是釀造龍舌蘭酒的主要原料[3]，劍麻渣可制藥[4]。近年來，劍麻作為景天庚代謝的模式植物[5]，有非常重要的理論和經(jīng)濟價值。

斑馬紋病是劍麻的主要病害之一，主要由煙草疫霉（Phytophthora nicotianae Breda）引起，因斑馬紋病導(dǎo)致大面積劍麻園被毀，纖維產(chǎn)量下降，嚴重影響了劍麻產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[6-7]。國內(nèi)外學(xué)者對該病進行了大量研究，形成了一套完整的病原菌分離、鑒定和防治技術(shù)[8-9]，汪平等[10]利用轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)探討煙草疫霉處理前后的劍麻H.11648 RNA水平的變化，挖掘劍麻H.11648抗病相關(guān)基因，張燕梅[11]和Gao等[12]分別利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)，將外源基因轉(zhuǎn)入劍麻H.11648中，提高H.11648對煙草疫霉的抗性。但關(guān)于煙草疫霉是如何侵染劍麻，侵染后的行為是怎樣的，劍麻和煙草疫霉兩者是如何互作的還不了解，對煙草疫霉的致病機制和劍麻的抗病機理仍不清楚，也沒有關(guān)于該病電鏡觀察和防御酶活性測定方面的報導(dǎo)。針對上述現(xiàn)象，本研究以劍麻煙草疫霉感病品種H.11648為材料，通過對H.11648與煙草疫霉互作前后的防御酶活性和葉片細胞超微結(jié)構(gòu)的變化進行了研究，旨在從細胞學(xué)和生理生化水平為探討煙草疫霉在劍麻上的致病機制提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

植物材料為2年生劍麻H.11648盆栽苗，菌株為本實驗室前期分離保存的煙草疫霉（Phytophthora nicotianae Breda）。

1.2 方法

1.2.1 病原接種 將保存于PDA斜面的煙草疫霉轉(zhuǎn)接到V8培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)1周后接種。病原接種采用菌斑活體接種法，選取同一螺旋健康的葉片，接種前先用無菌水將葉片擦洗干凈，再用酒精棉反復(fù)擦拭葉片，然后用滅菌大頭針刺傷葉片表面，取直徑0.5 cm大小的菌餅將帶菌絲面貼于傷口處，用棉花保濕，每隔2 h加1次水，每3個生物學(xué)重復(fù)當作1個處理，每個處理重復(fù)3次。

分別在接種0、24、36、48、72 h時取離病斑0.5 cm外的H.11648葉片，經(jīng)液氮速凍后保存，用于防御酶活性測定。同時取健康組織和病斑交接處的H.11648葉片，經(jīng)固定液固定后，保存于4 ℃用于電鏡觀察。

1.2.2 電鏡觀察 掃描電鏡觀察：分別在接種0、24、36、48、72 h取H.11648葉片正常與病斑交接處的組織，先用物理法斷裂，然后經(jīng)固定、脫水、置換、干燥、制樣、噴金鍍膜后在Philips XL-30型掃描電子顯微鏡下觀察劍麻葉片斷層細胞及其內(nèi)含物的變化情況。具體參照李棟梁[13]的方法進行。

透射電鏡觀察：分別在接種0、24、36、48、72 h取H.11648葉片正常與病斑交接處2～3 mm厚的組織，迅速投入前固定液[2%戊二醛、0.05 mol/L pH 7.2 二甲基砷酸鈉（Na-CaCO）]中4 ℃保存。觀察前先用緩沖液沖洗3次，再經(jīng)固定、脫水、置換、浸透與包埋后進行切片（Leica UltracutR），最后染色后置于CM100透射電鏡下觀察煙草疫霉侵染過程中劍麻細胞的超微結(jié)構(gòu)。具體參照李棟梁[13]的方法進行。

1.2.3 防御酶活性測定 分別在接種0、24、36、48、72 h取離病斑0.5 cm外的H.11648葉片0.5 g，加入2 mL提前預(yù)冷的酶液提取液后于冰浴下研磨成漿，再加提取液沖洗2～3次（總體積為5 mL），轉(zhuǎn)入離心管中，于4 ℃10 000 r/min下離心15 min，取上清液分裝后于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

抗壞血酸過氧化物酶（APX）活性測定參考孫云等[14]的方法，以每分鐘氧化1 ?mol抗壞血酸（AsA）的酶量為一個酶活單位（U）。超氧化物歧化酶（SOD）活性測定參照南京建成公司的SOD試劑盒說明書進行，以每克鮮樣中SOD 抑制率達50%時所對應(yīng)的SOD量為一個酶活單位（U）。過氧化氫酶（CAT）活性測定采用比色法，具體參照劉琳等[15]的方法，以每分鐘內(nèi)A240變化0.01為1個酶活性單位（U）。過氧化物酶（POD）活性測定采用愈創(chuàng)木酚法，具體參照鄒琦[16]的方法進行，以每分鐘內(nèi)A470變化0.01為1個酶活性單位（U）。苯丙氨酸解氨酶（PAL）和多酚氧化酶（PPO）活性測定分別參照Jiang等[17]和Sangeetha等[18]的方法進行。

1.3 數(shù)據(jù)處理

上述所有數(shù)據(jù)均采用SAS 9.0軟件進行統(tǒng)計分析和差異顯著性分析（p<0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 H.11648接種煙草疫霉后的發(fā)病情況

分別在接種煙草疫霉24、36、48、72 h觀察H.11648葉片發(fā)病情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)H.11648在接種24 h葉片開始褪綠（圖1-b），接種36 h，肉眼可見有約0.9 cm的黃色病斑（圖1-c），隨著侵染時間的延長，病斑進一步擴大，顏色逐漸加深，接種72 h，可見深褐色輪紋狀病斑，大小約2.5 cm（圖1-e）。

2.2 H.11648接種煙草疫霉后的電鏡觀察

電鏡觀察表明，高感品種H.11648在接種0 h，細胞結(jié)構(gòu)完整，葉綠體呈橢圓形或圓形，線粒體清晰可見（圖2-A1、B1）；接種24 h，細胞內(nèi)可見大量休止孢（圖2-A2）和分泌物，葉綠體結(jié)構(gòu)破壞，植物組織被降解；接種36 h，葉綠體和核結(jié)構(gòu)進一步被破壞，植物組織降解更嚴重，可見大量的附著孢（圖2-A3、B2）和少量的嗜鋨粒，吸器形成（圖2-B3）；接種48 h，可見大量分泌物，植物組織進一步降解（圖2-A4）。接種72 h，細胞內(nèi)出現(xiàn)大量的菌絲，葉綠體結(jié)構(gòu)破壞，線粒體空泡化，有少量的淀粉粒和嗜鋨粒，孢子囊內(nèi)各細胞器結(jié)構(gòu)完整（圖2-A5、B5）。

2.3 H.11648接種煙草疫霉后抗氧化酶活性變化情況

H.11648在接種前（0 h）APX活性為（985.71±97.80） ?mol/（g.min），接種24 h達到最高，為（1 139.29±62.78） ?mol/（g.min）；接種36 h，APX活性最低，為（539.58±124.75） ?mol/（g.min）；接種48 h和72 h又恢復(fù)到正?；钚运?；在整個接種過程中，接種36 h后APX活性顯著低于接種前（0 h）和接種24 h。POD活性在接種前（0 h）為（361.83±57.88） U/（g.min），隨著時間的延長，POD活性顯著下降，接種36 h達到最低，為（50.63±2.23） U/（g.min），接種72 h又顯著上升；在整個接種過程中，POD活性呈現(xiàn)先下降后上升趨勢，并且接種前（0 h）POD活性顯著高于接種72 h，接種72 h POD活性顯著高于接種24、36、48 h。CAT活性在接種前（0 h）為（265.24±15.56） U/（g.min），接種24、36、48 h均略有上升，

接種72 h達到最高水平，為（501.44±25.73） U/（g.min），顯著高于接種0、24、36、48 h 時的CAT活性。SOD活性在接種前（0 h）為（7752.51±792.80） U/g，隨著時間的延長，SOD活性顯著下降，在接種72 h達到最低，為（2888.62±351.09） U/g。PAL活性在接種前（0 h）為（15.56±3.07） U/（g.min），隨著時間的延長，PAL活性逐漸上升，接種72 h達到最高，為（25.73±5.46） U/（g.min），顯著高于其他4個時間點。PPO活性在整個接種過程中先上升后下降最后又上升，在接種前（0 h）為（929.82±36.32） U/（g.min），在接種72 h達到最高，為（1742.67±113.50） U/（g.min），顯著高于其他4個時間點。接種24、36、48 h的PPO活性均顯著高于接種前（0 h）。

3 討論

電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，劍麻H.11648在接種病原菌后，可先后觀察到休止孢、附著孢以及吸器等典型的階段，并可見大量的菌絲在細胞間隙間擴展；附著孢周圍有大量的半球形分泌物出現(xiàn)。植物細胞中葉綠體結(jié)構(gòu)破壞，植物組織被降解。在致病疫霉侵染感病馬鈴薯過程中，游動孢子先形成休止孢，休止孢萌發(fā)后形成附著孢，附著孢通過產(chǎn)生侵染釘穿透寄主的表皮角質(zhì)層細胞壁進入寄主內(nèi)[19]。寄生疫霉也是通過附著孢的方式侵染擬南芥[20]。從電鏡觀察結(jié)果推測，煙草疫霉也可能是通過附著孢侵染劍麻。同時葉綠體結(jié)構(gòu)被破環(huán)，H.11648光合作用和能量代謝受到影響，而分泌物的出現(xiàn)則有利于病原菌更好的破壞植物組織，從中吸取營養(yǎng)，同時為其成功侵入劍麻組織提供幫助。

在接種36 h后可觀察到H.11648細胞內(nèi)吸器的形成，這在致病疫霉與感病馬鈴薯互作、寄生疫霉與擬南芥互作中均有報道[19-20]。以往的研究表明，真菌的吸器是宿主與病原菌營養(yǎng)物質(zhì)吸收、交換和運輸?shù)闹饕缑?，不僅可為病原菌生長和繁殖提供營養(yǎng)[21-23]，同時也是病原激發(fā)子運輸?shù)闹饕ǖ?，是宿主與病原菌相互識別以及宿主防御反應(yīng)啟動的主要場所[24]。卵菌與真菌在植物病原互作中有類似的模式，因此推測，H.11648細胞內(nèi)吸器的形成在煙草疫霉與劍麻互作過程中可能也有類似的功能。

本研究表明在煙草疫霉與劍麻H.11648互作過程中，PAL、PPO和CAT顯著上升，POX、APX和SOD明顯下降。PAL是植物次生產(chǎn)物如類黃酮、木質(zhì)素等代謝中的關(guān)鍵酶，在煙草疫霉侵染過程中，PAL活性的增強可加快H.11648木質(zhì)素的合成，使次生細胞壁的厚度增加，從而達到阻止煙草疫霉入侵，提高H.11648抗性的作用[25-28]，這與趙艷龍等[29]的研究結(jié)果基本一致。同樣的，PPO活性增強不僅可以促進H.11648細胞壁厚度的增加，同時也可以產(chǎn)生有抗病作用的醌類物質(zhì)[17，30]。CAT活性的增加則有利于維持H.11648細胞內(nèi)H2O2的平衡，減少活性氧對細胞的傷害，從而提高H.11648對煙草疫霉的抗性。這與Fortunato等[31]的研究結(jié)果一致。而Magbanua等[32]則認為，CAT活性降低可以使H2O2維持在較高濃度水平，這樣反過來可以增加植物對病原菌的耐受力，提高植物的抗性[33-34]。而SOD、POD和APX活性降低，產(chǎn)生的H2O2不能及時轉(zhuǎn)化成H2O和O2，則使H.11648細胞內(nèi)活性氧積累，盡管增加了H.11648對病原菌的耐受性，同時又加速了活性氧對細胞膜的傷害[35]，這也可能是導(dǎo)致H.11648感病的原因，這與Debona等[36]的研究結(jié)果相反。

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