汪茜 馮重陽 張金蓮 宋娟 袁照年 黃京華 陳廷速

摘 要 為了探明甘蔗根際土壤 AM 真菌群落季節(jié)性變化規(guī)律及其影響因素，2016年4月、8月、10月和12月在里建甘蔗試驗(yàn)基地，采集4個(gè)施肥水平（0%、25%、50%、100%）下的甘蔗根際土壤，采用高通量測序技術(shù)分析不同施肥水平下AM 真菌群落季節(jié)變化規(guī)律。結(jié)果表明：4個(gè)季節(jié)共檢測到10屬AM真菌，AM真菌Chaol、Shannon-Wiener指數(shù)Shannon-Wiener和Invsimpson index指數(shù)從春季到冬季呈先降后升的趨勢(shì)，夏季最低；4個(gè)季節(jié)共檢測出281個(gè)AM真菌OTUs（operational taxonomic units），春季、夏季、秋季、冬季的OTUs數(shù)目分別為160、68、103、198個(gè)。4個(gè)季節(jié)甘蔗根際土壤中球囊霉屬（Glomus）占有絕對(duì)的優(yōu)勢(shì)，之后是類球囊霉屬（Paraglomus）和多樣孢囊霉屬（Diversispora）。此外，也有少量的原囊霉屬（Archaeospora）、巨孢囊霉屬（Gigaspora）、無梗囊霉屬（Acaulospora）、盾巨孢囊霉屬（Scutellospora）和兩性球囊霉屬（Ambispora）。不同季節(jié)AM真菌群落組成差異顯著，但總體來說冬季和春季種群結(jié)構(gòu)相似，夏季和秋季相似，而夏季和秋季的AM真菌種類比春季和冬季的AM真菌種類多。

關(guān)鍵詞 AM真菌；群落；季節(jié)性變化；甘蔗；高通量測序

中圖分類號(hào) S154.3 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

Abstract In this paper， four seasonal variation of AM fungal community in the rhizosphere of sugarcane was investi-gated by Illumina MiSeq and influencing factors were analyzed. Soil samples were collected from the rhizosphere of sugarcane plants under four different fertilization levels （0%， 25%， 50% and 100%） in April， August， October and De-cember 2016， respectively. A total of 10 genera of AM fungi were discovered. Shannon-Weiner indices， richness and Simpson Index of AM fungi decreased first and then increased from spring to winter， lowest values occurred in summer. A total of 281 AM fungal OTUs （operational taxonomic units） were detected in four seasons， with 160 OTUs， 68 OTUs， 103 OTUs， and 198 OTUs in spring， summer， autumn and winter， respectively. Glomus was the most dominant genus in the soils in the study， followed by Paraglomus and Diversispora. A small number of Archaeospora， Gigaspora， Acau-lospora， Scutellospora and Ambispora species were also identified. AM fungal community compositions in summer and autumn were significantly different from that of spring and winter， while the difference was not significant between summer and autumn. AM fungi species in summer and autumn were more than those in spring and winter.

Keywords arbuscular mycorrhizal fungi； community； seasonal variation； sugarcane； Illumina MiSeq

DOI 10.3969/j.issn.1000-2561.2018.09.002

叢枝菌根（arbuscular mycorrhizal，AM）是由球囊霉（Glomeromycota）真菌與植物根系形成的互惠共生體，是自然界中最普遍的一種菌根類型，與約20萬種植物都能形成叢枝菌根[1-4]。AM真菌與植物根系共生后，可促進(jìn)植物吸收養(yǎng)分[5]，不僅能通過提高植物對(duì)養(yǎng)分的吸收，達(dá)到使作物增產(chǎn)提高其經(jīng)濟(jì)效益的目的，還可以修復(fù)土壤[6-8]，能減少化肥的使用量，提高農(nóng)作物產(chǎn)量，而且在提高植物的抗逆性、抗病性以及改善根際生態(tài)位的養(yǎng)分組成和微生物群落結(jié)構(gòu)等方面也發(fā)揮著關(guān)鍵作用[9-10]。

甘蔗是我國重要的糖料作物。由于缺乏宿根性優(yōu)良的品種、品種單一、品種退化、地力下降以及甘蔗生產(chǎn)條件總體較差等原因，中國的甘蔗產(chǎn)量長期停留在較低水平，加之近年來干旱對(duì)甘蔗產(chǎn)業(yè)的影響日趨嚴(yán)重[11]，因此，如何提高甘蔗的產(chǎn)量和抗逆性成為我國甘蔗產(chǎn)業(yè)發(fā)展中急需解決的問題。我國多數(shù)蔗區(qū)由于多年連作和過度施用化肥造成嚴(yán)重的土壤退化問題，已無法通過增施化肥來提高產(chǎn)量。過量施用化肥不僅沒有提高甘蔗產(chǎn)量[11-13]，而且造成了土壤板結(jié)、結(jié)構(gòu)性變差、酸化、保水保肥能力降低等嚴(yán)重的問題，對(duì)環(huán)境造成了巨大的壓力[14]。多項(xiàng)研究證明，AM真菌能夠促進(jìn)甘蔗生長，并改善蔗園土壤生態(tài)。接種AM真菌的甘蔗根系較發(fā)達(dá)，株高、綠葉數(shù)和莖徑均比對(duì)照有明顯優(yōu)勢(shì)，且耐旱性能有所增強(qiáng)[15-17]；AM真菌能夠提高蔗園土壤pH，促進(jìn)根系對(duì)土壤營養(yǎng)物質(zhì)的吸收，提高甘蔗產(chǎn)量10%～ 24%，減少化肥用量30%以上[12]。AM真菌的分布、侵染、產(chǎn)孢及其生理效應(yīng)受生態(tài)因子影響，尤其以土壤因子（主要包括土壤類型、pH、養(yǎng)分、有機(jī)質(zhì)等）對(duì)AM真菌的影響較為突出[18]。因此，本研究通過高通量測序的方法，研究不同季節(jié)對(duì)不同施肥水平下的甘蔗根際AM真菌多樣性及其與土壤因子的關(guān)系，以便為篩選適合甘蔗生長的高效菌種、利用菌根生物技術(shù)提高甘蔗產(chǎn)量和品質(zhì)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)在廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院里建基地建立的甘蔗原位觀察試驗(yàn)地進(jìn)行，所用甘蔗品種為桂柳05-136（其親本來源于新臺(tái)糖22號(hào)）。所用肥料為西洋復(fù)合肥N：P：K=15：15：15。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 設(shè)4個(gè)不同的施肥水平，分別為0%施肥水平（底肥0 kg/hm2，追肥0 kg/hm2）、25%施肥水平（底肥187.50 kg/hm2，追肥187.50 kg/hm2）、50%施肥水平（底肥375.00 kg/hm2，追肥375.00 kg/hm2）和100%施肥水平（底肥750.00 kg/hm2，追肥750.00 kg/hm2）（按照廣西甘蔗常規(guī)種植中的施肥水平）。每個(gè)施肥水平3個(gè)小區(qū)（重復(fù)），小區(qū)隨機(jī)分布。每個(gè)小區(qū)長7 m，寬6.5 m，小區(qū)面積45.5 m2，行距1.3 m，種5行甘蔗（2015年1月種植）。各個(gè)相鄰小區(qū)之間種植兩行桂糖-29號(hào)作為隔離。

1.2.2 樣品采集 分別于2016年4月、8月、10月和12月，分4次采集甘蔗根圍土壤。在距離甘蔗根部約10 cm的地方，先鏟去2～3 cm的表層土，然后拿鐵锨鏟出一個(gè)耕層斷面，刮去部分?jǐn)嗝嫱寥篮?，再平行于斷面從上到下均勻取土，采樣深度?～20 cm表層土壤。每次取樣均采集3個(gè)小區(qū)的土壤混合為一個(gè)土樣。采集到的新鮮土樣盡快帶回實(shí)驗(yàn)室，并分成2份，1份土樣放于4 ℃保存?zhèn)溆茫?份存于–20 ℃用于后續(xù)提取土壤總DNA。土壤理化性狀見表1。

1.2.3 研究方法 土壤 DNA 使用土壤基因組DNA提取試劑盒（MP biomedicals 公司）進(jìn)行提取。將提取到的DNA樣品經(jīng)過1%瓊脂糖凝膠電泳電泳檢測，測定DNA樣品濃度。第一次PCR反應(yīng)用真核引物GeoA2 /Geo11（由上海生工生物工程技術(shù)有限公司完成），反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，59 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，共進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。

第二次PCR反應(yīng)以第一次PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，用TE適當(dāng)稀釋。引物為AM真菌的特異性引物NS31/AML2（由上海生工生物工程技術(shù)有限公司完成）。反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，58 ℃退火1 min，72 ℃退火1 min，共進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。第二輪PCR產(chǎn)物同樣以1%的瓊脂糖凝膠檢測是否有大小合適的條帶，將PCR樣品由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行Illumina Miseq測序。

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用Mothur軟件（1.30.1）對(duì)實(shí)測OTUs數(shù)、Chaol指數(shù)、Shannon-Wiener指數(shù)和Invsimpson指數(shù)進(jìn)行rarefaction分析。為比較不同季節(jié)AM真菌群落組成的差異性，利用PCORD軟件（5.0）進(jìn)行主坐標(biāo)分析（principal coordinate analysis，PCO）和PERMANOVA分析。利用Canoco軟件（4.5）的冗余分析（redundancy analysis，RDA）描述不同季節(jié)AM真菌豐富度和多樣性指數(shù)與采樣季節(jié)、土壤和植被因子間的關(guān)系[19]。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同季節(jié)AM真菌種群差異

4月、8月、10月和12月檢測到的OTU數(shù)目分別為160、68、103和195個(gè)，不同季節(jié)共有和特有的AM真菌OTUs如圖1所示。4個(gè)季節(jié)共有OTU數(shù)目39個(gè)，春季和冬季共有的AM真菌OTUs較多，為96個(gè)；春季和夏季共有的AM真菌OTUs較少，為44個(gè)。特有的AM真菌OTUs卻表現(xiàn)出一樣的趨勢(shì)：春季和冬季較多，分別為57、69個(gè)；夏季和秋季較少，分別為6、14個(gè)。說明隨著季節(jié)的變化，AM真菌豐富度呈現(xiàn)先減小后增加的趨勢(shì)。

2.2 不同季節(jié)AM真菌種群組成

在屬的分類水平上，312個(gè)OTU被分類到10個(gè)屬，分別為原囊霉屬（Archaeospora）、巨孢囊霉屬（Gigaspora）、無梗囊霉屬（Acaulospora）、類球囊霉屬（Paraglomus）、盾巨孢囊霉屬（Scutellospora）、多樣囊霉科球囊霉屬（Diversisporaceae Glomus）、球囊霉屬（Glomus）、多樣孢囊霉屬（Diversispora）、兩性球囊霉屬（Ambispora）以及2個(gè)在屬水平上無法分類的多樣囊霉科unclassified_f_Diversisporaceae和未分類的球囊霉綱unclassified_c_Glomeromycetes（圖2）。

各季節(jié)AM真菌種群的優(yōu)勢(shì)屬均為球囊霉屬。隨著季節(jié)變化，多樣囊霉屬、未分類的球囊霉綱、未分類的多樣囊霉科、巨孢囊霉屬、原囊霉屬含量基本呈下降趨勢(shì)，而類球囊霉屬含量秋季最多，盾巨孢囊霉屬在夏、秋、冬季節(jié)含量基本保持不變。此外，未分類的多樣囊霉科只存在于春季和夏季，盾巨孢囊霉屬和無梗囊霉屬春季中沒有，多樣囊霉屬在冬季中沒有。綜上所述，春季和冬季的AM真菌種類比夏季和秋季的AM真菌種類少。

2.3 AM真菌多樣性指數(shù)和豐富度分析

由表2可知，各樣品多樣性指數(shù)有差異。0%施肥水平AM真菌豐富度隨季節(jié)的變化表現(xiàn)為先減小后增大再減小，總體呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)。25%施肥水平、50%施肥水平和100%施肥水平AM真菌豐富度隨季節(jié)的變化總體上均呈上升的趨勢(shì)，不同之處在于4—8月時(shí)100%施肥水平呈下降趨勢(shì)。

Invsimpson指數(shù)發(fā)現(xiàn)，0%施肥水平和25%施肥水平在10月時(shí)多樣性最高，而50%施肥水平和100%施肥水平在12月是多樣性最高。

12月100%施肥水平的Shannon-wiener指數(shù)最高，達(dá)3.23；4月和8月100%施肥水平的Shannon-Wiener指數(shù)最低，分別為1.68和1.35。

2.4 不同季節(jié)的Plsda分析

不同季節(jié)的Plsda分析結(jié)果如圖3所示。第一主成分（COMP1）解釋了變量方差的13.54%，第二主成分（COMP2）解釋了變量方差的11.76%，累計(jì)貢獻(xiàn)率為25.3%。不同季節(jié)的樣品在坐標(biāo)系中分布有明顯的差異，10月在P1坐標(biāo)軸上與4月、8月、12月分開，4月與8月在P2坐標(biāo)軸上與10月、12月分開，說明4月與8月AM真菌種群結(jié)構(gòu)較為相似。

3 討論

目前，有關(guān)AM真菌季節(jié)變化的研究大多集中于孢子形態(tài)學(xué)鑒定[20]、末端限制性長度多態(tài)性（terminal restriction fragment length polymorphism，T-RFLP）[21-22]、變性梯度凝膠電泳 （ dena?t?u????ring ?-gradient gel electrophoresis，DGGE）[15]等技術(shù)，利用高通量測序技術(shù)研究AM真菌群落動(dòng)態(tài)的報(bào)道比較少[23-24]。本研究應(yīng)用高通量測序技術(shù)評(píng)估了甘蔗根圍AM真菌種群組成的季節(jié)動(dòng)態(tài)。

不同季節(jié)AM真菌種群組成差異顯著，但總體來說冬季和春季種群結(jié)構(gòu)相似，夏季和秋季相似，這與賀學(xué)禮等[25]報(bào)道的金銀花根際土壤AM真菌多樣性的季節(jié)性變化研究結(jié)果一致。春季和冬季的AM真菌種類比夏季和秋季的AM真菌種類少。這可能是因?yàn)锳M真菌屬于專性共生菌，不能直接獲取光合產(chǎn)物，必須依賴寄主植物提供碳水化合物，光照條件影響植物光合作用，從而影響AM真菌群落組成。

通過AM真菌種群在屬水平上的分布及相對(duì)豐度圖可知，蔗田土壤中含量最高的是球囊霉屬（Glomus），之后是類球囊霉屬（Paraglomus）和多樣孢囊霉屬（Diversispora），以及少量的原囊霉屬（Archaeospora）、巨孢囊霉屬（Gigaspora）、無梗囊霉屬（Acaulospora）、盾巨孢囊霉屬（Scutellospora）和兩性球囊霉屬（Ambispora）。AM真菌種群中球囊霉屬所占的比例隨時(shí)間的變化都是8月到10月降低，10月到12月升高；而類球囊霉屬則表現(xiàn)出相反的趨勢(shì)：8月到10月升高，10月到12月降低。

本研究中施肥處理在12月時(shí)AM真菌的多樣性要高于不施肥處理，但在后續(xù)分析中發(fā)現(xiàn)，12月時(shí)施肥處理在屬水平上的多樣性卻低于不施肥處理，而且?guī)缀跞繛榍蚰颐箤?。造成這一現(xiàn)象的原因可能是施肥降低了AM真菌在屬水平上的多樣性，但卻增加了球囊霉屬的多樣性。這與高萍等[26]和Jansa等[27]發(fā)現(xiàn)施肥會(huì)增加球囊霉屬的多樣性而降低AM真菌的多樣性結(jié)果一致。

本研究結(jié)果表明，甘蔗根際土壤AM真菌豐富度和多樣性在夏季和秋季顯著高于春季和冬季，并且夏季和秋季的AM真菌種群組成與春季和冬季存在顯著差異。研究結(jié)果對(duì)進(jìn)一步探討AM真菌在甘蔗不同生長季節(jié)發(fā)揮的作用，以及篩選合適的AM真菌進(jìn)行以菌根為主的甘蔗干旱生態(tài)系統(tǒng)的植被恢復(fù)具有重要的意義。

4 結(jié)論

4個(gè)季節(jié)共檢測到10屬AM真菌，AM真菌豐富度、Shannon-Wiener指數(shù)和Invsimpson指數(shù)從春季到冬季先降后升，夏季最低；4個(gè)季節(jié)共檢測出281個(gè)AM真菌OTUs（operational taxonomic units），春季、夏季、秋季、冬季的OTUs數(shù)目分別為160、68、103、198個(gè)。4個(gè)季節(jié)甘蔗根際土壤中球囊霉屬（Glomus）占有絕對(duì)的優(yōu)勢(shì)，之后是類球囊霉屬（Paraglomus）和多樣孢囊霉屬（Diversispora）。此外，也有少量的原囊霉屬（Archaeospora）、巨孢囊霉屬（Gigaspora）、無梗囊霉屬（Acaulospora）、盾巨孢囊霉屬（Scutellospora）和兩性球囊霉屬（Ambispora）。

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