汪金梅 于旭東 蔡澤坪 徐詩濤 羅佳佳 楊紫薇

摘 要 以扇葉鐵線蕨（Adiantum flabellulatum L.）孢子為實驗材料，通過不同濃度2，4表油菜素內酯（2，4-epibrassinolide，2，4-eBL）處理，觀察孢子萌發(fā)及原葉體的生長狀況。結果表明：10–10 mol/L 2，4-eBL促進扇葉鐵線蕨孢子萌發(fā)，10–11 mol/L 2，4-eBL促進原葉體生長。本實研究不僅為促進扇葉鐵線蕨孢子萌發(fā)和原葉體生長提供新方法，而且還為研究植物激素調控蕨類植物生長提供參考。

關鍵詞 油菜素類固醇；扇葉鐵線蕨；配子體；孢子萌發(fā)

中圖分類號 Q949.9 文獻標識碼 A

Abstract The spores of Adiantum flabellulatum L. were treated with different concentrations of 2，4-epibrassinolide to observe the spore germination and the growth of the gametophyte. The results showed that 10–10 mol/L 2，4-eBL could shorten the spore germination， and 10–11 mol/L 2，4-eBL could promote the growth of the gametophyte. This experiment would not only provide new ways to promote the spore germination and gametophyte growth of A. flabellulatum， but also provide references for the study of phytohormones in the regulation of the growth of ferns.

Keywords brassinosteroids； Adiantum flabellulatum L.； gametophyte； spore germination

DOI 10.3969/j.issn.1000-2561.2018.09.009

油菜素類固醇（Brassinosteroids， BRs），是一類天然的植物激素，廣泛存在于植物的花粉、種子、莖、葉等器官中[1-2]，其能提高植物的抗逆性，在種子萌發(fā)、營養(yǎng)生長及生殖生長等諸多方面都有調控作用[3-5]。在油菜素類固醇對植物的生理作用研究中，以擬南芥（Arabidopsis thaliana （L.） Heynh.）、水稻（Oryza sativa L.）、豌豆（Pisum sativum L.）和番茄（Lycopersicon esculentum Mill.）等較為深入[6-8]；然而，關于BRs在蕨類植物中的作用知之甚少，僅在歐洲蕨（Pteridium aquilinum （L.） Kuhn）、紫萁（Osmunda japonica Thunb.）、問荊（Equisetum arvense L.）等少數(shù)物種中有研究報道[9-10]。

扇葉鐵線蕨（Adiantum flabellulatum L.）具有良好的觀賞價值及藥用價值，在醫(yī)療衛(wèi)生及園林設計中均有應用。國內外諸多學者研究了各類植物激素對其生長發(fā)育過程的影響，如高濃度2，4-二氯苯氧乙酸（2，4-D）會抑制其原葉體增殖，吲哚丁酸（IBA）使原葉體只進行營養(yǎng)增殖而不進行有性生殖，萘乙酸（NAA）促進綠色球狀體（GGB）增值與分化等[11-13]；然而關于BRs對扇葉鐵線蕨生長的影響還未見報道。本研究以扇葉鐵線蕨孢子為實驗材料，探究不同濃度的2，4表油菜素內酯（2，4-epibrassinolide，2，4-eBL）對其孢子萌發(fā)及原葉體生長的影響，不僅為促進扇葉鐵線蕨孢子萌發(fā)和原葉體生長提供新方法，而且還為研究植物激素調控蕨類植物生長提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

扇葉鐵線蕨孢子采自海南儋州橡膠林。將具有成熟孢子的葉片采下，用手輕輕揉搓孢子囊，將脫落下的孢子收集于干燥密閉容器中，于4 ℃低溫保存。

1.2 方法

1.2.1 2，4-eBL對扇葉鐵線蕨孢子萌發(fā)時間的影響 將新采摘的孢子及常溫貯藏2個月的孢子分別用無紡布包裹后，用75%乙醇浸泡30 s，再用75%乙醇和0.1%升汞1：9混合液消毒4 min，最后用無菌水沖洗4～5遍[12-14]。在超凈工作臺上，將消毒孢子接入2，4-eBL濃度分別為0、10–13、10–12、10–11、10–10、10–9、10–8、10–7、10–6 mol/L的1/4 MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)[15-17]。自接種6 d起，每天用顯微鏡觀察各濃度下孢子是否萌發(fā)。

1.2.2 2，4-eBL對扇葉鐵線蕨孢子萌發(fā)率的影響 將常溫貯藏2個月的孢子消毒后接入2，4-eBL濃度分別為0、10–13、10–12、10–11、10–10、10–9、10–8、10–7、10–6 mol/L的1/4 MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)。接種后第20天，統(tǒng)計各濃度梯度下培養(yǎng)瓶中的孢子數(shù)量及萌發(fā)數(shù)量。

1.2.3 2，4-eBL對扇葉鐵線蕨原葉體生長的影響 把消毒后的孢子接入1/4 MS培養(yǎng)基中，培養(yǎng)60 d后，將得到的無菌原葉體繼代于2，4-eBL濃度分別為0、10–12、10–11、10–10、10–9、10–8、10–7、10–6 mol/L的1/4MS培養(yǎng)基中。繼代培養(yǎng)20、40 d后，測量各濃度下的原葉體大小及原葉體細胞 大小。

1.2.4 培養(yǎng)條件 溫度為（24±2） ℃，光強為20 μmol/（m2·s），光照16 h/d，黑暗8 h/d。培養(yǎng)基消毒前調pH 6.0，每組處理設置8個重復，每個重復8個樣品。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

向每個培養(yǎng)瓶中加入500 ?L蒸餾水，將培養(yǎng)基上的孢子充分洗脫得到孢子懸濁液，吸取60 ?L孢子懸濁液在顯微鏡下進行計數(shù)。扇葉 鐵線蕨孢子萌發(fā)率=孢子萌發(fā)數(shù)量/孢子總 數(shù)量×100%；原葉體大小采用Image J軟件測 量；用u檢驗進行實驗組與對照組的顯著性 分析。

2 結果與分析

2.1 2，4-eBL對扇葉鐵線蕨孢子萌發(fā)時間的 影響

常溫貯藏2個月的孢子于接種后第8天開始萌發(fā)，最先萌發(fā)的2，4-eBL濃度為10–10 mol/L，接種第10天各濃度梯度下的孢子均有萌發(fā)。新鮮孢子萌發(fā)較貯藏2個月的孢子萌發(fā)晚，于接種后第12天開始萌發(fā)，最先萌發(fā)的2，4-eBL濃度也為10–10 mol/L，接種第15天各濃度梯度下的孢子均萌發(fā)。由此可見，10–10 mol/L 2，4-eBL利于扇葉鐵線蕨孢子萌發(fā)，最短萌發(fā)時間為8 d；且常溫貯藏2個月的扇葉鐵線蕨孢子比新鮮孢子先萌發(fā)4～ 5 d。

2.2 2，4-eBL對扇葉鐵線蕨孢子萌發(fā)率的影響

外源施加2，4-eBL能促進扇葉鐵線蕨孢子萌發(fā)。由表1可知，無2，4-eBL的情況下接種第20天孢子萌發(fā)率為4.47%，10–10 mol/L 2，4-eBL處理的扇葉鐵線蕨孢子萌發(fā)率最高，達29.65%；當濃度高于10–10 mol/L時，促進效果逐漸減弱。

2.3 2，4-eBL對扇葉鐵線蕨原葉體生長的 影響

低濃度2，4-eBL能促進扇葉鐵線蕨原葉體生長，高濃度則產生抑制作用。繼代20 d，不添加2，4-eBL，原葉體高度和直徑分別為4.20、5.20 mm，施加10–11 mol/L 2，4-eBL，原葉體生長效果最佳，高度和直徑分別為5.74、5.53 mm，是對照的1.15、1.10倍（表2，圖1）；且該濃度下細胞面積也最大，達7 000.73 μm2，為對照組的1.15倍（表3，圖2）。繼代40 d，以10–10 mol/L 2，4-eBL處理效果較好，原葉體高度、直徑及細胞面積分別為8.05 mm、10.57 mm、8 939.99 μm2，分別為對照的1.02、1.13、1.36倍（表4，表5）；而高濃度2，4-eBL在原葉體生長期間則產生明顯的抑制作用（圖3，圖4）。

2.4 高濃度2，4-eBL對扇葉鐵線蕨原葉體生長的褐化作用

當2，4-eBL濃度高于10–8 mol/L時，繼代培養(yǎng)40 d的扇葉鐵線蕨原葉體出現(xiàn)褐化現(xiàn)象，褐化率為21.3%；隨著2，4-eBL濃度的增加，褐化作用越加明顯，當2，4-eBL濃度為10–6 mol/L時，褐化率高達38.3%（表6）。顯微觀察發(fā)現(xiàn)，褐 化現(xiàn)象最初出現(xiàn)在單個細胞中，繼而向四周的 細胞擴散，褐化率較高時可使整個原葉體死亡（圖5）。

3 討論

各學者研究得出的孢子萌發(fā)時間從4 d到2個月不等[13， 18]。導致研究結果產生較大差異的原因可能是孢子采收的成熟度及貯藏時間和方式的不同。本研究利用成熟孢子，發(fā)現(xiàn)2，4-eBL能縮短扇葉鐵線蕨孢子萌發(fā)時間，10–10 mol/L 2，4-eBL處理的孢子萌發(fā)僅需8 d，接種20 d萌發(fā)率達29.65%。本研究還發(fā)現(xiàn)，常溫貯藏2個月的孢子比新鮮孢子先萌發(fā)，推測常溫貯藏可能促進孢子后熟。

低濃度2，4-eBL利于扇葉鐵線蕨原葉體生長發(fā)育，生長初期以10–10 mol/L最佳，后期以10–10、10–9 mol/L較為適宜，高濃度則產生明顯的抑制作用。原葉體細胞面積測量結果顯示，原葉體體積較大時，相應的細胞面積也較大，由此推測2，4-eBL對原葉體生長的影響可能是由調控細胞大小所致。BRs具有很高的生理活性，但綜合實驗結果發(fā)現(xiàn)，BRs對扇葉鐵線蕨孢子萌發(fā)及原葉體生長的影響也表現(xiàn)為低濃度促進高濃度抑制。

當2，4-eBL濃度高于10–7 mol/L時，繼代培養(yǎng)40 d的扇葉鐵線蕨原葉體出現(xiàn)明顯的褐化作用，隨著BRs濃度的增加，褐化率也隨之增長。顯微觀察發(fā)現(xiàn)，褐化現(xiàn)象最初出現(xiàn)在單個細胞中，繼而向四周的細胞擴散；褐化率過高時可使整個原葉體死亡。產生褐化現(xiàn)象的原因可能是BRs能提高多酚氧化酶的活性或者促進酚類化合物的形成，具體原因還有待更深入的研究[19-20]。

參考文獻

[1] 侯雷平， 李梅蘭. 油菜素內酯（BR）促進植物生長機理研究進展[J]. 植物學報， 2001， 18（5）： 560-566.

[2] 楊鑫鑫， 潘秋紅. 油菜素甾醇分析方法概述及其在果實中的應用[J]. 熱帶生物學報， 2016， 7（1）： 139-146.

[3] 王紅紅， 李凱榮， 侯華偉. 油菜素內酯提高植物抗逆性的研究進展[J]. 干旱地區(qū)農業(yè)研究， 2005， 23（3）： 213-219.

[4] 靳開川， 何金環(huán). 油菜素內酯在植物抗逆中的作用及信號傳導機制綜述[J]. 江蘇農業(yè)科學， 2017， 45（14）： 4-7.

[5] Yokota T， Ohnishi T， Shibata K， et al. Occurrence of brassinosteroids in non-flowering land plants， liverwort， moss， lycophyte and fern[J]. Phytochemistry， 2017， 136： 46-55.

[6] 華智銳， 李小玲. 油菜素內酯對小麥幼苗抗旱性的誘導效應[J]. 江蘇農業(yè)科學， 2017， 45（1）： 62-65.

[7] Hirano K， Yoshida H， Aya1 K， et al. Small organ size 1 and small organ size 2/dwarf and low-tillering form a complex to integrate auxin and brassinosteroid signaling in rice[J]. Molecular Plant， 2017， 4（10）： 590-604.

[8] 毛玉嬌. 干旱脅迫下油菜素內酯對番茄幼苗生長的影響[D]. 咸陽： 西北農林科技大學， 2016.

[9] 范鵬麗， 孫曉霞， 吳 光， 等. 紫萁油菜素內酯受體cDNA的克隆及其進化分析[J]. 生命科學研究， 2015， 19（4）： 310-315.

[10] Inoue S， Iwashita N， Takahashi Y， et al. Brassinosteroid involvement in Arabidopsis thaliana stomatal opening[J]. Plant and Cell Physiology， 2017， 58（6）： 1 048-1 058.

[11] Wu H， Yuan L P， Wang Y， et al. Studies on in vitro culture of Adiantum flabellulatum from spores[J]. Acta HorticulturaeSinica， 2010， 37（3）： 457-464.

[12] Chen C. Tissue Culture and Regeneration of Adiantum flabellulatum[J]. Journal of Fujian Forestry Science & Technology， 2011， 38（4）： 65-68.

[13] 王 洋. 扇葉鐵線蕨孢子離體培養(yǎng)及其快繁體系的建立[D]. 武漢： 華中農業(yè)大學， 2008.

[14] 李 靜， 夏桂春， 龔 慧， 等. 狹眼鳳尾蕨的形態(tài)發(fā)生及組織培養(yǎng)[J]. 熱帶作物學報， 2008， 29（5）： 626-631.

[15] Szekeres M， Németh K， Mathur J， et al. Brassinosteroids rescue the deficiency of CYP90， a cytochrome P450， controlling cell elongation and de-etiolation in Arabidopsis[J]. Cell， 1996， 85（2）： 171-182.

[16] Sharma P， Kumar A， Bhardwaj R. Plant steroidal hormone epibrassinolide regulate-Heavy metal stress tolerance in Oryza sativa L. by modulating antioxidant defense expression[J]. Environmental & Experimental Botany， 2016， 122： 1-9.

[17] Li J， Nagpal P， Vitart V， et al. A role for brassinosteroids in light-dependent development of Arabidopsis[J]. Science， 1996， 272（5 260）： 398-401.

[18] Cao J G， Huang W J， Wang Q X. Microstructural observation on the development of gametophytes and oogenesis in the fern Adiantum flabellulatum L.[J]. Acta Botanica Boreali-Occidentalia Sinica， 2010， 30（4）： 702-707.

[19] Creasy L L. The increase in phenylalanine ammonia-lyase activity in strawberry leaf disks and its correlation with flavonoid synthesis[J]. Phytochemistry， 1968， 7（3）： 441-446.

[20] 王 棟， 買合木提·克衣木， 玉永雄， 等. 植物組織培養(yǎng)中的褐化現(xiàn)象及其防止措施[J]. 黑龍江農業(yè)科學， 2008， 8（1）： 7-10.