李俊江 宋圓圓 劉雁濱 郭延凱 張偉宏 趙蕊 廉靜

摘要：針對微生物還原亞硒酸鹽過程普遍存在的時間較長的問題，考察了4種水溶性醌類介體（α-AQS，AQS，1，5-AQDS和AQDS）對奧奈達希瓦氏菌（Shewanella oneidensis MR-1）還原亞硒酸鹽過程的加速作用，通過單因素試驗優(yōu)化了培養(yǎng)條件，對硒納米顆粒的Zeta電位和粒徑進行了表征。結(jié)果表明，4種醌類介體都加速了亞硒酸鹽的還原，其中，AQDS的加速效果最顯著；在pH值為8.0，溫度為30 ℃，AQDS濃度為0.2 mmol/L條件下，48 h時亞硒酸鹽的轉(zhuǎn)化率達到100%；加入AQDS后會生成更大尺寸的硒納米顆粒，并可能使硒納米顆粒表面包裹的有機物質(zhì)成分及含量發(fā)生改變。研究結(jié)果為Shewanella oneidensis MR-1修復亞硒酸鹽污染的實際應(yīng)用提供了理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：水污染防治工程；奧奈達希瓦氏菌；亞硒酸鹽；硒納米顆粒；條件優(yōu)化；氧化還原介體

中圖分類號：X712文獻標志碼：A

Characteristics of selenite bioreduction by Shewanella

oneidensis MR-1 with redox mediators

LI Junjiang1，2， SONG Yuanyuan3，4， LIU Yanbin5， GUO Yankai1，2，

ZHANG Weihong3，4， ZHAO Rui3，4， LIAN Jing1，2

（1. School of Environmental Science and Engineering， Hebei University of Science and Technology， Shijiazhuang， Hebei 050018， China； 2. Pollution Prevention Biotechnology Laboratory of Hebei Province， Shijiazhuang， Hebei 050018， China； 3. School of Environmental and Municipal Engineering， Tianjin Chengjian University， Tianjin 300384， China； 4. Tianjin Key Laboratory of Aquatic Science and Technology， Tianjin 300384， China；5. Construction Office， Shijiazhuang Qiaodong Sewage Treatment Project， Shijiazhuang， Hebei 050026， China）

Abstract：Accelerating the selenite reduction rate is important in selenite bioreduction by microorganism process. This study investigates the impact of redox mediators （α-AQS， AQS， 1，5-AQDS and AQDS） on bioreduction of selenite by Shewanella oneidensis MR-1 and optimizes the bioreduction conditions with Shewanella oneidensis MR-1 and AQDS. The selenium particles obtained from cultures are analyzed using Zeta potential analyzer. The results suggest that all four tested redox mediators are able to accelerate the reduction of selenite by Shewanella oneidensis MR-1， and AQDS is the best. The optimum conditons are AQDS concentration of 0.2 mmol/L pH of 8.0 and temperature of 30 ℃. Selenite is completely removed after 48 h bioreduction by Shewanella oneidensis MR-1 with optimum conditons. Bigger size selenium nanoparticles （SeNPS） can be obtained with AQDS. AQDS may influence the composition and content of the organic layer covering around selenium nanoparticles （SeNPs）. This study could provide a foundation for particle application in selenite biodegradation.

Keywords：water pollution control engineering； Shewanella oneidensis MR-1； selenite； selenium nanoparticles； optimizing culture conditions； redox mediators

硒是一種人體必需的微量元素[1]，具有抗癌、抗氧化、抗衰老、增強機體免疫力等多種生物學功能[2]，缺硒可導致人體出現(xiàn)克山病、大骨節(jié)病、白內(nèi)障病及某些癌癥[3]。而硒攝入過量則會引起中毒[2，4]。在自然環(huán)境中，硒存在4種價態(tài)：+6，+4，0，-2，其中亞硒酸鹽（+4）和硒酸鹽（+6）對生物的毒性最大[5]。在水體中，硒污染的來源有2個方面：1）個別水體流經(jīng)含硒量高的地層，從而造成地下水或泉水硒的含量超標；2）煉油、精煉銅、硫酸制造、顏料染料及特種玻璃制造等工業(yè)生產(chǎn)過程產(chǎn)生的大量含硒廢水[6]。硒超標的水體中，硒主要是以硒酸根離子和亞硒酸根離子形式存在，通常以亞硒酸根離子形式更普遍[7]。

近些年來，發(fā)現(xiàn)有多種微生物能夠?qū)⒍拘暂^大的四價硒轉(zhuǎn)化成低毒的單質(zhì)硒。地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniforni）[8]、沼澤紅假單胞菌（Rhodopseudomonas palustris strain N）[9]、假單胞菌（Pseudomonas alcaliphila MBR）[10]、巨大芽孢桿菌（Bacillus megaterium）[11]、奧奈達希瓦氏菌（Shewanella oneidensis MR-1）[12]等，都能夠?qū)單猁}還原為單質(zhì)硒。單質(zhì)硒還可以有很多方面的應(yīng)用，可以應(yīng)用在納米醫(yī)學、納米傳感器和環(huán)境修復等方面[13]。但是，這些微生物還原過程普遍存在著還原時間較長的缺點。Shewanella oneidensis MR-1是一種廣泛分布的革蘭氏陰性γ-變形菌，是一種有著獨特呼吸模式的異化金屬還原微生物[12]，在細胞周質(zhì)內(nèi)以及細胞膜上有多種還原酶[14]，是一種兼性厭氧微生物，和嚴格厭氧微生物相比，對生長環(huán)境的要求不是很嚴格，在生物技術(shù)應(yīng)用方面更有優(yōu)勢[15]。

在受污染的沉積物、土壤和水體等環(huán)境中，腐殖質(zhì)可以作為氧化還原介體加速難降解有機物的厭氧生物轉(zhuǎn)化，這一過程起主要作用的活性基團是腐殖質(zhì)上的醌類結(jié)構(gòu)。由于天然腐殖質(zhì)結(jié)構(gòu)復雜，其氧化還原特性明顯受到來源的限制[16]。與之比較，結(jié)構(gòu)簡單的醌類化合物如蒽醌-2-磺酸鈉（AQS）、蒽醌-2，6-二磺酸鈉（AQDS）等催化作用明顯，而且用量不多。有報道稱，蒽醌類化合物能加速高氯酸鹽[17]、偶氮染料[16，18]、硝基芳香胺[19]和Cr（Ⅵ）、U（Ⅵ）[20]、Se（Ⅳ）、Te（Ⅳ）[21]等污染物的生物降解/轉(zhuǎn)化過程。但氧化還原介體加速亞硒酸鹽還原過程仍待深入地系統(tǒng)研究。

針對上述問題，本研究考察了4種水溶性醌類介體對于Shewanella oneidensis MR-1還原亞硒酸鹽的加速作用，并通過單因素試驗對介體加速Shewanella oneidensis MR-1還原亞硒酸鹽的培養(yǎng)條件進行了優(yōu)化，以期為微生物還原亞硒酸鹽過程普遍存在的時間較長的問題，提供有效的解決方法；為Shewanella oneidensis MR-1修復亞硒酸鹽污染的實際應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1試驗材料與方法

1.1試驗材料

1.1.1菌種來源

Shewanella oneidensis MR-1由中國海洋微生物菌種保藏管理中心（MCCC）代購（菌種保藏編號為ATCC 700550）。

1.1.2培養(yǎng)基成分

1）擴大培養(yǎng)基：酵母粉（5 g/L），胰蛋白胨（10 g/L），NaCl（10 g/L）。用1 mol/L的NaOH或HCl調(diào)節(jié)pH值至7.0，121 ℃滅菌20 min。

2）重金屬還原培養(yǎng)基：NaCl（5.85 g/L），HEPES鈉鹽（11.91 g/L），NH4Cl（1.498 g/L），KCl（0.097 g/L），NaH2PO4·2H2O（0.67 g/L），C3H5O3Na（2.241 2 g/L），微量元素（1 mL/L）。用1 mol/L的NaOH或HCl調(diào)節(jié)pH值，121 ℃滅菌20 min。

3）微量元素組成：氨三乙酸（1.5 g/L），MgSO4·7H2O（30 g/L），MnSO4·H2O（5 g/L），NaCl（10 g/L），F(xiàn)eSO4·7H2O（1 g/L），CaCl2·2H2O（1 g/L），CoCl2·6H2O（1 g/L），ZnCl2（1.3 g/L），CuSO4·5H2O（0.1 g/L），AlK（SO4）2·12H2O（0.1 g/L），H3BO3（0.1 g/L），Na2MoO4·2H2O（0.25 g/L），NiCl2·6H2O（0.25 g/L），Na2WO4·2H2O（0.25 g/L）。

4）試驗所選醌類氧化還原介體：蒽醌-1-磺酸鈉（α-AQS），蒽醌-2-磺酸鈉（AQS），蒽醌-1，5-二磺酸鈉（1，5-AQDS），蒽醌-2，6-二磺酸鈉（AQDS）。具體的物化性質(zhì)如表1所示。

1.2試驗方法

1.2.1Shewanella oneidensis MR-1的培養(yǎng)

在無菌條件下，將保存的Shewanella oneidensis MR-1菌液按5%（體積分數(shù)）的接種量接到盛有250 mL擴大培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中，置于搖床中（35 ℃，140 r/min）培養(yǎng)至對數(shù)后期。培養(yǎng)好的菌液經(jīng)過離心（10 000 r/min，10 min）轉(zhuǎn)接到重金屬還原培養(yǎng)基中，控制最終菌液OD600為0.5，待用。

1.2.2Shewanella oneidensis MR-1還原亞硒酸鹽

在3個體系（只有重金屬還原培養(yǎng)基、加入了滅活的Shewanella oneidensis MR-1的重金屬還原培養(yǎng)基、加入了Shewanella oneidensis MR-1的重金屬還原培養(yǎng)基）中分別加入0.5 mmol/L亞硒酸鈉（體系最終濃度），在重金屬還原培養(yǎng)基初始pH值為7.0，溫度為35 ℃條件下培養(yǎng)，每隔12 h取樣測量亞硒酸鈉剩余濃度。

1.2.3醌類氧化還原介體對Shewanella oneidensis MR-1還原亞硒酸鹽轉(zhuǎn)化率的影響

在分別加入α-AQS，AQS，1，5-AQDS和AQDS的4個體系（介體最終濃度為0.2 mmol/L）中，加入0.5 mmol/L的亞硒酸鈉（體系最終濃度），在重金屬還原培養(yǎng)基初始pH值為7.0，溫度為35 ℃條件下培養(yǎng)，每隔12 h取樣測量亞硒酸鈉剩余濃度，篩選出加速效果最好的一種氧化還原介體。

1.2.4AQDS濃度對Shewanella oneidensis MR-1還原亞硒酸鹽轉(zhuǎn)化率的影響

確定了最佳的氧化還原介體種類后，分別在300 mL血清瓶中加入不同濃度的該種介體，最終體系的介體濃度分別為0.1，0.2，0.3，0.4 mmol/L，加入0.5 mmol/L的亞硒酸鈉（體系最終濃度），在重金屬還原培養(yǎng)基初始pH值為7.0，溫度為35 ℃條件下培養(yǎng)，每隔12 h取樣測量亞硒酸鈉剩余濃度，確定氧化還原介體的最佳投加濃度。

1.2.5pH值對AQDS加速Shewanella oneidensis MR-1還原亞硒酸鹽轉(zhuǎn)化率的影響

分別配置初始pH值為6.0，7.0，8.0，9.0的重金屬還原培養(yǎng)基，分別在300 mL血清瓶中加入最佳濃度的最佳介體，加入0.5 mmol/L亞硒酸鈉（體系最終濃度），在溫度為35 ℃條件下培養(yǎng)，每隔12 h取樣測定體系中剩余亞硒酸鈉的濃度，確定重金屬還原培養(yǎng)基的最佳初始pH值。

1.2.6溫度對AQDS加速Shewanella oneidensis MR-1還原亞硒酸鹽轉(zhuǎn)化率的影響

分別在300 mL血清瓶中，加入最佳濃度的最佳介體，分別設(shè)置30，35，40，45 ℃等4個不同溫度，加入0.5 mmol/L亞硒酸鈉（體系最終濃度），重金屬還原培養(yǎng)基初始pH值調(diào)至最佳pH值，每隔12 h取樣測定體系中剩余亞硒酸鈉的濃度，確定最佳的培養(yǎng)溫度。

1.2.7亞硒酸鈉含量測定

亞硒酸鈉的質(zhì)量濃度采用ICP-MS進行測定。具體步驟如下：

1） 取3.0 mL的樣品于10mL的離心管中，在10 000 r/min的條件下離心10 min；

2） 取質(zhì)量為m1的離心上清液置于100 mL塑料瓶內(nèi)，用1% （質(zhì)量分數(shù)）HNO3稀釋至m2，記錄m1和m2的質(zhì)量（ICP-MS對硒的測量范圍為0～100 μg/L，體系中亞硒酸鈉最大質(zhì)量濃度為39.48 mg/L，樣品需要適當稀釋后再進行測量）；

3） 按照設(shè)定好的測量方法，用ICP-MS測量出稀釋后的樣品中亞硒酸鈉的質(zhì)量濃度c2；

4） 根據(jù)稀釋倍數(shù)，計算上清液中亞硒酸鈉的質(zhì)量濃度c1，從而得出體系中剩余亞硒酸鈉的質(zhì)量濃度。

體系中剩余亞硒酸鈉質(zhì)量濃度計算公式為

式中：m1和m2的單位為g；c1和c2的單位為μg/L。

1.2.8硒納米顆粒的提取與表征

取適量菌液，用細胞破碎儀（JY96-IIN，寧波新芝生物科技股份有限公司提供）破碎（4 min，功率為32%），經(jīng)過離心（9 740 r/min（10 000×g），30 min）后，棄去沉淀；把上清液離心（12 700 r/min（18 700×g），30 min），收集沉淀，再用超純水將沉淀重新懸浮并離心（12 700 r/min（18 700×g），30 min）3次；最后用超純水將沉淀重新懸浮，用Zeta電位分析儀（Nano ZS，英國馬爾文公司提供）測量硒納米顆粒表面電位及粒徑分布情況。

1.3數(shù)據(jù)處理與分析

亞硒酸鈉轉(zhuǎn)化率的計算公式為

式中，c0表示體系中亞硒酸鈉的初始質(zhì)量濃度，mg/L；c1表示體系中亞硒酸鈉的剩余質(zhì)量濃度，mg/L；亞硒酸鈉的轉(zhuǎn)化率均為質(zhì)量分數(shù)。

數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel 2010統(tǒng)計分析，文中圖由Origin 8.0軟件繪制。

2結(jié)果與討論

2.1Shewanella oneidensis MR-1還原亞硒酸鹽

在pH值為7.0、溫度為35 ℃的條件下，考察了重金屬還原培養(yǎng)基中化學成分對亞硒酸鹽濃度的影響以及Shewanella oneidensis MR-1菌體對亞硒酸鹽的吸附作用。

由圖1可知，亞硒酸鹽的濃度在重金屬還原培養(yǎng)基體系和滅活Shewanella oneidensis MR-1體系中幾乎沒有變化，而在接種了Shewanella oneidensis MR-1的體系中，隨著培養(yǎng)時間的延長，亞硒酸鹽的濃度逐漸降低，還原過程進行到84 h時轉(zhuǎn)化率為50%；說明亞硒酸鹽濃度的降低不是由于菌體的吸附作用以及重金屬還原培養(yǎng)基中的化學物質(zhì)和亞硒酸鹽發(fā)生化學反應(yīng)導致的，而是一個需要Shewanella oneidensis MR-1參與的生物還原過程。

本試驗中，Shewanella oneidensis MR-1展現(xiàn)出還原亞硒酸鹽為單質(zhì)硒的能力，經(jīng)過一段時間的還原后，重金屬還原培養(yǎng)基的顏色由乳白色變成紅色，紅色是單質(zhì)硒的特征顏色，表明有單質(zhì)硒生成，并且隨著培養(yǎng)時間的延長顏色逐漸加深。

2.2醌類氧化還原介體對Shewanella oneidensis MR-1還原亞硒酸鹽轉(zhuǎn)化率的影響

在pH值為 7.0、溫度為35 ℃的條件下，考察4種醌類氧化還原介體α-AQS，AQS，1，5-AQDS和AQDS對Shewanella oneidensis MR-1還原亞硒酸鹽過程的影響，結(jié)果如圖2所示。

由圖2可知，當Shewanella oneidensis MR-1還原亞硒酸鹽過程進行到84 h時，4種醌類介體α-AQS，AQS，1，5-AQDS和AQDS對Shewanella oneidensis MR-1還原亞硒酸鹽轉(zhuǎn)化率的加速效果不同，轉(zhuǎn)化率分別為25%，45%，40%和99%，與對照體系相比，亞硒酸鹽的轉(zhuǎn)化率分別提高了4%，24%，19%和78%；加速快慢順序依次為AQDS> AQS > 1，5-AQDS >α-AQS。類似的現(xiàn)象在其他研究中也有報道，ZHANG等[22]的研究也表明加入0.6 mmol/L的AQDS能夠加速Enterobacter taylorae對亞硒酸鹽的還原。HE等[23]的研究也表明加入0.15 mmol/L的AQDS可以加速Anaeromyxobacter dehalogenans對亞硒酸鹽的降解，轉(zhuǎn)化率提高了59%。PEARCE等[24]的研究也表明加入0.1 mmol/L的AQDS可以將亞硒酸鹽的還原速率提高2倍～5倍。但是，AQDS并不是對所有的微生物都能起到顯著的加速作用，WANG等[21]的研究表明，在大腸桿菌還原亞硒酸鹽的過程中加入AQDS和AQS，加速效果并不明顯，反而是指甲花醌很大程度上加速了還原過程。這種結(jié)果可能是由于微生物種類的不同，其亞硒酸鹽還原機理也存在差異，導致AQDS對某些微生物起的加速效果并不明顯。郭延凱等[25]的研究表明，5種結(jié)構(gòu)相似醌介體對酸性紅B生物脫色的催化效果依次為AQS>2，7-AQDS>AQDS>1，5-AQDS>α-AQS>空白組。

2.3AQDS濃度對Shewanella oneidensis MR-1還原亞硒酸鹽轉(zhuǎn)化率的影響

在pH值為7.0、溫度為35 ℃的條件下，考察AQDS濃度對Shewanella oneidensis MR-1還原亞硒酸鹽過程的影響。結(jié)果如圖3所示。

由圖3可知，當Shewanella oneidensis MR-1還原亞硒酸鹽過程進行到84 h時，在AQDS濃度分別為0.1，0.2，0.3和0.4 mmol/L條件下，AQDS對Shewanella oneidensis MR-1還原亞硒酸鹽的加速效果不同，轉(zhuǎn)化率分別為55%，99%，57%和53%。在培養(yǎng)到84 h時，隨著AQDS濃度的增加，亞硒酸鹽的轉(zhuǎn)化率先增加后減少，其中當AQDS濃度為0.2 mmol/L時，亞硒酸鹽的轉(zhuǎn)化率最高。雖然AQDS能夠顯著加快亞硒酸鹽的去除，但是當AQDS的濃度超出一定范圍時，加速效果明顯減弱。李海波等[26]的研究表明，當n（AQDS）≤0.32 mmol/L時，硝酸鹽氮的去除速率隨著AQDS濃度的增加而增加。WANG等[19]的研究表明，當指甲花醌的濃度從0.1 mmol/L增加到0.6 mmol/L時，亞硒酸鹽的轉(zhuǎn)化率隨著指甲花醌濃度的增加而增加，但是增加的程度逐漸減小；當指甲花醌濃度為0.4 mmol/L和0.6 mmol/L時，亞硒酸鹽轉(zhuǎn)化率基本相同。黃丹等[27]的研究表明，加入0.01 mmol/L AQDS時，苯酚降解速率為不加介體時的1.77倍，且隨著介體濃度的增加，對Shewanella sp. XB苯酚降解過程會產(chǎn)生一定的抑制。

2.4pH值對AQDS加速Shewanella oneidensis MR-1還原亞硒酸鹽轉(zhuǎn)化率的影響

在AQDS 濃度為0.2 mmol/L、溫度為35 ℃的條件下，考察pH值對AQDS加速Shewanella oneidensis MR-1還原亞硒酸鹽過程的影響。在受到亞硒酸鹽污染的環(huán)境中，微生物會面臨比模擬條件更復雜的外界環(huán)境，外界條件的改變會對亞硒酸鹽還原過程產(chǎn)生影響。研究pH值對AQDS加速Shewanella oneidensis MR-1還原亞硒酸鹽過程的影響具有實際指導意義。結(jié)果如圖4所示。

由圖4可知，pH值對Shewanella oneidensis MR-1還原亞硒酸鹽轉(zhuǎn)化率有很大的影響，當Shewanella oneidensis MR-1還原亞硒酸鹽過程進行到84 h時，在pH值分別為6.0，7.0，8.0和9.0條件下，AQDS對Shewanella oneidensis MR-1還原亞硒酸鹽的加速效果不同，轉(zhuǎn)化率分別為38%，67%，97%和7%。當pH值在6.0～9.0范圍內(nèi)時，隨著pH值的增加，亞硒酸鹽的轉(zhuǎn)化率先增加后減少；當pH值在7.0～8.0范圍內(nèi)時，Shewanella oneidensis MR-1還原亞硒酸鹽的轉(zhuǎn)化率較高，說明弱堿性條件更適合Shewanella oneidensis MR-1對亞硒酸鹽的還原。李丹等[9]的研究也表明，過高或過低的pH值都會降低光合細菌N菌株對于亞硒酸鹽的轉(zhuǎn)化率，中性條件更有利于N菌株還原亞硒酸鹽，這與N菌株的最適生長pH值一致。研究發(fā)現(xiàn)，當pH值在6～11之間時，Pseudomonas alcaliphila MBR均能進行生長和對亞硒酸鹽的還原，而pH值低于5或高于12時，菌體無法生長同時也失去對亞硒酸鹽的還原能力，該菌株適合在堿性環(huán)境下對亞硒酸鹽進行還原，這與該菌自身嗜堿的生理特性相一致[10]。

2.5溫度對AQDS加速Shewanella oneidensis MR-1還原亞硒酸鹽轉(zhuǎn)化率的影響

在AQDS濃度為0.2 mmol/L，pH 值為8.0的條件下，考察溫度對AQDS加速Shewanella oneidensis MR-1還原亞硒酸鹽過程的影響。在自然環(huán)境中，溫度會隨著季節(jié)和地區(qū)的不同而發(fā)生變化，研究溫度對AQDS加速Shewanella oneidensis MR-1還原亞硒酸鹽的影響具有實際指導意義。結(jié)果如圖5所示。

由圖5可知，當Shewanella oneidensis MR-1還原亞硒酸鹽過程進行到48 h時，在溫度分別為30，35，40和45 ℃的條件下，AQDS對Shewanella oneidesis MR-1還原亞硒酸鹽的加速效果不同，轉(zhuǎn)化率分別為100%，77%，32%和28%，在30～35 ℃范圍內(nèi)時，亞硒酸鹽都有較高的轉(zhuǎn)化率，轉(zhuǎn)化率在77%以上，30 ℃時轉(zhuǎn)化率最高，溫度是微生物的重要生存因子，在適宜的溫度范圍內(nèi)，溫度的升高會提高酶促反應(yīng)速率，微生物的代謝速率也會相應(yīng)提高[28]；劉金香等[29]的研究表明，與25 ℃條件下相比，在30 ℃條件下，由于環(huán)境溫度高，Shewanella oneidensis MR-1細菌活性較強，新陳代謝活動也較旺盛。當溫度超過35 ℃時，亞硒酸鹽的轉(zhuǎn)化率有較大的降低，這可能是由于高溫環(huán)境影響了Shewanella oneidensis MR-1還原亞硒酸鹽相關(guān)酶的活性，從而使亞硒酸鹽的轉(zhuǎn)化率降低。結(jié)果表明，AQDS加速Shewanella oneidensis MR-1還原亞硒酸鹽的最適溫度為30 ℃。

2.6硒納米顆粒表面Zeta電位及粒徑分布

在AQDS 濃度為0.2 mmol/L，pH值為8.0，溫度為30 ℃的條件下，考察AQDS對Shewanella oneidensis MR-1還原亞硒酸鹽過程中產(chǎn)生的硒納米顆粒表面Zeta電位的影響， 測量了生成的硒納米顆粒在不同的pH值條件下，Zeta電位的變化情況，結(jié)果如圖6所示。

如圖6所示，不加AQDS的體系中生成的硒納米顆粒，當pH值在3.0～4.5之間時，Zeta電位是正值，當pH值為4.5時，Zeta電位是0，當pH值為4.5～7.0之間時，Zeta電位是負值。加入AQDS的體系中生成的硒納米顆粒，當pH值在3.0～4.3之間時，Zeta電位是正值，當pH值為4.3時，Zeta電位是0，當pH值在4.3～7.0之間時，Zeta電位是負值。KHOEI等[30]的研究表明，生物合成的硒納米顆粒的Zeta電位值隨著pH值的變化而發(fā)生改變，當pH值為2.0～6.0之間時，Zeta電位是正的，當pH值為6.0時，Zeta電位是0，當pH值為6.0～10.0之間時，Zeta電位是負的。JAIN等[31]的研究表明，生物合成的硒納米顆粒表面包裹著一層胞外聚合物，它的成分包括糖類、蛋白質(zhì)、腐殖質(zhì)類似物等，控制著硒納米顆粒表面的電荷；從而通過靜電斥力的作用使硒納米顆粒保持穩(wěn)定[30]。本研究也得到了相似的結(jié)果，說明Shewanella oneidensis MR-1生成的硒納米顆粒表面同樣包裹著一層成分相似的物質(zhì)；但是，加入AQDS的體系中生成的硒納米顆粒表面的Zeta電位值和不加AQDS的體系中生成的硒納米顆粒表面的Zeta電位值存在差異，這可能是由于AQDS的加入，使硒納米顆粒表面包裹的有機物質(zhì)成分及含量發(fā)生變化導致的。LAMPIS等[5]的研究表明，生物合成的硒納米顆粒表面檢測到糖類、脂質(zhì)、蛋白質(zhì)等成分。這些生物分子或許在亞硒酸鹽的還原以及硒納米顆粒的生成過程中起到了重要作用[32]。

在AQDS 濃度為0.2 mmol/L，pH值為8.0，溫度為30 ℃的條件下，考察AQDS對Shewanella oneidensis MR-1還原亞硒酸鹽過程中產(chǎn)生的硒納米顆粒粒徑的影響，結(jié)果如圖7和表2所示。

由圖7和表2可知，不加AQDS的體系中生成的硒納米顆粒，當Shewanella oneidensis MR-1還原亞硒酸鈉過程進行到24 h時的粒徑分布范圍為80～920 nm，平均粒徑是205.7 nm， 當Shewanella oneidensis MR-1還原亞硒酸鈉過程進行到48 h時的粒徑分布范圍為80～3 800 nm，平均粒徑是227.4 nm；加AQDS的體系中生成的硒納米顆粒，當Shewanella oneidensis MR-1還原亞硒酸鈉過程進行到24 h時的粒徑分布范圍為96～1 300 nm，平均粒徑是276.6 nm，當Shewanella oneidensis MR-1還原亞硒酸鈉過程進行到48 h時的粒徑分布范圍為92～3 800 nm，平均粒徑是312.1 nm，隨著培養(yǎng)時間的延長，平均粒徑增大。LAMPIS等[5]的研究，檢測了培養(yǎng)到24 h和48 h時嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌（Stenotrophomonas maltophilia SeITE02）生成的硒納米顆粒的平均粒徑是160.6±62.2 nm和251.9±64.5 nm。

亞硒酸鹽在水中以離子形態(tài)存在，很容易進入到細胞內(nèi)。有研究表明，Shewanella oneidensis MR-1還原亞硒酸鹽主要是發(fā)生在細胞周質(zhì)內(nèi)[12]。LAMPIS等[5]的研究表明S.maltophilia SeITE02 存在一種釋放機制可以將早期在胞內(nèi)生成的小尺寸的硒納米顆粒轉(zhuǎn)移到胞外環(huán)境中。在相同的時刻，加入AQDS的體系，生成的硒納米顆粒粒徑更大一些，可能是由于AQDS的加速作用，在早期生成了更多小尺寸的硒單質(zhì)，再通過一種類似奧斯特瓦爾德成熟的過程[5，33]生長成為更大尺寸的硒納米顆粒。

2.7醌介體加速Shewanella oneidensis MR-1還原亞硒酸鹽機理探究

氧化還原介體能夠從Shewanella oneidensis MR-1的呼吸鏈中捕獲電子，加快電子向電子受體的傳遞[35-37]，在Shewanella oneidensis MR-1還原亞硒酸鹽的過程中，亞硒酸鹽作為電子受體，醌類氧化還原介體的加入加速電子從Shewanella oneidensis MR-1呼吸鏈向亞硒酸鹽的傳遞，并在相關(guān)酶的作用下，將亞硒酸鹽還原為單質(zhì)硒，從而提高了亞硒酸鹽的轉(zhuǎn)化率。4種醌類介體對Shewanella oneidensis MR-1還原亞硒酸鹽都具有加速效果，可能是由于4種介體都具有醌基，而醌基是腐殖質(zhì)加速微生物降解污染物的活性基團[38]。但是，4種醌類介體的加速效果不同，這可能是由于其化學結(jié)構(gòu)（取代基數(shù)量、位置等）[39]存在差異導致。AQDS濃度與Shewanella oneidensis MR-1利用之間存在對應(yīng)關(guān)系，當AQDS濃度超過Shewanella oneidensis MR-1能夠利用的范圍時，對微生物會造成損害[40-41]，亞硒酸鹽的轉(zhuǎn)化率會降低。pH值、溫度的改變會嚴重影響AQDS對Shewanella oneidensis MR-1還原亞硒酸鹽的加速效果，這可能是由于超出Shewanella oneidensis MR-1的最適pH值、溫度范圍時，新陳代謝速率降低，從而影響了電子在呼吸鏈中的傳遞。目前的研究表明，醌介體加速污染物生物降解主要存在2種方式，即直接生物還原和間接生物還原2種方式[42]，由此，推測醌介體催化強化希瓦氏菌還原亞硒酸鹽的還原機理，如圖8所示，具體的還原途徑有待進一步研究。

3結(jié)語

Shewanella oneidensis MR-1能將亞硒酸鹽還原，并產(chǎn)生硒納米顆粒。由于醌基的存在，4種醌類介體（α-AQS，AQS，1，5-AQDS和AQDS）都能夠加速Shewanella oneidensis MR-1對亞硒酸鹽的還原；由于化學結(jié)構(gòu)（取代基數(shù)量、位置等）存在差異導致加速效果不同，其中AQDS的加速效果最顯著。在不考慮各因子間交互作用的條件下，AQDS加速Shewanella oneidensis MR-1還原亞硒酸鹽的最適條件：pH值為8.0，溫度為30 ℃，AQDS濃度為0.2 mmol/L。AQDS會影響Shewanella oneidensis MR-1生成的硒納米顆粒的尺寸以及顆粒表面有機物質(zhì)的成分和含量。綜合以上結(jié)果及醌介體加速污染物生物降解主要方式，推測醌介體催化強化希瓦氏菌還原亞硒酸鹽的主要還原機理為直接生物還原和間接生物還原。本研究主要考察了水溶性醌介體對Shewanella oneidensis MR-1還原亞硒酸鹽過程的強化作用，然而水溶性介體在實際工程應(yīng)用中會出現(xiàn)流失，需多次投加，還有二次污染的問題，因此在后續(xù)研究中應(yīng)開展新型固定化氧化還原介體功能材料的研究，從而進一步拓寬本研究的應(yīng)用前景。

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