鄧蕙妍 李華平 陳荃 李潤祥 梁碧華 高愛莉 周欣 朱慧蘭

510095廣州市皮膚病防治所皮膚科

白藜蘆醇是具有較好防護(hù)作用的抗氧化劑［1］，其中核因子E2相關(guān)因子2（Nrf2）信號(hào)通路的激活是其發(fā)揮抗氧化作用的主要機(jī)制之一。紫檀芪是白藜蘆醇的衍生物，與白藜蘆醇相比，其生物利用度更高［2］，對(duì)Nrf2有較強(qiáng)的激活作用［3］。既往對(duì)紫檀芪抗氧化作用的研究集中在乳腺、心血管系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、血液系統(tǒng)、代謝系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)等，其主要作用表現(xiàn)為減少活性氧簇（ROS）生成、增加過氧化氫酶（CAT）、谷胱甘肽（GSH）、谷胱甘肽氧化酶（GPx）、超氧化物歧化酶（SOD）等表達(dá)［4?6］，而紫檀芪對(duì)皮膚作用的研究?jī)H限其抗癌作用［7］。紫檀芪能否作為紫外線防護(hù)劑，預(yù)防皮膚急性氧化損傷還未見報(bào)道。為探討紫檀芪對(duì)人永生化角質(zhì)形成細(xì)胞（HaCaT細(xì)胞）急性光損傷的保護(hù)作用，本研究探討紫檀芪干預(yù)前后經(jīng)中波紫外線（UVB）照射的HaCaT細(xì)胞損傷程度、Nrf2核轉(zhuǎn)位及下游抗氧化酶變化。

材料與方法

一、細(xì)胞、試劑和儀器

HaCaT細(xì)胞（廣州吉妮歐生物科技有限公司）。紫檀芪純合物（純度≥97%，美國Sigma公司），細(xì)胞活性檢測(cè)試劑盒（美國Promega公司），膜聯(lián)蛋白V-藻紅蛋白凋亡檢測(cè)試劑盒（美國BD Biosciences公司），核蛋白-胞質(zhì)蛋白提取液（美國Thermo Fisher Scientific公司），M?MLV反轉(zhuǎn)錄酶（美國Promega公司，M1705），GoTaq?qPCR Master Mix（美國Promega公司，A6002），一步法RNA提取試劑盒（Trizol，美國MRC公司，TR118?500），抗Nrf2抗體、生物素標(biāo)記抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素（武漢博士德生物工程有限公司）。ELISA檢測(cè)試劑盒（武漢華美生物工程有限公司），UVB燈管，波長范圍290～320 nm，峰值297 nm，功率40 W（北京電光源研究所）；Tanon電泳儀（上海天能科技有限公司）；基因擴(kuò)增儀（珠海黑馬醫(yī)學(xué)儀器有限公司）。

二、實(shí)驗(yàn)方法

1.HaCaT細(xì)胞急性光損傷模型構(gòu)建：參考本課題組前期研究結(jié)果［8］，使用57 mJ/cm2UVB，每次照射光源與細(xì)胞的垂直照射距離為15 cm，取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞在超凈臺(tái)內(nèi)照射，完成后換為培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)18 h。

2.篩選無毒性的紫檀芪濃度：HaCaT細(xì)胞隨機(jī)分為對(duì)照組、各濃度紫檀芪組（2.44、4.88、9.75、19.5、39、78和156 μmol/L），分組加好藥物后37 ℃培養(yǎng)24 h。加入MTS試劑，37℃孵育0.5 h后，酶標(biāo)儀檢測(cè)490 nm波長處吸光度（A值）。

細(xì)胞按上述分組處理24 h后，無乙二胺四乙酸（EDTA）胰酶消化并收集細(xì)胞，磷酸鹽緩沖液（PBS）清洗細(xì)胞2次。用1×結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞為1 × 106個(gè)/ml，取100 μl上述懸液至流式管中，分別加入膜聯(lián)蛋白V 5 μl和7氨基放線菌素D 5 μl，混勻，室溫避光孵育15 min，加入400 μl結(jié)合緩沖液混勻后1 h內(nèi)，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)HaCaT細(xì)胞凋亡和壞死率，即細(xì)胞早期凋亡率、晚期凋亡率和壞死率之和。

3.Western印跡法檢測(cè)HaCaT細(xì)胞內(nèi)Nrf2核轉(zhuǎn)位：HaCaT細(xì)胞隨機(jī)分為對(duì)照組、UVB組、紫檀芪組、紫檀芪+UVB組。對(duì)照組：正常培養(yǎng)，不做任何處理；UVB組：UVB照射（同實(shí)驗(yàn)方法1）；紫檀芪組：HaCaT細(xì)胞分別與2.44、4.88、9.75 μmol/L紫檀芪在37℃共培養(yǎng)24 h；紫檀芪+UVB組：HaCaT細(xì)胞分別與2.44、4.88、9.75 μmol/L紫檀芪在37 ℃共培養(yǎng)24 h后，接受UVB照射（同實(shí)驗(yàn)方法1）。吸去培養(yǎng)液，胰酶消化成細(xì)胞懸液，終止消化后600×g離心5 min。吸棄上清，加入胞質(zhì)蛋白提取液Ⅰ和胞質(zhì)蛋白提取液Ⅱ，經(jīng)劇烈振蕩和離心，上清液即為胞質(zhì)蛋白；剩下的沉淀加入預(yù)冷的胞核蛋白提取液，重復(fù)振蕩和冰上放置、離心，上清液即為胞核蛋白，收集細(xì)胞蛋白后，1∶500稀釋，用8%聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)胞核蛋白和胞質(zhì)蛋白，以3磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH，1∶5 000）和組蛋白H3（1∶2 000）作為內(nèi)參照，計(jì)算上述蛋白表達(dá)量，設(shè)定對(duì)照組的第一個(gè)值為1，其他組與其相比較得出上述蛋白表達(dá)的差異。

4.定量PCR檢測(cè)CAT和SOD mRNA表達(dá)水平：按照“二、3”中方法分組處理HaCaT細(xì)胞后，Trizol提取總RNA后，以M?MLV反轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，隨后采用GoTaq?qPCR Master Mix進(jìn)行qPCR反應(yīng)。qPCR引物序列見表1。以β肌動(dòng)蛋白為內(nèi)參，根據(jù)2?△△Ct計(jì)算CAT和SOD mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

5.ELISA檢測(cè)CAT和SOD活性：將HaCaT細(xì)胞按實(shí)驗(yàn)方法3分組處理，收集上清液，按照ELISA檢測(cè)試劑盒操作說明檢測(cè)CAT和SOD活性。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，計(jì)量資料用±s表示。無毒性紫檀芪濃度的確定實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用單因素方差分析，兩兩多重比較采用LSD法。紫檀芪及UVB照射對(duì)HaCaT細(xì)胞胞質(zhì)與胞核中Nrf2表達(dá)、CAT和SOD mRNA表達(dá)及活性的影響實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用析因設(shè)計(jì)的方差分析，多重比較采用Tukey法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 qPCR引物序列

結(jié) 果

一、紫檀芪濃度的確定

0、2.44、4.88、9.75、19.5、39、78和156 μmol/L紫檀芪處理HaCaT細(xì)胞24 h后，HaCaT細(xì)胞增殖活性（A值）分別是1.442±0.004、1.437±0.002、1.428±0.002、1.415 ± 0.005、1.357 ± 0.002、1.263 ± 0.006、1.071±0.029、0.885±0.002。各組間HaCaT細(xì)胞增殖活性差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=1 497.661，P＜0.01）。兩兩多重比較顯示，2.44和4.88 μmol/L紫檀芪組細(xì)胞增殖活性與對(duì)照組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.512、0.061），而9.75、19.5、39、78、156 μmol/L紫檀芪組細(xì)胞增殖活性顯著低于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.44、4.88、9.75、19.5、39、78和156 μmol/L紫檀芪組HaCaT細(xì)胞凋亡與壞死率分別為3.53%±0.12%、4.58% ±0.52%、8.06% ±0.97%、8.97% ±0.68%、9.70%±1.04%、14.53%±1.13%和19.75%±0.97%，各組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=3912.3，P＜0.001），且隨紫檀芪濃度增加，HaCaT細(xì)胞凋亡與壞死率逐漸增加。與對(duì)照組相比，紫檀芪濃度低于9.75 μmol/L時(shí)，細(xì)胞凋亡與壞死率變化不明顯（P＞0.05）；濃度為9.75 μmol/L時(shí)，凋亡與壞死率開始出現(xiàn)輕微變化（P=0.05）。

結(jié)合細(xì)胞增殖和凋亡結(jié)果，紫檀芪濃度≤9.75 μmol/L時(shí)，對(duì)HaCaT細(xì)胞沒有損傷。因此，確定下一步實(shí)驗(yàn)中紫檀芪濃度為2.44、4.88和9.75μmol/L。

二、HaCaT細(xì)胞內(nèi)Nrf2核轉(zhuǎn)位情況

見圖1、表2。析因分析顯示，紫檀芪對(duì)HaCaT細(xì)胞內(nèi)Nrf2胞質(zhì)和胞核蛋白的作用受UVB影響（胞質(zhì)蛋白交互作用F=7.408，P=0.02，胞核蛋白交互作用F=16.148，P＜ 0.001）。Tukey檢驗(yàn)顯示，2.44、4.88和9.75 μmol/L紫檀芪組與對(duì)照組相比，Nrf2胞質(zhì)蛋白（q分別為0.06、0.52、3.07，P＞ 0.05）和胞核蛋白（q分別為0.24、3.02、4.76，P＞ 0.05）無明顯變化；UVB組與對(duì)照組相比，Nrf2胞質(zhì)蛋白無明顯變化（q=1.86，P＞0.05），而Nrf2胞核蛋白顯著增加（q=17.24，P＜ 0.01）。

2.44、4.88和9.75 μmol/L紫檀芪 +UVB組與對(duì)照組相比，Nrf2胞質(zhì)蛋白濃度均顯著下降（q分別為6.96、6.90、9.92，均P＜ 0.05），胞核蛋白濃度則顯著升高（q分別為31.85、36.30、24.46，均P＜ 0.01）；與UVB組相比，Nrf2胞質(zhì)蛋白濃度均顯著下降（q分別為5.329、5.069、12.30，均P＜ 0.05），胞核蛋白濃度則顯著升高（q分別為14.61、19.06、7.23，均P＜ 0.01）。

圖1 不同濃度紫檀芪及UVB作用HaCaT細(xì)胞后胞質(zhì)Nrf2蛋白、胞核Nrf2蛋白濃度變化 1：對(duì)照組；2～4：2.44、4.88、9.75 μmol/L紫檀芪組；5：UVB組；6～ 8：2.44、4.88、9.75 μmol/L紫檀芪 +UVB組

表2 不同濃度紫檀芪及UVB作用HaCaT細(xì)胞后胞質(zhì)和胞核Nrf2蛋白相對(duì)表達(dá)水平（±s）

表2 不同濃度紫檀芪及UVB作用HaCaT細(xì)胞后胞質(zhì)和胞核Nrf2蛋白相對(duì)表達(dá)水平（±s）

注：n=3

分組對(duì)照組2.44 μmol/L紫檀芪組4.88 μmol/L紫檀芪組9.75 μmol/L紫檀芪組UVB組UVB+2.44 μmol/L紫檀芪組UVB+4.88 μmol/L紫檀芪組UVB+9.75 μmol/L紫檀芪組胞質(zhì)內(nèi)Nrf2 1.03±0.08 1.03±0.09 1.06±0.09 1.01±0.07 1.14±0.11 0.86±0.10 0.87±0.11 0.46±0.11胞核內(nèi)Nrf2 1.04±0.11 1.12±0.13 1.24±0.07 1.37±0.10 1.77±0.08 2.38±0.11 2.57±0.11 2.07±0.13

三、HaCaT細(xì)胞內(nèi)CAT、SOD mRNA表達(dá)

見圖2。qPCR顯示，UVB照射會(huì)降低HaCaT細(xì)胞內(nèi)CAT mRNA表達(dá)（F=276.569，P＜0.001），但不會(huì)降低SOD mRNA表達(dá)（F=1.923，P＞0.05），不同濃度紫檀芪亦會(huì)影響CAT、SOD mRNA表達(dá)（CAT：F=6.63，P=0.004；SOD：F=16.82，P＜ 0.001），且受UVB的影響（CAT交互作用F=3.78，P=0.032；SOD交互作用F=10.63，P＜0.001）。

如圖2顯示，UVB組CAT表達(dá)顯著低于對(duì)照組（P＜0.05），而SOD表達(dá)無明顯變化（P＞0.05）。各濃度紫檀芪組與對(duì)照組相比，CAT和SOD的表達(dá)均無明顯變化（P＞0.05）。各濃度紫檀芪+UVB組與對(duì)照組相比，CAT表達(dá)顯著下調(diào)（P＜0.05），SOD表達(dá)顯著上調(diào)（P＜0.05）；與UVB組相比，CAT和SOD的表達(dá)均明顯上調(diào)（P＜0.05）。不同濃度紫檀芪組間CAT、SOD mRNA的表達(dá)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖2 不同濃度紫檀芪和（或）UVB處理HaCaT細(xì)胞后過氧化氫酶（CAT）和超氧化物歧化酶（SOD）mRNA表達(dá) 1：對(duì)照組；2：UVB組；3 ～ 5：2.44、4.88、9.75 μmol/L紫檀芪組；6 ～ 8：2.44、4.88、9.75 μmol/L紫檀芪+UVB組。與未接受UVB照射及紫檀芪處理的對(duì)照組相比，a：P ＜ 0.001，b：P ＜ 0.05，c：P ＜ 0.01

圖3 不同濃度紫檀芪和（或）UVB處理HaCaT細(xì)胞后過氧化氫酶（CAT）和超氧化物歧化酶（SOD）活性變化 1：對(duì)照組；2：UVB組；3 ～ 5：2.44、4.88、9.75 μmol/L紫檀芪組；6 ～ 8：2.44、4.88、9.75 μmol/L紫檀芪+UVB組。與未受UVB照射及紫檀芪處理的對(duì)照組相比，a：P ＜ 0.01，b：P ＜ 0.05；與UVB組相比，c：P ＜ 0.05，d：P ＜0.01

四、CAT和SOD活性檢測(cè)結(jié)果

見圖3。UVB照射可顯著降低HaCaT細(xì)胞內(nèi)CAT和SOD活性（CAT：F=161.565，P＜ 0.001；SOD：F=1 766.747，P＜0.001），不同濃度紫檀芪亦可顯著影響CAT和SOD活性（CAT：F=8.277，P=0.001；SOD：F=7.83，P=0.002），紫檀芪對(duì)細(xì)胞內(nèi)CAT、SOD活性的作用受UVB的影響（CAT交互作用F=5.161，P=0.011；SOD交互作用F=10.219，P=0.001）。

如圖3顯示，UVB組與對(duì)照組相比，CAT和SOD活性均顯著下調(diào)（P＜0.05）。各濃度紫檀芪組與對(duì)照組相比，CAT和SOD活性均無明顯變化（P＞0.05），且不同濃度紫檀芪組間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。各濃度紫檀芪+UVB組與對(duì)照組相比，CAT和SOD的表達(dá)均顯著下調(diào)（P＜0.05），與UVB組相比則有明顯上升（P＜0.05）。

討 論

紫外線分為長波紫外線、UVB和短波紫外線，短波紫外線在經(jīng)過地球表面臭氧層時(shí)被過濾掉，對(duì)皮膚無影響，UVB主要作用于表皮，長波紫外線穿透深度大于UVB，主要作用于真皮和真皮下層。HaCaT細(xì)胞作為表皮的主要成分，受UVB影響較大。研究表明［9］，UVB引起皮膚光損傷的機(jī)制復(fù)雜，其中，氧化應(yīng)激損傷是造成皮膚紅斑、水腫等急性炎癥反應(yīng)的重要原因。面對(duì)氧化應(yīng)激損傷，人類皮膚配備完善的自身抗氧化防御機(jī)制，其中最為重要的是調(diào)控抗氧化物酶和Ⅱ相解毒酶，如GSH、CAT、SOD及血紅素加氧酶1（HO?1）等基因表達(dá)的Nrf2［10］。生理?xiàng)l件下，Nrf2 在胞質(zhì)中與胞質(zhì)蛋白Kelch樣ECH聯(lián)合蛋白1（Keap1）結(jié)合后被蛋白酶水解；氧化應(yīng)激條件下，Nrf2從Keap1上解離，從胞質(zhì)進(jìn)入胞核與小分子蛋白Maf識(shí)別元件（MARE）位點(diǎn)結(jié)合，形成異二聚體并與ARE結(jié)合，調(diào)控下游抗氧化物酶和Ⅱ相解毒酶基因的轉(zhuǎn)錄，重新維持細(xì)胞內(nèi)氧化還原水平［11］。本研究及前期研究［12］均發(fā)現(xiàn)，在沒有添加抗氧化劑的情況下，UVB照射可使胞核Nrf2蛋白有所增加，但Nrf2胞質(zhì)蛋白的含量沒有明顯變化，提示無Nrf2核轉(zhuǎn)位，表明UVB照射引起HaCaT細(xì)胞急性損傷時(shí)，細(xì)胞內(nèi)Nrf2通路不能自行啟動(dòng)，無法起到抗氧化作用。

既往研究表明，CAT可催化細(xì)胞內(nèi)過氧化氫分解，防止氧化損傷。SOD是生物體內(nèi)清除自由基的首要物質(zhì)［4］。結(jié)合我們的實(shí)驗(yàn)可知，UVB照射可抑制細(xì)胞內(nèi)CAT和SOD的表達(dá)和活性，影響細(xì)胞的抗氧化活性，引起細(xì)胞光損傷。在HaCaT細(xì)胞中預(yù)先添加紫檀芪，再經(jīng)一定劑量的UVB照射，HaCaT細(xì)胞內(nèi)發(fā)生Nrf2核轉(zhuǎn)位，Nrf2調(diào)控的CAT和SOD表達(dá)上調(diào)，活性增加，證明紫檀芪可通過激活細(xì)胞內(nèi)Nrf2通路，上調(diào)下游CAT和SOD表達(dá)，激活其抗氧化活性，起到防御細(xì)胞氧化損傷的作用。但是，SOD活性增加幅度較小，是否意味著與CAT相比，紫檀芪對(duì)SOD活性的影響較小？推測(cè)紫檀芪的作用主要是通過CAT催化過氧化氫分解，防止氧化損傷，而非通過SOD清除自由基。但這一推斷還需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。本課題組還發(fā)現(xiàn)另一種天然植物抗氧化劑茶多酚在促進(jìn)Nrf2 mRNA和核蛋白的表達(dá)及分布的同時(shí)，可抑制核轉(zhuǎn)錄因子Bach1核蛋白的表達(dá)及分布［13］。因此，紫檀芪激活Nrf2通路是否也與抑制Bach1相關(guān)，除此通路以外是否還有其他機(jī)制參與其中，均需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)探討。

參考文獻(xiàn)

［1］鄭雯,曾維惠,易清玲,等.白藜蘆醇對(duì)UVB照射的人皮膚成纖維細(xì)胞MMP?1水平及細(xì)胞凋亡的影響［J］.中國皮膚性病學(xué)雜志,2012,26（4）:296?299.

［2］Zhang Y,Shang Z,Gao C,et al.Nanoemulsion for solubilization,stabilization,andin vitrorelease of pterostilbene for oral delivery［J］.AAPS PharmSciTech,2014,15（4）:1000?1008.doi:10.1208/s12249?014?0129?4.

［3］Ramkumar KM,Sekar TV,Foygel K,et al.Reporter protein complementation imagingassay toscreen and study Nrf2 activators in cells and living animals［J］.Anal Chem,2013,85（15）:7542?7549.doi:10.1021/ac401569j.

［4］McCormack D,McFadden D.A review of pterostilbene antioxidant activity and disease modification［J］.Oxid Med Cell Longev,2013,2013:575482.doi:10.1155/2013/575482.

［5］Naik B,Nirwane A,Majumdar A.Pterostilbene ameliorates intra?cerebroventricular streptozotocin induced memory decline in rats［J］.Cogn Neurodyn,2017,11（1）:35?49.doi:10.1007/s11571?016?9413?1.

［6］Sireesh D,Ganesh MR,Dhamodharan U,et al.Role of ptero?stilbene in attenuating immune mediated devastation of pan?creatic beta cells via Nrf2 signaling cascade［J］.J Nutr Biochem,2017,44:11?21.doi:10.1016/j.jnutbio.2017.02.015.

［7］Cichocki M,Paluszczak J,Szaefer H,et al.Pterostilbene is equally potent as resveratrol in inhibiting 12?O?tetradecanoylphorbol?13?acetate activated NFkappaB,AP?1,COX?2,and iNOS in mouse epidermis［J］.Mol Nutr Food Res,2008,52 Suppl 1:S62?70.doi:10.1002/mnfr.200700466.

［8］鄧蕙妍,肖峰,高愛莉,等.人表皮角質(zhì)形成細(xì)胞急性光損傷模型的構(gòu)建［J］.新醫(yī)學(xué),2013,44（8）:556?559.doi:10.3969/g.issn.0253?9802.2013.08.012.

［9］Valencia A,Kochevar IE.Nox1?based NADPH oxidase is the major source of UVA?induced reactive oxygen species in human keratinocytes［J］.J Invest Dermatol,2008,128（1）:214 ?222.doi:10.1038/sj.jid.5700960.

［10］Tkachev VO,Menshchikova EB,Zenkov NK.Mechanism of the Nrf2/Keap1/ARE signaling system［J］.Biochemistry （Mosc）,2011,76（4）:407?422.doi:10.1134/S0006297911040031.

［11］Keum YS,Choi BY.Molecular and chemical regulation of the Keap1?Nrf2 signaling pathway［J］.Molecules,2014,19（7）:10074?10089.doi:10.3390/molecules190710074.

［12］鄧蕙妍,高愛莉,李振潔,等.姜黃素對(duì)紫外線照射后HaCaT細(xì)胞內(nèi)Nrf2核轉(zhuǎn)位的激活作用［J］.中國麻風(fēng)皮膚病雜志,2014,（7）:390?393.

［13］梁碧華,劉清,江娜,等.茶多酚對(duì)人皮膚成纖維細(xì)胞Nrf2/Bach1mRNA及核蛋白的影響［J］.中華皮膚科雜志,2017,50（3）:199?203.doi:10.3760/cma.j.issn.0412?4030.2017.03.011.